線粒體參與鐵死亡的研究進展*

劉 利 綜述,杜 旅,張 平,鄒 偉 審校

(南華大學衡陽醫學院附屬南華醫院神經內科,湖南 衡陽 421002)

鐵死亡的發生通常伴隨著細胞內鐵和亞鐵離子的積累、脂質活性氧(ROS)生成、抗氧化系統的破壞及其他代謝變化。目前,已知細胞中至少有4種防御系統抵抗鐵死亡,包括早期發現的主要鐵死亡抑制通路——溶質載體家族 7成員11-谷胱甘肽-谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)[1],隨后發現另外2條平行途徑——泛醌-鐵死亡抑制蛋白1[2]和三磷酸鳥苷環化水解酶1-四氫生物喋呤-二氫葉酸還原酶[3]也發揮著重要的抗鐵死亡作用。此外還有由二氫乳清酸脫氫酶介導的獨立于經典GPX4信號通路位于線粒體中的鐵死亡防御系統[4]。鐵死亡參與了神經退行性疾病、心血管疾病、炎癥性疾病、癌癥、缺血再灌注損傷等多種疾病的發生、發展。線粒體是細胞多種代謝活動的中心,現從線粒體的不同功能層面闡述線粒體對鐵死亡的調控。

1 線粒體與鐵死亡具有相關性

線粒體在細胞死亡調節中發揮著重要作用,已明確線粒體在細胞凋亡[5-6]、壞死性凋亡[7]、細胞焦亡[8]中均發揮著重要作用,但線粒體究竟是否直接參與鐵死亡這一問題仍存在爭議。胱氨酸/谷胱甘肽/GPX4系統是哺乳動物中抵御鐵死亡的主要系統,2014年FRIEDMANN等[9]發現,GPX4失活在許多細胞系中誘導高程度的脂質過氧化,但在相同條件下通常不會誘導強烈的線粒體脂質過氧化,表明GPX4失活引起的鐵死亡主要是由非線粒體脂質過氧化所致。有研究表明,在線粒體缺失的細胞系中用不同鐵死亡誘導劑均可引發鐵死亡,意味著線粒體可能并非是鐵死亡發生過程所必須的[10]。然而近年來多項研究表明,線粒體相關的多種代謝活動在鐵死亡的發生中均起著重要作用[11-12]。

有學者在2012年最早提出鐵死亡這一概念時就發現,發生鐵死亡的細胞線粒體形態學特征性表現為透射電鏡下細胞內線粒體體積縮小、線粒體膜密度增加和線粒體嵴減少或消失[13]。在首次提出鐵死亡這一概念時便提示線粒體與鐵死亡具有相關性。隨后有研究發現,線粒體對鐵死亡相關刺激表現出高度的敏感性,在鐵死亡相關刺激后不久即出現線粒體碎片化和脂質過氧化,同時,氧化磷酸化和呼吸電子傳遞鏈(ETC)復合物的抑制加重了RSL3誘導的鐵死亡[14],進一步說明線粒體參與了鐵死亡的發生。在阿霉素(DOX)誘導的心肌病中DOX下調GPX4,并通過DOX-亞鐵離子(Fe2+)復合物誘導線粒體過度脂質過氧化,導致線粒體依賴性鐵死亡,最終引發心臟毒性[15]。另一項為線粒體與鐵死亡緊密聯系提供有力證據的研究發現,二氫乳清酸脫氫酶介導的位于線粒體中的鐵死亡防御系統是腫瘤治療新靶點,二氫乳清酸脫氫酶是定位于線粒體內膜的黃素依賴酶,其將電子傳遞給線粒體內膜中的泛醌,使其被還原成為二氫泛醌,進而抑制脂質過氧化,抵抗鐵死亡的發生[4]。

2 線粒體三羧酸循環(TCA)及氧化磷酸化與鐵死亡

細胞呼吸分為糖酵解、TCA和氧化磷酸化,糖酵解發生在細胞質中,TCA和氧化磷酸化分別在線粒體基質和線粒體內膜上進行。在有氧的情況下糖酵解產生的丙酮酸進入線粒體基質中,經氧化脫羧形成乙酰輔酶A進入TCA,并產生能量和還原性電子載體——還原型輔酶Ⅰ和FADH2。氧化磷酸化是指糖酵解和TCA產生的還原性電子載體所攜帶的電子在線粒體內膜上由5種復合物構成的ETC釋放能量,在三磷酸腺苷(ATP)合成酶催化下二磷酸腺苷被磷酸化生成ATP。

線粒體的TCA及氧化磷酸化參與調控鐵死亡。一項對乙酰氨基酚誘導肝細胞鐵死亡的研究表明,鐵死亡抑制劑——Fer-1增加了TCA代謝物的水平,表明TCA抑制相關的線粒體功能障礙引起能量生成受損可能驅動對乙酰氨基酚誘導的肝細胞鐵死亡[16]。在神經退行性疾病中同樣存在線粒體代謝相關的鐵死亡。一項探究NADPH 氧化酶4調節阿爾茨海默病星形膠質細胞鐵死亡機制的研究發現,NADPH氧化酶4升高通過減少線粒體ETC中的5種蛋白復合物抑制線粒體呼吸和ATP生成破壞線粒體代謝導致氧化應激,從而誘導脂質過氧化促進星形膠質細胞發生鐵死亡[17]。提示線粒體TCA和氧化磷酸化似乎在鐵死亡的發生中扮演著抑制的角色;與此相反,有研究發現,線粒體TCA和ETC促進了半胱氨酸缺乏(CDI)誘導的鐵死亡,抑制線粒體TCA或ETC復合物Ⅰ～Ⅳ可減少脂質過氧化物積累和鐵死亡,還提示線粒體抑癌基因延胡索酸酶突變的腎癌細胞對CDI誘導的鐵壞死敏感性明顯降低,但直接抑制GPX4導致的鐵壞死并不需要線粒體的參與[18]。更進一步的研究發現,線粒體復合物Ⅲ抑制劑對小鼠肝癌HepA 1～6細胞的脂質過氧化和CDI引起的鐵死亡具有明顯的保護作用,而線粒體復合物Ⅰ抑制劑對其無明顯保護作用,此外線粒體復合物Ⅲ抑制劑還能抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉運體基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞的鐵死亡[19]。提示在構成線粒體ETC的幾種復合物中線粒體復合物Ⅲ可能在鐵死亡中發揮著更為重要的作用。此外有研究發現,與低分化肝癌細胞株HA22T/VGH比較,高分化肝癌細胞株HepG2對RSL3誘導的鐵死亡更敏感,且HepG2表現出比HA22T/VGH更明顯的氧化磷酸化,更高的呼吸鏈復合物[20],表明線粒體氧化磷酸化參與了肝癌鐵死亡的發生。

盡管線粒體TCA與ETC在不同誘因引發的鐵死亡中發揮相反效應,但更多的證據支持線粒體TCA與ETC的代謝活動促進鐵死亡,其中TCA與多種回補反應可通過促進ROS、多不飽和脂肪酸、ATP的生成驅動鐵死亡,且線粒體ETC對ATP的產生至關重要,在ATP充足的情況下腺苷酸活化蛋白激酶不能被有效激活,從而無法滅活乙酰輔酶A羧化酶,繼而促進多不飽和脂肪酸的磷脂合成和后續鐵死亡的發生。但由于參與TCA及ETC代謝活動的生物分子繁多,其在鐵死亡中具體扮演何種角色、相互之間的聯系及發揮作用的機制仍需未來進一步深入研究。

3 線粒體自噬與鐵死亡

細胞自噬是真核生物在進化過程中高度保守、基于溶酶體的一種胞內降解途徑,對維持細胞和生物體的穩態平衡具有重要作用[21]。損傷的線粒體被特異性的包裹進自噬體中并與溶酶體融合,從而完成線粒體的降解,維持細胞內環境的穩定,這個過程被稱為線粒體自噬。目前,研究最廣泛的是由PINK 誘導假定激酶1-Parkin 介導的選擇性清除多余或受損線粒體的自噬調控通路[22]。

有研究表明,線粒體自噬參與了鐵死亡的發生、發展,并扮演著正向促進角色,如WJ460理化合物靶向肌鐵蛋白引發線粒體自噬和ROS積累,最終導致脂質過氧化和鐵死亡[23]。此外砷通過線粒體ROS-自噬-溶酶體途徑誘發胰腺功能障礙和鐵死亡,其中砷對線粒體的損傷表現為線粒體膜電位降低、細胞色素C水平降低和線粒體ROS的產生[24]。在糖尿病相關并發癥,如糖尿病視網膜病變中也涉及線粒體自噬和鐵死亡[25]。一項對糖尿病性骨質疏松的研究發現,沉默線粒體鐵蛋白(ftmt)通過ROS/PINK誘導假定激酶1/Parkin途徑誘導線粒體自噬的發生,最終促進鐵死亡,而過表達ftmt通過減少過量亞鐵離子引起的氧化應激,抑制成骨細胞中鐵死亡的發生[26]。

線粒體自噬具體如何影響鐵死亡的發生、發展尚無確切定論,可能通過增加內質網壓力影響鐵死亡,但也有研究表明,線粒體自噬與鐵死亡無明顯關聯。目前,對線粒體自噬與鐵死亡之間的關系認識尚淺,而線粒體自噬功能與神經退行性疾病、心血管疾病、癌癥等多種臨床疾病的發病機制密切相關,對線粒體自噬與鐵死亡聯系進一步研究以期發現關鍵調控因子,將對疾病治療提供新的方向。

4 線粒體DNA(mtDNA)與鐵死亡

線粒體擁有自身的遺傳物質——mtDNA,能獨立進行復制、轉錄和翻譯。mtDNA的突變率高于核DNA,且缺乏修復能力。mtDNA功能受核DNA的影響,mtDNA基因與核DNA突變均可導致線粒體蛋白質合成受阻,引起細胞能量代謝障礙[27]。

mtDNA沒有組蛋白保護,更容易受到線粒體產生的ROS攻擊,導致mtDNA氧化損傷。在研究扎西他濱對胰腺癌的治療作用中發現,扎西他濱通過mtDNA氧化損傷激活的環磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶-干擾素刺激基因通路誘導自噬引發胰腺導管癌細胞發生鐵死亡[28]。DOX通過嵌入mtDNA在線粒體中積累,以mtDNA含量依賴的方式誘導心肌細胞發生鐵死亡[29]。更為經典的mtDNA與鐵死亡相關的證據為mtDNA缺失綜合征(MDS)。MDS是由于維持mtDNA合成的核基因突變,mtDNA含量嚴重減少,導致多組織器官功能障礙的疾病。MDS發生鐵死亡的病理為患者肝細胞mtDNA缺失導致線粒體功能障礙、腺嘌呤核苷三磷酸合成減少、ROS大量增加及谷胱甘肽耗竭,繼而核受體共激活因子4(NCOA4)介導鐵蛋白在溶酶體中降解,鐵蛋白里的鐵釋放至細胞質中,引起脂質過氧化增加,最終導致肝細胞鐵死亡[30]。

mtDNA氧化損傷、mtDNA缺失均破壞了mtDNA的完整性從而促使鐵死亡的發生,因此,mtDNA的修復有助于抵抗鐵死亡。目前,生物體內的損傷修復途徑主要包括堿基切除修復、核苷酸切除修復、錯配修復、雙鏈斷裂修復和跨損傷DNA合成。不同mtDNA修復方式發揮抵抗鐵死亡效應的強弱值得進一步探討。

5 線粒體ROS與鐵死亡

ROS是一類含氧的化學反應物質,包括過氧化物、超氧化物、羥基自由基、單線態氧等。線粒體是ROS產生的重要來源,而鐵死亡常伴有脂質ROS的大量生成。

線粒體ROS與鐵死亡的發生具有強關聯性,RSL3介導了濃度依賴性的GPX4抑制、脂質過氧化、線粒體碎裂增強、線粒體膜電位喪失和線粒體呼吸減少,在RSL3誘導神經元HT22細胞和小鼠胚胎成纖維細胞鐵死亡中通過線粒體靶向ROS清除劑拯救線粒體的完整性和功能具有抵御細胞鐵死亡的作用[31]。在鐵死亡誘導劑——erastin處理SK-Hep1 ρ+細胞中發現了線粒體ROS的大量積累,由此誘發的鐵死亡可被線粒體ROS猝滅劑抑制[32]。暴露于N-GQDs的小膠質細胞BV2線粒體中鐵含量、ROS生成和脂質過氧化水平均增強,誘導線粒體氧化應激引起小膠質細胞鐵死亡,而線粒體靶向ROS清除劑預處理提高線粒體抗氧化能力后可有效逆轉上述改變[33]。

線粒體是ROS的重要來源,在多數情況下鐵死亡的發生伴隨ROS的生成,目前的研究說明線粒體中ROS的產生將促進鐵死亡的發生,其具體機制可能是通過促進脂質過氧化,且可以被線粒體靶向的抗氧化劑或酶抑制。在發現線粒體ROS可誘導鐵死亡前已發現線粒體ROS可誘導細胞凋亡,提示細胞凋亡與鐵死亡之間可能存在分子聯系,進一步尋找建立二者聯系的關鍵分子將為研發新型靶向藥注入新活力。

6 線粒體鐵代謝與鐵死亡

細胞內鐵代謝受多種機制的精確調控,線粒體是細胞內最大的鐵代謝細胞器,細胞質內游離鐵通過ftmt轉運進入線粒體,主要負責血紅素和鐵硫簇的生物合成[34]或儲存在ftmt中。鐵死亡的發生與體內鐵含量增加相關,線粒體鐵代謝異常對鐵死亡的發生具有重要影響[35]。

線粒體中游離鐵的過多積累可引發鐵死亡。在脂多糖誘導的心臟損傷中脂多糖增加NCOA4的表達和細胞內Fe2+水平,NCOA4可直接與鐵蛋白相互作用,以鐵自噬的方式降解鐵蛋白,釋放大量的鐵,細胞質Fe2+進一步激活線粒體膜上的鐵硫霉素的表達,從而將細胞質Fe2+轉運至線粒體,最終導致鐵死亡[36]。此外百草枯通過NCOA4誘導的鐵自噬途徑引起細胞質和線粒體中鐵的明顯積累,鐵超載引起脂質ROS產生誘導鐵死亡[37]。CDGSH 鐵硫結構域1是一種含鐵的線粒體外膜蛋白,其抗鐵死亡活性與線粒體鐵積累有關,抑制CDGSH鐵硫結構域1表達增加線粒體鐵積累和脂質過氧化可引發鐵死亡[38]。Ftmt在鐵穩態中具有重要作用,在小鼠缺血腦組織中ftmt水平上調,缺乏ftmt的小鼠發生更嚴重的腦損傷和神經功能缺損,并伴有鐵死亡的分子特征,包括腦缺血再灌注損傷后脂質過氧化增加和谷胱甘肽紊亂[39]。

在線粒體中鐵自噬促進游離鐵的釋放從而驅動脂質過氧化最終發生鐵死亡,調控線粒體Fe2+轉運相關蛋白的活性及鐵自噬相關鐵蛋白的水平進而改變線粒體中游離鐵的豐度,將影響鐵死亡的發生。

7 線粒體其他功能與鐵死亡

線粒體是一種處于高度運動狀態的細胞器,頻繁地出現分裂和融合,其中線粒體融合包含2個步驟,即由線粒體融合蛋白介導的外膜融合和由視神經萎縮蛋白1介導的內膜融合[40]。據文獻報道,線粒體融合也參與了鐵死亡,經典的鐵死亡誘導劑——erastin會誘導干擾素基因刺激蛋白1在線粒體中積累,在線粒體中與線粒體融合蛋白1/2結合,觸發線粒體融合,導致后續ROS的產生和脂質過氧化,促進人胰腺癌細胞系的鐵死亡[41]。鈣信號傳導在細胞周期調控中具有重要作用,線粒體是細胞內鈣的儲存細胞器之一[42]。低溫下線粒體鈣離子增加、線粒體膜電位超極化需要線粒體鈣離子攝取調節劑——線粒體鈣離子攝入蛋白1(MICU1),全基因組CRISPR 篩選發現,MICU1是在冷應激下產生脂質過氧化物和引發鐵死亡所必需的,小干擾RNA敲除MICU1可抑制冷應激誘導的腎和肝來源細胞系發生鐵死亡[43]。線粒體中還存在多種酶對鐵死亡具有調節作用,如線粒體外膜蛋白——FUN14 結構域蛋白2通過降低谷胱甘肽轉運蛋白——溶質載體家族25成員11的穩定性和二聚體形成引起線粒體內谷胱甘肽含量下降,繼而線粒體發生氧化損傷和形態功能異常,導致脂質過氧化和鐵死亡,這也是DOX誘導心肌病的分子機制之一[44]。此外還有定位在線粒體內膜上的酶——甘油-3-磷酸脫氫酶2,通過在線粒體內膜還原泛醌為泛醇抑制線粒體脂質過氧化,從而抵御細胞鐵死亡[45]。

8 小 結

線粒體在鐵死亡中的作用一直存在爭議,但近年來越來越多的研究說明線粒體與鐵死亡的發生關系密切。基于線粒體參與調控多種代謝活動,且線粒體不同功能在參與鐵死亡發生、發展的過程中并非孤立,而是相互關聯。因此,線粒體中多種代謝的聯合作用如何影響鐵死亡及具體機制值得繼續探討。2022年3月TSVETKOV等[46]發現了一種全新的細胞死亡方式——銅死亡,銅離子通過直接結合TCA途徑中的脂酰化成分導致脂酰化蛋白異常聚集及鐵硫簇蛋白的丟失,從而導致蛋白質毒性應激反應最終導致細胞死亡,銅死亡通過將銅靶向線粒體觸發細胞死亡。由此可見,線粒體不僅在鐵死亡的發生中發揮作用,還可能參與了銅死亡的發生,而線粒體在各種細胞死亡中扮演何種角色尚不明晰,對線粒體與鐵死亡及其與他細胞死亡方式關系的探索,將有助于充分認識不同細胞死亡方式之間如何相互聯系并為臨床疾病的治療提供新思路。