慢性鼻-鼻竇炎患者HIF-1α、FoxM1的表達及其與黏蛋白MUC5AC、MUC5B的相關性

唐進渝 彭麗娟 鐘春燕 杜經(jīng)緯

(1.川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院·南充市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科,四川 南充 637000;2.川北醫(yī)學院基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院,四川 南充 637000)

慢性鼻-鼻竇炎(Chronic rhinosinusitis,CRS)是耳鼻咽喉科常見病,一般表現(xiàn)為鼻腔和鼻竇黏膜的慢性炎癥反應,粘液分泌過多影響患者的生活質(zhì)量[1]。CRS一般有兩種亞型:伴有鼻息肉的CRS(CRS with nasal polyps,CRS wNP)和不伴有鼻息肉的CRS(CRS without nasal polyps,CRS sNP)。關于本病的病理機制比較復雜,目前尚未完全闡明,普遍認為多種炎癥模式與粘液纖毛和/或結(jié)構(gòu)異常共同作用,從而導致CRS的發(fā)展[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)CRS鼻竇黏膜上黏蛋白5AC(MUC5AC)和黏蛋白5B(MUC5B)呈高表達[4-5]。并且研究證實缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、輔助性T細胞2(Th2) 可以促進MUC5AC的產(chǎn)生[6-7]。但是關于CRS中HIF-1α、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子 M1(FoxM1)與黏蛋白(MUC)的研究不多。因此,本研究觀察患者鼻竇黏膜中HIF-1α、FoxM1、MUC5AC、MUC5B的表達,進一步探討其在CRS中的相關性,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月—2018年5月南充市中心醫(yī)院行鼻內(nèi)鏡手術的伴鼻息肉的CRS患者(CRS wNP組)和不伴鼻息肉的CRS患者(CRS sNP組)各40例。納入標準:①參考2020年歐洲關于鼻-鼻竇炎和鼻息肉的立場文件[3]診斷為CRS。②無其他嚴重器質(zhì)性疾病。③患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。排除標準:①前期手術史。②入院前2周給予過糖皮質(zhì)激素及抗生素。CRS wNP組患者中男25例,女15例;年齡24～64歲,平均(34.3±3.5)歲;CRS sNP組患者中男23例,女17例;年齡23～65歲,平均(35.1±4.1)歲。所有患者內(nèi)鏡下均取鼻竇病變黏膜。另取30例正常鼻腔黏膜作為對照組,因鼻中隔偏曲需行鼻鏡手術者,男18例,女12例;年齡20～61歲,平均(33.1±3.8)歲。各組患者的年齡、性別等一般資料之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究獲南充市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批[2022年審(083)號]。

1.2 方法 獲取標本后,分為兩份,一份置于4%多聚甲醛中固定,用于免疫組織化學檢查;另一份置于液氮中,并轉(zhuǎn)入冰箱中保存,用于逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(qRT-PCR)測定。

1.2.1 免疫組織化學法 石蠟包埋組織連續(xù)切片(厚度2 μm),切片常規(guī)脫蠟,梯度酒精法脫水,在含有煮沸的檸檬酸修復液的修復盒中抗原修復,冷卻至室溫,利用3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化酶,山羊血清封閉10 min,滴加一抗MUC5AC、MUC5B(美國Santa Cruz公司)及FoxM1、HIF-1α(美國Abcam公司),孵育30 min,滴加二抗(北京中杉公司),室溫孵育30 min。加DAB 顯色劑,蘇木精復染,鹽酸乙醇分化,脫水透明和中性樹膠封片,以PBS代替一抗作對照。結(jié)果判定:采用雙盲法,通過光學顯微鏡行5個高倍鏡視野觀察,由Image Pro Plus 6.0軟件測定陽性染色面積占上皮總面積的百分率。

1.2.2 qRT-PCR檢測 提取總RNA,測定總RNA 的濃度和純度,根據(jù)cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄實驗操作合成cDNA。以cDNA為模板,加入相應的特異引物,設定PCR程序,行PCR擴增。MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1和β-肌動蛋白(β-actin)循環(huán)條件相同。擴增產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。在紫外檢測儀下觀察特異擴增條帶,以相對應的β-actin為內(nèi)參,應用凝膠成像分析系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物條帶的密度值進行分析。引物序列見表1。

表1 MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1和β-actin目的基因qPCR 引物

2 結(jié)果

2.1 各組免疫組化結(jié)果分析 MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1在各組黏膜上皮中陽性面積均差異明顯(P<0.001),CRS wNP組和CRS sNP組各指標陽性表達率均明顯高于對照組(P<0.05),而CRS wNP組和CRS sNP組的各指標陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、圖1。

圖1 MUC5AC、MUC5B、FoxM1、HIF-1α的免疫組織化學染色(400×)

表2 MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1在各組黏膜上皮中陽性面積的比較

2.2 qRT-PCR結(jié)果分析 3組MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1 mRNA的相對表達量均有明顯差異(P<0.001),CRS wNP組和CRS sNP組各指標相對表達量明顯高于對照組(P<0.05),而CRS wNP組和CRS sNP組各指標相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1 mRNA的表達情況

2.3 HIF-1α、FoxM1與MUC5AC、MUC5B mRNA表達的相關性 Person分析結(jié)果顯示,CRS wNP組和CRS sNP組中HIF-1α與MUC5AC及MUC5B mRNA 的表達均存在正相關(P<0.001),且FoxM1與MUC5AC及MUC5B mRNA 的表達也均存在正相關(P<0.001)。見表4。

表4 各指標之間的相關性

3 討論

CRS是臨床上常見疾病,主要癥狀為鼻塞和膿涕、嗅覺減退、鼻面部脹痛等,且持續(xù)超12周,這一系列癥狀對患者生活質(zhì)量造成很大影響[8-9]。近年來,隨著藥物治療的逐漸規(guī)范及鼻內(nèi)鏡微創(chuàng)技術的廣泛應用,CRS臨床療效得到了明顯提高[10]。然而目前有關CRS的發(fā)病機制仍不清晰,引起本病發(fā)生發(fā)展的因素有很多,例如促炎因子、真菌及細菌感染等。炎癥反應是本病發(fā)生過程中的重要機制之一,黏膜炎癥導致蛋白的免疫,代謝和組織重塑過程的增加[11]。病理檢查發(fā)現(xiàn),MUC作為CRS的氣道粘液的重要組成部分,炎癥反應下鼻腔中MUC分泌明顯增加。有學者發(fā)現(xiàn)杯狀細胞和腺體細胞增生會導致MUC基因的表達增加,引起黏液增多,而黏液無法及時排出會進一步刺激鼻腔及鼻竇分泌膿性分泌物,促使該疾病長期發(fā)作,形成一種慢性炎癥[12]。

近年來,在氣道慢性炎性反應中的研究逐漸關注MUC調(diào)控表達的作用。黏液高黏彈性主要是因為MUC的存在,呼吸道中MUC主要分為3類:第一類分泌但不聚合的粘蛋白(MUC7),第二類分泌并聚合形成凝膠的粘蛋白(MUC5AC,MUC5B),最后跨膜結(jié)構(gòu)域且與細胞表面相關的粘蛋白(MUC1,MUC4,MUC16,MUC20);其中MUC5AC和MUC5B這兩種分泌性MUC被認為與呼吸道炎性疾病有密切關系,前者主要表達于氣道上皮的杯狀細胞上,后者主要表達于黏膜下腺體內(nèi)[13]。CRS sNP和CRS wNP在鼻竇黏膜中主要的凝膠形成粘蛋白為MUC5B和MUC5AC;有研究已提出通過抑制鼻竇MUC可以達到降低粘液分泌目的[14]。本研究的免疫組化和qRT-PCR結(jié)果顯示,MUC5AC、MUC5B在伴或不伴鼻息肉CRS患者中均有表達且較對照組升高;表明鼻腔其粘液中MUC5AC、MUC5B蛋白含量也升高;因此MUC5AC、MUC5B在CRS病理中都發(fā)揮著重要的作用。與Tong等[15]研究結(jié)果相似。目前分析相比于CRS wNP組,CRS sNP組的MUC5AC、MUC5B mRNA相對表達量顯示出無明顯差異。

CRS的炎性反應導致鼻腔粘液分泌過多,而HIF-1α在這反應過程中發(fā)揮作用[16]。HIF-1α作為轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白,可以調(diào)控MUC的表達,其在哮喘、慢性阻塞性肺疾病等下呼吸道疾病中作用都有報道,并且其與杯狀細胞的增生有關[17]。HIF-1α是一種在鼻黏膜漿液細胞中表達,在鼻黏膜粘液細胞中不表達因子;它可以引起鼻腔粘液增多,粘液增多破壞了原本鼻腔黏膜環(huán)境;所以鼻腔粘液平衡或許是CRS發(fā)生的關鍵因素[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α在伴或不伴鼻息肉CRS患者中有較強表達,且明顯高于對照組,與MUC5AC、MUC5B的表達存在明顯的相關性。HIF-1αmRNA表達增強,可以促進MUC表達提高進而發(fā)生CRS。與賀旭東等[19]通過PCR檢測分析得出結(jié)論相似。國外學者表示在低氧刺激下會引起HIF-1α的活化增多,而在HIF-1介導下引起黏液增多及MUC5AC的表達增強[20]。

FoxM1是Fox基因家族的成員,參與細胞增殖、分化、血管形成、凋亡等多種生物學作用,參與調(diào)節(jié)細胞周期[21]。FoxM1是基因表達和細胞循環(huán)機制等生理過程的關鍵調(diào)節(jié)器[22]。有研究者發(fā)現(xiàn)CRS鼻黏膜中FoxM1表達上調(diào),且發(fā)現(xiàn)是多種炎性因子導致鼻黏膜上皮細胞FoxM1表達增多;FoxM1增多可以促進黏膜杯狀細胞的分化以及炎性細胞的浸潤[23]。本研究中,在兩組CRS患者鼻黏膜中FoxM1有較強表達,且明顯高于對照組,與MUC5AC、MUC5B的表達存在明顯的相關性。FoxM1 mRNA表達增強,可以促進MUC表達進而發(fā)生CRS。有國外研究者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子FoxM1可以增加MUC5AC、MUC5B表達[24]。FoxM1可以促進樹突細胞的抗原遞呈,誘導杯狀細胞的分化,而且其可通過SPDEF轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控MUC5AC、MUC16等的表達。還有學者認為CRS患者鼻黏膜FoxM1的高表達后,通過信號通路來介導炎癥反應,能夠增加細胞因子的分泌與合成[25]。

本研究通過免疫組化及qRT-PCR發(fā)現(xiàn):CRS中長期的炎癥刺激,導致杯狀細胞的HIF-1α表達增強,進一步促進MUC5AC、MUC5B表達使鼻腔粘液增多,最后引起一種病理性的惡性循環(huán),根據(jù)研究結(jié)果顯示HIF-1α表達與MUC5AC、MUC5B正相關;同理FoxM1與MUC5AC、MUC5B也正相關;因此可以發(fā)現(xiàn)FoxM1、HIF-1α表達與MUC5AC、MUC5B也正相關。但是關于HIF-1α、FoxM1與MUC5AC、MUC5B具體調(diào)控機制研究較少,有待于進一步研究。本研究中CRS wNP組和CRS sNP組的MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1 mRNA的相對表達量均無統(tǒng)計學差異,原因可能是雖然CRS wNP和CRS sNP這兩種類型間存在一定的形態(tài)學差異,然而本質(zhì)上都是慢性炎癥反應,病程長,在炎癥狀態(tài)下鼻腔中黏膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)重塑,進而在病理特征上存在類似的地方,都可以調(diào)節(jié)黏液表達,所以在伴或不伴鼻息肉的組織上MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1的差異不明顯;這也說明在CRS wNP和CRS sNP鼻腔粘液表達情況本質(zhì)可能是一樣;還可以為它們調(diào)控機制存在許多共同點提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

在伴或不伴鼻息肉的CRS中,HIF-1α和FoxM1的表達均上調(diào),且與黏蛋白MUC5AC、MUC5B呈正相關,HIF-1α和FoxM1在CRS中黏液生成增多中具有重要的作用。隨著對HIF-1α和FoxM1信號通路與CRS關系,特別是對該通路在MUC合成的調(diào)控機制方面更進一步的研究,可以使人們更加了解CRS的發(fā)病機制,甚至可以為治療CRS提供新的方向。