蘿卜SCPL3 基因的克隆與生物信息學分析

李紫薇，霍燕琦，徐銘婕，張文靜，劉同金

（金陵科技學院園藝園林學院，南京 210000）

絲氨酸羧肽酶（Serine carboxypeptidases，SCP）是一類真核生物水解酶，主要存在于真菌或植物的液泡以及動物的溶酶體中［1］。絲氨酸羧肽酶類蛋白（Serine carboxypeptidase-like proteins，SCPL）是與SCP 在結構和功能上高度相似的一類蛋白，二者同屬于SC 族羧肽酶中的S10 蛋白家族［2］。S10 蛋白家族是催化功能蛋白成熟的龐大蛋白水解酶家族，可分為溶酶體Pro-Xaa 羧肽酶、絲氨酸D-Ala-D-Ala羧肽酶、羧肽酶C、羧肽酶D 四大類酶，植物中的SCP/SCPL 蛋白基本都屬于羧肽酶C 和羧肽酶D［3］。根據氨基酸序列特征，SCP/SCPL蛋白可分為羧肽酶Ⅰ、羧肽酶Ⅱ、羧肽酶Ⅲ三大類［4］，動植物中的SCPL 蛋白多屬于羧肽酶Ⅰ和羧肽酶Ⅱ，而羧肽酶Ⅲ主要存在于植物、酵母和絲狀真菌中［5］。此外，有些SCPLs 除了具有肽酶活性外，還具有?；D移酶活性［6］。

結構上，SCP/SCPL 蛋白均含有高度保守的“α/β水解酶折疊”三級結構以及獨特的拓撲結構催化中心［7］，存在1 個與底物結合的保守結構域和3 個催化作用的保守結構域，含有多個N-糖基化位點，1 個細胞內分泌和轉運信號肽［5］。功能上，SCP/SCPL 蛋白參與調控植物多種生理過程，主要涉及種子萌發過程中儲存蛋白的水解反應［8］、植物創傷應答反應［9］、油菜素內酯信號轉導途徑［10］、細胞程序性死亡時胞內組分的自溶［11］、植物次生代謝物的酰基化修飾及對逆境的響應［12］。

蘿卜（Raphanus sativusL.）為一年或二年生十字花科草本植物，是世界重要的蔬菜作物，具有較高的經濟、藥用和食用等價值。但在蘿卜的生長發育過程中經常遭受多種生物和非生物脅迫，嚴重影響其產量與品質。發掘蘿卜抗逆性相關基因，不僅能揭示其抗性分子機制，也能加快蘿卜抗性育種進程。SCPL 蛋白在調控高等植物的多種生理過程中發揮重要作用，但蘿卜SCPL基因的功能和表達調控研究鮮見報道。本研究通過RT-PCR 技術克隆了蘿卜SCPL3（RsSCPL3）基因CDS 全長序列，并對其進行生物信息學分析，旨在為進一步開展該基因的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 心里美蘿卜高代自交系CCHX17-6。

1.1.2 供試試劑 RNA 提取試劑盒FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit、DL2000 Plus DNA Marker（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），反轉錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（北京寶日醫生物技術有限公司），KOD-Plus-Neo 高保真酶［東洋紡（上海）生物技術有限公司］，pENTR?/D-TOPO?cloning kit（Invitrogen），瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（天根生化科技有限公司），瓊脂糖、50×TAE 緩沖液、硫酸卡那霉素、瓊脂粉、LB 培養基［生工生物工程（上海）股份有限公司］，GelRed 核酸染料（Biosharp），DH5α 大腸桿菌化學感受態細胞（上海唯地生物技術有限公司）。

1.1.3 主要儀器 MIKRO220R 型高速冷凍離心機（德國Hettich 公司），S1000TM型PCR 擴增儀（美國Bio-Rad 公司），DYY-2C 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），GenoSens1880 型凝膠成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司），DW-86L286 型超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司產品），SW-CJ-2FD 型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），HVA-85 型高壓滅菌鍋（日本HIRAYAMA 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA 提取及cDNA 合成將蘿卜自交系CCHX17-6 種植于金陵科技學院園藝實驗站，取成熟期肉質根于液氮中速凍，于-80 ℃冰箱中保存備用。利用RNA 提取試劑盒從蘿卜肉質根中提取總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，利用反轉錄試劑盒將其反轉錄成cDNA，于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 引物設計與PCR 擴增根據已發表的蘿卜基因組數據［13］，設計并合成RsSCPL3基因的特異性引物SCPL-F：（5′-caccATGGCTAAGAAGTTGCTTC TGCTTC-3′）和SCPL-R：（5′-TTAGAGAGGTTGACCACTAATCCACCTC-3′）。以cDNA 為模板進行PCR 擴增，反應體系為50 μL，其中cDNA 模板3 μL，10×PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L 上下游引物各1.5 μL，25 mmol/L MgSO43 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，酶（1U）1 μL，ddH2O 30 μL；PCR 擴增程序使用兩步法：94 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，68 ℃延伸1 min，35 個循環。

1.2.3 目的片段的回收、載體構建與測序 將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，利用DNA 回收試劑盒進行目的條帶的切膠回收，將回收產物連接到pENTER-TOPO 載體上，重組產物轉化為大腸桿菌感受態細胞DH5α，菌液PCR 篩選陽性進行克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4 生物信息學分析 利用ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）進行RsSCPL3蛋白質的理化性質分析；利用ExPASy-ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）預測蛋白親疏水性；利用Signalp 4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-4.1）分析信號肽；利用TMHMM 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）預測跨膜結構域；利用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位預測；利用NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）預測保守結構域；利用SPOMA（http：//www.ibcp.fr/predict.html/）預測蛋白質二級結構；運用MEGA 軟件構建RsSCPL3 蛋白系統進化樹（Neighbor-joining法，Bootstrap 值設置為1 000）。

2 結果與分析

2.1 RsSCPL3 基因克隆

以蘿卜肉質根的cDNA 為模板，經PCR 擴增和瓊脂糖凝膠電泳獲得了1 500 bp 左右的目的片段（圖1）。測序結果表明，RsSCPL3基因CDS 序列大小為1 434 bp，編碼477 個氨基酸。

圖1 RsSCPL3 基因克隆

2.2 RsSCPL3 蛋白理化性質的分析

預測RsSCPL3蛋白分子式為C2493H3762N632O709S21，相對分子質量為54.6 kD，原子總數為7 617，理論等電點（PI）為6.33。RsSCPL3 蛋白帶負電荷殘基（Asp+Glu）為49，正電荷電殘基（Arg+Lys）為45，脂肪系數為81.30，不穩定系數為39.26，屬于穩定蛋白。

ProtScale 預測RsSCPL3 蛋白平均親水值為-0.227，且第9 位和第10 位的亮氨酸（Leu）表現最大疏水性，疏水均值為3.956，第63 位的天冬酰胺（Asn）表現最大親水性，分值為-3.122，說明其為親水性蛋白。

2.3 RsSCPL3 蛋白信號肽、跨膜結構域及亞細胞定位

信號肽主要功能為促進蛋白質連續進入分泌途徑并將蛋白質運送至細胞外，本研究利用Signalp 4.1 預測RsSCPL3 蛋白具有1 個信號肽（圖2）。TMHMM 2.0 預測該蛋白存在3 個跨膜區域（圖3），WoLF PSORT 預測其最有可能定位于液泡中，在細胞外基質和內質網膜上也可能有分布，表明其可能為分泌蛋白。

圖2 RsSCPL3 蛋白信號肽預測

圖3 RsSCPL3 蛋白跨膜結構域預測

2.4 RsSCPL3 蛋白保守結構域和二級結構預測

使用NCBI 的Conserved Domains 工具，預測發現RsSCPL3 蛋白具有1 個屬于SC 族羧肽酶中的S10蛋白家族的保守結構域（圖4）。

圖4 RsSCPL3 的保守結構域預測

SPOMA 預測RsSCPL3 蛋白二級結構，發現該蛋白由α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規則卷曲組成，其分別包含147、34、89 和207 個氨基酸，占比分別為30.82%、7.13%、18.66%和43.40%（圖5）。

圖5 RsSCPL3 蛋白二級結構預測

2.5 RsSCPL3 蛋白系統進化樹

為明確RsSCPL3 與其他植物的系統進化關系，利用MEGA 軟件構建系統進化樹。結果表明，RsSCPL3 蛋白與甘藍型油菜（Brassica napus）、甘藍（Brassica oleracea）、芝麻菜（Eruca vesicariasubsp.sativa）、菥蓂（Thlaspi arvense）、鹽芥（Eutrema salsugineum）等十字花科植物同源蛋白聚為一類，親緣關系較近，而與苦瓜（Momordica charantia）、甜橙（Citrus sinensis）、大豆（Glycine max）、茶（Camellia sinensis）、曼陀羅（Datura stramonium）等親緣關系相對較遠（圖6）。

圖6 RsSCPL3 與其他植物同源蛋白的系統進化樹分析

3 討論

SCP/SCPL基因參與調控植物的多種生理過程。擬南芥（Arabidopsis thaliana）BRI1 在油菜素內酯信號轉導中發揮作用［14］。通過表達AtECS1可增加油菜植株的心皮數、莢果種子數以及千粒重，且ECS1也可能參與油菜素內酯信號的轉導過程［15］。水稻（Oryza sativaL.）GS5基因調控谷粒大小，在提高水稻產量方面具有重要意義［16］。煙草（Nicotiana tabacum）NtSCP1和NtSCP2基因參與調控細胞生長［17］，在植株形態發育方面起作用。豌豆（Pisum sativum）PsCP基因在種子生長發育中起重要作用［18］。

此外，SCP/SCPL基因在植物對生物和非生物脅迫的響應過程中也發揮重要作用。水稻OsBISCPL1能被BTH、JA、SA、ACC 等抗病信號分子誘導表達，并且在水稻和稻瘟病菌的非親和性互作中上調表達［10］。干旱、鹽、ABA、MeJA 和BR 誘導小麥TaSCPL184-6D顯著上調表達［19］。玉米（Zea mays）Zm-SCP響應立枯絲核菌脅迫，且ABA、JA、高鹽和低溫處理均誘導其上調表達［20］。赤霉素誘導豌豆PsCP基因上調表達，而多效唑抑制其表達［18］。黃瓜（Cucumis sativusL.）中多個SCPL基因響應鹽脅迫和白粉病菌侵染［21］。

4 小結

本研究從心里美蘿卜中克隆出SCPL3基因并對其進行系統的生物信息學分析，其分子式為C2493H3762N632O709S21，是穩定親水性分泌蛋白，含有SC 族羧肽酶中的S10 蛋白家族結構域，可能定位于液泡，存在1 個信號肽和3 個跨膜結構域，與甘藍型油菜、芝麻菜等十字花科植物同源性較高。研究結果為下一步RsSCPL3基因的功能和表達調控機制研究奠定了基礎。