12 個抗稻瘟病基因在山東省地方水稻品種中的分布

房文文，王海鳳，郭濤，姜艷芳，薛芳，張煥霞，張士永

(山東省農業科學院濕地農業與生態研究所/山東省水稻工程技術研究中心，山東 濟南 250100)

水稻是世界上的主糧作物之一，近一半的人口以稻米為主食[1-2]。 稻瘟病是水稻生產上最重要的病害，嚴重影響水稻產量和品質[3-4]。 山東省一般5 年左右會暴發一次，發病田塊一般減產10%～30%，嚴重的甚至超過50%[5]。 山東屬黃淮海稻區，以粳稻為主，年均種植面積達13 萬公頃[6]。 稻瘟病的發病條件為氣溫26 ～28 ℃、相對濕度90%以上，臨沂、日照等稻區水稻抽穗灌漿期的氣候特點符合其發生流行的條件，是山東省稻瘟病發生較重的地區[7]。 目前，選育和合理種植抗病品種是控制稻瘟病流行最經濟有效的途徑[8-9]。 由于田間稻瘟病菌小種類型多樣，易發生變異，一些抗病水稻品種連續種植3 ～5 年后抗性就會喪失，田間表現為感病，從而造成減產[10]。

隨著水稻基因組學和測序技術的迅速發展，越來越多的抗稻瘟病基因被定位與克隆，目前已被定位的抗瘟基因有100 多個，已克隆的抗瘟基因超過30 個[11]。 抗瘟基因多為顯性基因，其作用方式多為通過與核苷酸結合位點-富含亮氨酸重復序列蛋白(NBS-LRR)結合，從而使病原菌失去侵染性[12-13]。 近年來，抗瘟基因分子標記的開發，主要為SSR、Indel、SNP 標記，為高效檢測抗瘟基因奠定了基礎[14-16]。 張亞玲等利用35 個抗瘟基因標記檢測了黑龍江省50 個水稻主栽品種，發現抗瘟基因Pish、Pi36、Pi33和Pi-CO39在供試品種中的出現頻率為100%，Pi63、Ptr、Pi37、Pi64、pi21、Pi9、Pi54、Pia、Pikp、Pi35、Pikm和Pik的出現頻率為50%～100%，Pita、Pib、Pii、Pi5、Piz-t、Pi50和Pi2的出現頻率為10%～50%，Pid2僅在2個品種中被檢測到，Pigm僅在1 個品種中被檢測到，而Pit、Pid3、Bsr-d1、Pi25、Pid3-A4、Pi56、Pi1、Pike和Pb1在供試品種中未檢測到[17]；楊林浩等利用一套稻瘟病菌標準菌株和特異性分子標記相結合，檢測了吉林省68 個主栽水稻品種，發現Pita、Pia、Pish、Pita2、Pib和Pi9為吉林省主栽品種中出現頻率較高的抗瘟基因，推測所有品種可能不含有Pi2、Pi54、Pikm、Pi11和Pi12基因[18]。

山東省作為重要的粳稻產區，有著豐富的地方品種資源，但有關這些品種資源的抗瘟基因分布未見報道。 本研究利用Pita、Pita2、Pia、Pi9、Pigm、Pikm、Pi54、Pi5、Pii、Pib、Pish、Pi1共12 個抗瘟基因的分子標記對78 個山東省地方品種進行抗瘟基因檢測，以初步明確這些品種的抗瘟基因組成，為今后進一步挖掘和利用抗瘟基因、培育持久廣譜抗瘟品種提供基因信息和數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為78 個山東省地方水稻品種，見表1，均由山東省農業科學院濕地農業與生態研究所種質資源團隊收集和保存，均以常規方法栽培。

表1 供試山東省地方水稻品種

試劑及儀器: 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，購于生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR 試劑，北京全式金生物技術(TransGen Biotech) 有限公司產品；EvaGreenqPCR 核酸染料，美國Biotium 公司產品。 SPX 智能型生化培養箱、RXZ-500C-LED 人工氣候培養箱，寧波江南儀器廠產品；BCD-290W 型立式冰箱，青島海爾股份有限公司產品；羅氏LightCycler96 實時熒光定量PCR 儀，Roche 公司產品。

1.2 水稻DNA 提取

剪取3 段供試水稻品種的葉片(大小為2 mm×2 mm)于2 mL 離心管中，采用CTAB 法提取DNA。具體步驟如下:

(1)向裝有供試水稻葉片的離心管中加600 μL 65 ℃預熱的2×CTAB，然后65 ℃溫浴30 min；

(2)冷卻后加600 μL 氯仿-異戊醇溶液(氯仿和異戊醇體積比為1∶1)混勻，12 000 r/min 離心10 min，吸200 μL 上清液，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻后于-20 ℃條件下沉淀30 min；

(3)12 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄上清液，加入600 μL 體積百分含量為70%的乙醇洗滌沉淀1～2 次，放入通風櫥內吹干；

(4)加入100 μL TE(10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0)溶解DNA，使用核酸定量儀測量DNA 濃度，并將濃度調整為約10 ng/μL，-20℃保存待測DNA。

1.3 抗瘟基因分子標記

本研究選用抗瘟基因Pita、Pi9、Pikm、Pigm、Pia、Pi54、Pish、Pii、Pi1、Pib、Pita2、Pi5的分子標記進行試驗，其PCR 特異性引物信息見表2。 所有引物均由華大基因有限公司合成。

表2 抗瘟基因的特異性引物

1.4 PCR 擴增

熒光PCR 反應體系:10×Taqbuffer(含20 mmol/L Mg2+)1 μL，250 μmol/L dNTP 0.2 μL，0.5 UTaqDNA Polymerase 0. 1 μL，20 × Evagreen 0.125 μL，10 ng/μL DNA 模板3 μL，0.1 mmol/L正、反向引物各0.2 μL，用ddH2O 定容至10 μL。熒光PCR 擴增程序:94 ℃預變性2 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個循環。

普通PCR 反應體系:2× ESTaqMaster Mix(Dye)7.5 μL，水稻DNA 3.0 μL，正、反向引物各0.5 μL，3.5 μL ddH2O。 PCR 反應程序:95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ～60 ℃退火30 s(根據梯度PCR 的結果選擇最佳退火溫度)，72 ℃延伸0.5～1.5 min(由擴增產物的長度決定)，32 次循環；72 ℃延伸10 min。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測

抗瘟基因Pish、Pii、Pib、Pita2、Pi5的擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，150 V 穩壓電泳30 min，然后在凝膠成像系統中拍照。

1.6 HRM 檢測

抗瘟基因Pita、Pi9、Pikm、Pigm、Pia、Pi54、Pi1的擴增產物經熔解曲線(HRM)檢測。 分析程序:95 ℃變性15 s；60 ℃退火15 s；以0.07 ℃/s的速率升溫，10 reading/℃采集熒光信號，至90℃保持1 s，采用Light Cycler 96 software 軟件進行熔解曲線分析。

1.7 數據處理與統計分析

采用Microsoft Excel 對數據進行整理和作圖。 采用NTSYS 2.10 軟件計算78 個品種間的遺傳相似系數，然后利用非加權類平均法(UPGMA)對遺傳相似系數進行聚類分析，得到聚類樹形圖。

2 結果與分析

2.1 稻瘟病抗性基因的分子標記檢測及在品種中的分布

本研究利用Pita、Pita2、Pia、Pi9、Pigm、Pikm、Pi54、Pi5、Pii、Pib、Pish和Pi1的功能標記對78個山東省地方水稻品種進行分子檢測，結果(表3)發現，有53 個品種含有Pi54，有39 個品種含有Pia，有23 個品種含有Pi5，有17 個品種含有Pikm，有16 個品種含有Pib和Pii，有13 個品種含有Pi1，有1 個品種含有Pi9、Pish和Pita2，所有品種中均未檢測到Pita和Pigm。 部分基因分子標記的檢測結果如圖1、圖2 所示。

圖1 高分辨率熔解曲線檢測地方水稻品種的抗瘟基因

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測地方水稻品種的抗瘟基因Pi54、Pib、Pii

表3 山東省地方水稻品種抗瘟基因檢測結果

Pi54和Pia在供試品種中的分布頻率最高，分別高達67.95%和50.0%；其次是Pi5、Pikm、Pib、Pii和Pi1，分布頻率分別為29.49%、21.79%、20.51%、20.51%和16.67%；分布頻率較低的是Pi9、Pish和Pita2，均為1.28%；檢測品種中都不含有抗性基因Pita和Pigm(表3、圖3)。

圖3 12 個抗稻瘟病基因在山東省地方水稻品種中的分布頻率

2.2 不同地方水稻品種含抗瘟基因的數量分析

由表3 和圖4 可知，竹稈青-1、竹稈青-2、塘稻、明水米旱稻-1、明水香稻、紫稈旱稻等27 個品種檢測出2 個抗瘟基因，占檢測品種總數的34.62%，其中，有23 個品種檢出Pi54，有15 個品種檢出了Pia。 小黃稻、大青秸-3、小紅芒、旱稻子、秋白水稻、蔣莊1 號等19 個品種檢測出1 個抗瘟基因，占檢測品種總數的24.36%，其中，有8個品種檢測出Pi54。 粘旱稻-1、秋旱稻、高秸水旱稻-2、蓬萊稻-3、香稻、郯城野生稻等13 個品種檢測出3 個抗瘟基因，占檢測品種總數的16.67%。 另外，紫皮旱稻、水牛皮旱稻-1、青旱稻、蓬萊稻-1、葫蘆香稻等7 個品種檢測出4 個抗瘟基因，鐵耙子、八月芒、樂陵旱稻、短頂芒白米4 個品種檢測出5 個抗瘟基因，僅禿頭紅米稻檢測出6 個抗瘟基因，紅皮高麗旱稻-1、粘稻2 個品種檢測出7 個抗瘟基因。 而大青秸-1、汪稻、水牛皮旱稻-1、老旱稻-2、旱粘稻-2 共5 個品種未檢測到12 個抗瘟基因中的任何一個。

圖4 山東省地方水稻品種含抗瘟基因數統計

2.3 山東省地方水稻品種的聚類分析

基于遺傳相似系數，利用UPGMA 法對78 個山東省地方水稻品種進行聚類分析，結果(圖5)顯示，在遺傳相似系數0.80 處，可將78 個供試材料分為四類。 第一類包括大青秸-1、汪稻及水牛皮旱稻-1 共3 個品種；第二類僅有高秸水旱稻-1；第三類包括大青秸-3、紫穎稻、粘旱稻-2 及白芒子共4 個品種；其余70 個品種均聚在第四類中。

圖5 78 個山東省地方水稻品種的聚類分析結果

3 討論與結論

水稻與稻瘟病菌存在協同進化關系，一個抗病新品種在生產上使用幾年后，由于稻瘟菌變異而突破水稻的防御機制，使抗病品種的抗病能力下降甚至喪失，變為感病品種。 因此，在改良水稻品種的稻瘟病抗性時，要首先弄清品種中的抗瘟基因(組合)，從而更好地利用不同的抗瘟基因組合對品種進行改良。 有關我國現有水稻品種中抗瘟基因的分布情況，前人已進行過一些研究，如豈長燕等研究了抗瘟基因Pib、Pita、Pi5、Pi25和Pi54在我國124 份水稻微核心種質中的分布[19]；范方軍等研究了Pib、Pita、Pi54和Pikm在江蘇省遲熟中粳稻預試64 份品系中的分布[20]。 本研究利用12 個抗瘟基因(Pita、Pita2、Pia、Pi9、Pigm、Pikm、Pi54、Pi5、Pii、Pib、Pish、Pi1)的分子功能標記檢測了78 個山東地方水稻品種的抗瘟基因分布情況，結果表明，除Pita、Pigm未檢測到外，其余10 個基因均能在山東省地方水稻品種中檢測到。 其中，Pi54和Pia在供試品種中的分布頻率較高，達67.95%和50.0%；其次是Pi5、Pikm、Pib、Pii和Pi1，分布頻率分別為29.49%、21.79%、20.51%、20.51%和16.67%；Pi9、Pish、Pita2的分布頻率較低，僅為1.28%。 各品種含有抗瘟基因的數量為1～7 個不等，抗瘟基因組合種類豐富。

目前，培育持久廣譜抗病品種和合理布局抗病品種仍是控制稻瘟病最經濟有效的途徑，而挖掘種質資源中的抗瘟基因是重要基礎。 本研究結合山東省稻瘟病菌群體生理小種的變異動態，挑選出可進一步利用的抗瘟基因Pi54、Pia、Pi5、Pikm、Pib和Pii，下一步可作為目的基因利用到主栽品種中，這為育種家培育抗稻瘟病新品種提供了數據支持，助力了培育持久和廣譜抗稻瘟病水稻新品種。 但需注意有些抗瘟基因與不良性狀的“連鎖累贅”效應，如Pigm與小粒性狀連鎖，以避免在提高抗病性的同時負向影響產量或品質。

本研究僅檢測了12 個抗瘟基因在78 個山東省地方水稻品種中的分布情況，但其他抗瘟基因的分布情況還有待進一步研究；另外，地方品種中抗瘟基因數量與水稻品種稻瘟病抗性頻率間的關系也有待進一步研究。