葛根素調節PINK1/parkin信號通路對橫紋肌溶解致大鼠急性腎損傷的影響*

耿永芝 李國偉 劉曉豆 韓磊 孫建利 檀立端

(承德市中心醫院急診科,河北 承德 067000)

橫紋肌溶解癥是一種嚴重的綜合征,由骨骼肌損傷后受損肌肉細胞釋放到體循環中的分解產物引起各種病理狀況,如擠壓傷、感染、肌病和肌肉萎縮癥、毒素和某些藥物都會導致橫紋肌溶解[1-2]。急性腎損傷是橫紋肌溶解癥的主要并發癥之一,大約10%～50%的橫紋肌溶解癥患者會出現急性腎損傷[3]。線粒體自噬對于維持細胞穩態和確保健康的線粒體十分重要,PTEN誘導激酶1/帕金森病相關基因(PINK1/parkin)途徑是線粒體自噬的主要調節劑,已在多種疾病模型中進行了研究[4]。Liu等[5]研究發現槲皮素可通過激活沉默信息調節因子1(SIRT1)/PINK1/Parkin介導的線粒體自噬緩解腎纖維化和腎損傷。基于此,研究橫紋肌溶解導致的急性腎損傷中線粒體自噬,對該疾病的治療有重要意義。葛根素是從葛根中提取的異黃酮類化合物,具有多種生理功能。最近也有報道葛根素可治療腎損傷相關疾病[6-7]。另有研究表明葛根素可通過增加自噬通量,LC3-II和p62表達激活自噬緩解鉛誘導的腎臟損傷[8]。但葛根素是否可緩解橫紋肌溶解誘導的急性腎損傷以及是否可通過線粒體自噬發揮作用鮮有報道。本研究通過建立橫紋肌溶解誘導的急性腎損傷大鼠模型,旨在研究葛根素對橫紋肌溶解誘導的急性腎損傷大鼠的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只SPF級成年雄性SD大鼠,體重180～220 g,購自中國科學院動物研究所[許可證號:SYXK(京)2021-0063]。將大鼠飼養在溫度21～25 ℃、濕度45%～55%以及12 h光/暗循環的動物房中適應性喂養7 d。大鼠自由飲水,定時喂食。本研究已獲得本院實驗動物倫理委員會批準(審批號:2021-0375)。

1.2 主要試劑與儀器 葛根素(K901177)購自上海雅吉生物科技有限公司;3-MA(HY-19312)購自MCE公司;活性氧(ROS)(E004-1-1)、谷胱甘肽(GSH)(A006-1-1)、丙二醛(MDA)(A003-2-2)、超氧化物歧化酶(SOD)(A001-3-2)和過氧化氫酶(CAT)(A007-1-1)試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所;大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(E-EL-R2856c)、大鼠白介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒(E-EL-R0012c)、大鼠白介素6(IL-6)ELISA試劑盒(E-EL-R0015c)購自伊萊瑞特公司;抗體LC3 I/II(ab128025)、PINK1(ab216144)、parkin(ab77924)、GAPDH(ab8245)購自abcam公司。DW-86L416G-80 ℃冰箱購自海爾集團公司;JEM-2100透射電鏡購自日本電子株式會社;SpectraMax iD3多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司;SP8共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司;GBA-1000自動生化分析儀購自深圳市國賽生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組給藥 動物適應性喂養后,將大鼠分為正常組、模型組[9](50%甘油10 mL/kg)、葛根素低劑量組[7](葛根素50 mg/kg)、葛根素中劑量組(葛根素100 mg/kg)、葛根素高劑量組(葛根素200 mg/kg)、3-MA組[10](腹腔注射3-MA 15 mg/kg),每組10只。正常組和模型組動物灌胃相應劑量生理鹽水,各給藥組灌胃相應劑量葛根素,3-MA組在給藥前1 h腹腔注射相應劑量3-MA,其余組腹腔注射相應劑量生理鹽水,連續給藥7 d。第7天所有大鼠禁水禁食24 h后,除正常組外其余各組大鼠在雙側后肢肌肉一次性注射50%甘油10 mL/kg,正常組注射相應劑量生理鹽水,處理后將所有大鼠放入代謝籠中,恢復飲食飲水,收集大鼠24 h尿液。注射甘油24 h后,所有大鼠使用100 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉,腹主動脈取血,并取出大鼠腎臟組織。所有大鼠左腎組織保存在-80 ℃冰箱中進一步分析,隨機取各組5只大鼠右腎組織固定在4%多聚甲醛中,另5只大鼠右腎固定在2.5%戊二醛進行透射電鏡觀察。

1.3.2 血清生化分析 各組大鼠動脈血在4 ℃冰箱中靜置2 h后,以3 500 r/min,4 ℃下離心10 min,收集血清并儲存在-80 ℃進一步分析。自動生化分析儀測量各組大鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)和肌酐磷酸激酶 (CK)水平。

1.3.3 ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平 使用ELISA試劑盒,根據試劑盒說明書檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.3.4 HE染色觀察腎組織病理 取各組5只保存在4%多聚甲醛中的大鼠腎臟組織,不同梯度乙醇脫水,然后在二甲苯中浸泡,最后使用石蠟包埋。用切片機取4 μm厚的切片使用HE染色,光學顯微鏡下觀察。組織學切片根據腎小管間質損傷、空泡化、刷狀邊緣消失、小管擴張和壞死進行評估(0分:無損傷;1分:0<損傷≤10%;2分:10%<損傷≤25%;3分:25%<損傷≤45%;4分:45%<損傷≤75%;5分:損傷>75%)。

1.3.5 試劑盒法測量大鼠腎臟組織SOD、GSH、MDA水平 取各組5只大鼠冰凍腎臟組織制備10%勻漿,并在4 ℃下3 000 r/min離心15 min,得到上清液。使用相應試劑盒檢測腎臟組織中GSH、MDA、SOD的水平,實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.6 化學熒光法檢測大鼠腎臟組織ROS水平 取1.3.5實驗方法剩余各組大鼠腎臟組織勻漿液,離心后得上清液,加入DCFH-DA工作液混勻,37 ℃孵育30 min,使用熒光酶標儀檢測在激發波長488 nm、發射波長525 nm下檢測熒光強度。

1.3.7 透射電子顯微鏡觀察 將固定在2.5%戊二醛中2 h的5只大鼠腎臟組織經漂洗后再使用1%鋨酸固定2 h,漂洗后乙醇脫水、經丙酮浸透后37 ℃包埋在環氧樹脂中12 h切成薄片,5%乙酸鈾和檸檬酸鉛染色,透射電鏡觀察攝片。

1.3.8 免疫熒光法檢測腎臟組織LC3和線粒體的共定位 石蠟包埋的剩余大鼠腎臟組織,經脫蠟、抗原修復后加入一抗LC3和COX4在4 ℃孵育過夜,并與各自二抗37 ℃孵育1 h后,使用康淬滅封片劑封片,最后使用共聚焦顯微鏡觀察拍照,Image軟件進行分析。

1.3.9 Western Blot檢測 各組剩余5只大鼠冰凍的腎臟組織,使用RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法檢測蛋白質濃度。使用10% SDS-PAGE分離蛋白質,并轉移到PVDF膜上,在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h,將膜與LC3 II/ I、PINK1、parkin、GAPDH抗體在 4 ℃孵育過夜后與HRP偶聯的二抗在室溫下孵育2 h。最后,將膜與增強型化學發光(ECL)試劑一起孵育顯色,并使用Image J軟件量化蛋白灰度值。GAPDH作為內參。

2 結果

2.1 葛根素對大鼠血清SCr、BUN、CK的影響 與正常組相比,模型組大鼠血清SCr、BUN、CK水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,葛根素低、中、高劑量組大鼠血清SCr、BUN、CK水平顯著降低(P<0.05);與葛根素高劑量組相比,3-MA組大鼠血清SCr、BUN、CK水平顯著升高(P<0.05),見表1。

表1 葛根素對大鼠血清SCr、BUN、CK的影響

2.2 葛根素對大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 與正常組相比,模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,葛根素低、中、高劑量組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05);與葛根素高劑量組相比,3-MA組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05),見表2。

表2 葛根素對大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6的影響

2.3 葛根素對大鼠腎臟組織病理學的影響 病理學顯示對照組大鼠腎臟組織結構完整,模型組大鼠腎臟組織可見明顯腎小球、腎小管擴張,出現空泡化、間質水腫以及炎性細胞浸潤,葛根素低、中、高劑量組減輕大鼠腎臟組織病理學損傷;但是較葛根素高劑量組相比,3-MA組大鼠腎臟組織損傷進一步加重。病理學損傷評分結果顯示,與正常組相比,模型組大鼠腎臟病理學損傷評分顯著升高(P<0.05);與模型組相比,葛根素低、中、高劑量組大鼠腎臟病理學損傷評分顯著降低(P<0.05);與葛根素高劑量組相比,3-MA組大鼠腎臟病理學損傷評分顯著升高(P<0.05),見圖1、表3。

圖1 葛根組對大鼠腎臟組織病理學的影響(400×)

表3 葛根素對大鼠腎臟病理學損傷評分的影響

2.4 葛根素對大鼠腎臟組織SOD、GSH、MDA、ROS水平的影響 與正常組相比,模型組大鼠腎臟MDA、ROS水平顯著升高,SOD、GSH水平降低(P<0.05);與模型組相比,葛根素低、中、高劑量組大鼠腎臟MDA、ROS水平顯著降低,SOD、GSH水平升高(P<0.05);與葛根素高劑量組相比,3-MA組大鼠腎臟MDA、ROS水平顯著升高,SOD、GSH水平降低(P<0.05),見圖2、表4。

圖2 葛根素對大鼠腎臟組織ROS水平的影響(200×)

表4 葛根素對大鼠腎臟組織SOD、GSH、MDA、ROS水平的影響

2.5 葛根素對大鼠腎臟組織線粒體和自噬小體的影響 正常組大鼠細胞線粒體表現出正常的形態,有清晰可辨的嵴;與正常組相比,模型組大鼠可觀察到明顯的線粒體腫脹,線粒體脊紊亂、斷裂或消失,伴有明顯的空泡變性,并有自噬小體形成,然而葛根素低、中、高劑量組大鼠線粒體損傷明顯減輕,自噬小體數量顯著增加;與葛根素高劑量組大鼠相比,3-MA組大鼠線粒體損傷加重,自噬小體很少,見圖3。

圖3 葛根素對大鼠腎臟組織線粒體和自噬小體的影響(10000×)

2.6 葛根素對大鼠腎臟組織LC3和線粒體共定位的影響 與正常組相比,模型組大鼠腎臟組織可見LC3標記的自噬小體與COX4標記的線粒體共定位信號;與模型組相比,葛根素低、中、高劑量組大鼠腎臟組織LC3標記的自噬小體與COX4標記的線粒體共定位信號明顯增多;與葛根素高劑量組大鼠相比,3-MA組大鼠LC3標記的自噬小體與COX4標記的線粒體共定位信號明顯降低,見圖4。

圖4 葛根素對大鼠腎臟組織LC3和線粒體共定位的影響(200×)

2.7 葛根素對大鼠腎臟組織LC3 II/I、PINK1、parkin表達的影響 與正常組相比,模型組大鼠腎臟組織LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表達升高(P<0.05);與模型組相比,葛根素低、中、高劑量組大鼠腎臟組織LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表達進一步升高(P<0.05);與葛根素高劑量組大鼠相比,3-MA組大鼠腎臟組織LC3 II/LC3 I、PINK1、parkin蛋白表達降低(P<0.05),見圖5、表5。

圖5 葛根素對大鼠腎臟組織LC3 II/I、PINK1、parkin表達的影響

表5 葛根素對大鼠腎臟組織LC3 II/ I、PINK1、parkin表達的影響

3 討論

橫紋肌溶解癥是一種以骨骼肌分解和肌肉細胞內容物如電解質、肌紅蛋白和其他肌質蛋白滲漏進入體循環的綜合征,急性腎損傷是橫紋肌溶解癥的常見嚴重并發癥,如果發生急性腎損傷,預后會大大惡化,死亡率升高[11-12]。另外,肌紅蛋白游離對腎小管有毒,引起腎小管壞死和梗阻,導致腎血管收縮、腎結構損傷以及氧化應激,這些現象均是橫紋肌溶解誘導的急性腎損傷特征[13]。在本研究中,通過向大鼠肌肉注射甘油誘發了急性腎損傷。肌肉注射甘油會造成廣泛的骨骼肌損傷,并使肌紅蛋白釋放到血液循環中,誘導橫紋肌溶解癥進而導致氧化因子、炎癥以及腎血管收縮發生引起急性腎損傷[3]。葛根素是從葛根中提取的異黃酮類化合物,近期研究發現葛根素可用于治療腎損傷疾病,作用機制包括調節細胞自噬和凋亡以及抗炎等生理過程[14-15]。本研究結果發現,經大鼠雙側后肢肌肉一次性注射50%甘油10 mL/kg后,大鼠血清SCr、BUN、CK、TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高,腎臟組織可見明顯腎小球、腎小管擴張,出現空泡化、間質水腫以及炎性細胞浸潤,腎臟MDA、ROS水平顯著升高,SOD、GSH水平降低,通過葛根素灌胃給藥后,明顯抑制橫紋肌溶解對大鼠的腎損傷以及抑制炎癥因子和氧化應激的發生。

線粒體自噬作為一種進化上保守的細胞過程,通過清除功能失調的線粒體以及防止ROS過度積累,在維持線粒體自身穩態方面起著重要作用[16-17]。線粒體自噬在急性腎損傷期間線粒體質量控制,腎小管細胞存活和腎功能中起著關鍵作用[18]。PINK1/Parkin介導的線粒體自噬是目前哺乳動物細胞中最成熟的線粒體自噬形式[19]。PINK1是一種重要的線粒體自噬調節劑,當在靜止狀態下時,PINK1被結構化地輸入到線粒體中,并被迅速裂解和降解,當線粒體受損時,PINK1導入后的降解被破壞,使得PINK1在線粒體外膜上聚集并進一步募集Parkin,Parkin將線粒體泛素化,并將與泛素化結合的自噬受體招募到線粒體上,最后,通過與LC3直接相互作用招募自噬體,進一步通過線粒體自噬機制降解受損線粒體[20-21]。研究表明,在急性腎損傷病理條件下,腎小管可能會激活線粒體自噬的多種途徑,其中PINK1/Parkin介導的線粒體自噬是腎臟保護的主要途徑[22]。Lin等[23]研究發現PINK1/Parkin介導的線粒體自噬在對比劑誘導的小鼠腎損傷中發揮重要作用,當沉默PINK1表達時,對比劑誘導的線粒體自噬會被逆轉進而加重小鼠腎損傷,表明PINK1/Parkin信號通路發揮腎損傷保護作用。另外,張馳昊等[24]也研究發現蝦青素可通過激活PINK1/Parkin通路增強線粒體自噬,減少ROS釋放,從而減輕對比劑誘導的大鼠急性腎損傷。本研究結果顯示在橫紋肌溶解誘導的急性腎損傷大鼠模型中,大鼠腎臟組織中可見LC3標記的自噬小體與COX4標記的線粒體共定位信號,并且腎臟組織中LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表達升高,提示PINK1/Parkin通路介導的線粒體自噬在橫紋肌誘導的急性腎損傷大鼠中激活,但由于激活的自噬水平不足以發揮出明顯的腎損傷保護作用,因此大鼠腎損傷沒有得到緩解。通過使用葛根素干預后,結果發現葛根素可減輕橫紋肌溶解誘導的急性腎損傷大鼠線粒體腫脹、線粒體脊紊亂、空泡性,并明顯增加腎臟組織LC3標記的自噬小體與COX4標記的線粒體共定位信號以及LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表達,提示葛根素可通過進一步激活PINK1/Parkin通路增強橫紋肌溶解誘導的急性腎損傷大鼠線粒體自噬,從而減輕大鼠腎損傷。使用自噬抑制劑3-MA結果發現,3-MA可明顯升高橫紋肌溶解誘導的急性腎損傷大鼠血清SCr、BUN、CK、炎癥因子水平以及腎組織氧化應激水平,加重大鼠腎損傷和線粒體損傷,并減弱大鼠線粒體自噬以及PINK1和Parkin蛋白表達,進一步證明了葛根素可通過PINK1/Parkin通路增強橫紋肌溶解誘導的急性腎損傷大鼠線粒體自噬,進而減輕大鼠腎損傷。本研究后續也將進一步明確葛根素最佳給藥劑量并深入研究PINK1/Parkin通路參與葛根素保護腎臟的具體機制,為葛根素的臨床應用提供新的理論依據。

4 結論

葛根素可通過PINK1/Parkin通路增強橫紋肌溶解誘導的急性腎損傷大鼠線粒體自噬,進而減輕大鼠腎損傷,為臨床防治橫紋肌溶解誘導的急性腎損傷提供新思路。