花椒根腐病拮抗菌W-5 的鑒定及發酵條件的優化

田鳳鳴，陳強，何九軍，王國斌，張曉娜

(1. 隴南師范高等專科學校農林技術學院/隴南特色農業生物資源研究開發中心，甘肅 隴南 742500；2. 隴南市武都區花椒服務中心，甘肅 隴南 742500)

花椒根腐病是一種危害性極強的土傳病害，嚴重時能造成椒樹死亡。 前期研究鑒定認為，引起甘肅隴南武都花椒種植區根腐病的病原菌為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)[1]。 隨著化學農藥減量化防治的推廣，花椒根腐病的生物防治成為當前研究的熱點，也是獲得一種可持續且安全有效的病害防治方案的重要選項。 拮抗菌對病原菌具有高度特異性，綠色環保是拮抗菌在防治植物病害中所具有的優點[2]。 農藥商業化生產中，越來越多的優良微生物菌種資源被開發成生防制劑，且其防治效果受到好評。 植物病害生物防治中芽孢桿菌顯示出巨大的潛力和應用前景[3]。

響應面分析法現已成為優化拮抗菌發酵培養的常用手段，該方法的特點是能節約時間和減少試驗次數，克服了單因素試驗存在的不足[4-8]。目前有關花椒根腐病拮抗菌的資源較少，優良菌種資源更是相對匱乏，已報道的對花椒根腐病具有良好拮抗作用的菌株有淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)[9]、蠟樣芽孢桿菌[10]、綠色木霉和哈茨木霉[11]、貝萊斯芽孢桿菌T-1[12]。 本研究于2021 年以引起花椒根腐病的主要致病真菌腐皮鐮刀菌為指示菌，采用土壤平板稀釋法和平板對峙法分離獲得花椒根腐病拮抗菌W-5，繼而對其進行形態學觀察和分子生物學鑒定，測定其抑菌活性，并基于單因素試驗結合Box-Behnken 設計的響應面法對菌株W-5 的最佳發酵條件進行優化，以期為花椒根腐病拮抗生物菌劑的開發與應用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 指示菌腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)H1 和拮抗菌W-5 分別從患有花椒根腐病的花椒根部組織和根系土壤中分離獲得，保存于隴南師范高等?？茖W校農林技術學院微生物實驗室。 用于廣譜抑菌試驗的病原菌(藤倉赤霉菌、禾谷鐮刀菌、梅毒鐮刀菌、層生鐮刀菌)由江西師范大學楊慧林老師惠贈，核桃炭疽病松針刺盤孢菌由甘肅農業大學碩士研究生魏彬惠贈。 病原菌保存于4 ℃冰箱備用。

1.1.2 培養基 供試培養基如下。

PDA 培養基(g/L):馬鈴薯去皮切塊稱取200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水定容至1 L。

LB 培養基(g/L):酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，溶質溶解后，pH 值用5.0 mol/L NaOH 調至7.0，去離子水定容至1 L。

NYBD 培養基(g/L):酵母浸粉5.0 g，牛肉浸粉8.0 g，葡萄糖10.0 g，調pH 值至7.5，加蒸餾水至1 L。

以上三種培養基均在103.4 kPa 下滅菌21 min。

1.1.3 主要試劑和儀器 胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉、葡萄糖、瓊脂、氫氧化鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；722N 可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司產品；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司產品；氣浴式搖床，常州高德儀器制造有限公司產品；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠產品；細菌基因組提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產品。

1.2 拮抗菌的分離、篩選及鑒定

1.2.1 拮抗菌W-5 的分離 稱取花椒根系土壤1.0 g，放入100 mL 無菌三角瓶中，加入無菌水90 mL，搖床上180 r/min 培養30 min，靜置30 min后，取上清液并將濃度梯度稀釋至10-1～10-8。 取10-6、10-7、10-8三個濃度梯度溶液200 μL 涂布于LB 固體培養基中32 ℃培養2 d，之后挑取單菌落，編號為W-5，并將其接種于LB 液體培養基中擴大培養，4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 拮抗菌W-5 的篩選 采用平板對峙法[13]對分離出的拮抗菌W-5 進行抑菌效果測定。 以腐皮鐮刀菌為指示菌，用打孔器將其打成直徑為6 mm 的菌餅，接種于PDA 培養基中心，距離中心點2 cm 處成品字形放入無菌濾紙片，取W-5 單菌落菌液10 μL 加在濾紙片上，30 ℃恒溫培養7 d，測定病原真菌菌落直徑，計算抑制率。

1.2.3 拮抗菌W-5 的分子生物學鑒定 利用形態學結合分子生物學的方法對拮抗菌W-5 進行鑒定。 將W-5 菌株接種至LB 培養基上，32 ℃培養2 d，置于光學顯微鏡下觀察其形態，單菌落置于體視顯微鏡(放大倍數為150×)下觀察其形態，同時對其進行革蘭氏染色[14]；分子鑒定采用細菌通用引物27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇/1492R:5＇-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3＇進行PCR 擴增，PCR 產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 北京六合華大基因科技有限公司完成基因測序，采用BLAST 完成測序結果的同源性分析，系統發育樹構建運用MEGA 7.0 中N-J 法完成[15]。

1.3 拮抗菌W-5 對腐皮鐮刀菌前端菌絲生長影響的觀察

將1.2.2 中平板對峙法獲得的抑菌平板置于體視顯微鏡(150×)下，觀察拮抗菌W-5 對病原菌腐皮鐮刀菌前端菌絲生長的影響。

1.4 拮抗菌W-5 對病原真菌抑菌譜的檢測

以5 種病原真菌(禾谷鐮刀菌、梅毒鐮刀菌、藤倉赤霉菌、松針刺盤孢菌和層生鐮刀菌)為供試指示菌，采用平板對峙法檢測拮抗菌W-5 對各病原真菌的抑制率，其方法同1.2.2。

1.5 拮抗菌W-5 對花椒根片的離體抑菌試驗

花椒根片的離體抑菌試驗操作步驟參照文獻[12]進行。

1.6 拮抗菌W-5 產胞外酶的檢測及嗜鐵素培養基檢測

纖維素酶、幾丁質酶、蛋白酶檢測培養基的配制參照文獻[16]的方法進行，采用CAS 檢測平板進行拮抗菌W-5 產嗜鐵素的檢測，其制備參照文獻[17]的方法進行。

1.7 拮抗菌W-5 發酵條件優化

1.7.1 測定繪制拮抗菌W-5 生長曲線 將拮抗菌W-5 種子液按照1%的比例接入LB 液體培養基中，于30 ℃、180 r/min 搖床上振蕩培養，采用可見分光光度法每間隔2 h 測定其OD600值，共測定16 個點，每個檢測點設置3 個重復，繪制其生長曲線。

1.7.2 單因素試驗篩選最佳發酵條件 前期試驗已確定拮抗菌W-5 生長的最佳培養基為NYBD，以此為基礎比較不同溫度(26、28、30、32、34 ℃)、pH 值(2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5)、接種量(1%、3%、5%、7%、9%、11%)、 轉速(140、160、180、200、220 r/min )4 個因素對拮抗菌W-5 生長的影響，以其OD600峰值為指標確定最佳單因素發酵條件。

1.7.3 響應面法確定最佳因素組合 在1.7.2 試驗基礎上，選取溫度、pH 值、轉速和接種量為自變量，以拮抗菌株W-5 發酵液OD600為響應值進行響應面組合試驗，以1、0、-1 表示4 個因素的高低水平進行四因素三水平的響應面分析。 試驗因素和水平見表1。 利用Design Expert 11 軟件進行響應面設計(表2)，優化拮抗菌W-5 的最佳發酵條件。

表1 優化拮抗菌W-5 發酵培養條件因素與水平的響應面設計

表2 響應面法設計方案和結果

1.8 數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2007 對數據進行處理與分析及作圖，響應面結果采用Design Expert 11 軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌W-5 的形態特征及革蘭氏染色結果分析

拮抗菌W-5 在LB 固體培養基中32 ℃培養2 d，于光學顯微鏡和體視顯微鏡下觀察菌落形態，結果(圖1)顯示，菌落較大為乳白色且不透明，邊緣不規則，表面粗糙且有褶皺，革蘭氏染色為陽性菌。

圖1 拮抗菌W-5 的形態特征及革蘭氏染色結果

2.2 平板透明圈法檢測拮抗菌W-5 產酶能力和嗜鐵素檢測

三種胞外酶檢測結果顯示，拮抗菌W-5 在蛋白酶、纖維素酶檢測培養基中均可產生較大的降解圈(圖2A、B)，而在幾丁質酶檢測培養基中無降解圈產生。 CAS 檢測結果顯示有明顯的橙黃色嗜鐵素的螯合圈(圖2C)。

圖2 拮抗菌W-5 產酶培養基和嗜鐵素培養基的檢測

2.3 拮抗菌W-5 對腐皮鐮刀菌的拮抗效果及對病原菌前端菌絲生長的影響

培養5 d 后的腐皮鐮刀菌菌落直徑為110.0 mm (圖3A)，接種拮抗菌W-5 的病原菌菌落直徑為24.0 mm (圖3B)，抑制率高達82.7%。 體視顯微鏡下觀察拮抗菌W-5 對腐皮鐮刀菌前端菌絲生長的影響，結果顯示，未接種拮抗菌的病原菌菌絲前端呈放射狀且菌絲濃密蓬松、粗細均勻(圖3C)，接種拮抗菌W-5 的病原菌菌絲前端稀薄、扭曲成畸形，失去了延伸性(圖3D)。 以上結果說明拮抗菌W-5 對花椒根腐病病原菌腐皮鐮刀菌確有抑制作用且效果良好。

圖3 菌株W-5 對腐皮鐮刀菌的拮抗效果及對病原菌前端菌絲生長的影響

2.4 拮抗菌W-5 對病原真菌抑菌譜的檢測結果分析

為進一步檢測拮抗菌W-5 對其他植物病原菌的抑菌活性，采用平板對峙法檢測其對5 種病原真菌的抑菌效果，結果顯示，拮抗菌W-5 對藤倉赤霉菌的抑制率為74.3%(圖4A)，對禾谷鐮刀菌的抑制率為74.6%(圖4B)，對梅毒鐮刀菌的抑制率為62.5%(圖4C)，對松針刺盤孢菌的抑制率為70.3%(圖4D)，對層生鐮刀菌的抑制率為71.4%(圖4E)。 表明拮抗菌株W-5 有較為廣泛的抑菌活性，具有一定的開發潛力。

圖4 拮抗菌W-5 對病原真菌的廣譜抑菌效果

2.5 拮抗菌W-5 離體拮抗結果分析

為再次驗證拮抗菌W-5 對花椒根腐病病原菌的抑制效果，進行了花椒根片的離體拮抗試驗，結果表明:花椒根片在接種無菌水培養7 d 后依然保持原有色澤，無異味產生，根皮與木質部不發生分離，根片周圍也無液體產生(圖5A)；培養3 d 后接種腐皮鐮刀菌的花椒根片則開始變軟發黑，逐漸產生病癥，且病原菌菌絲纏繞在花椒根片周圍，產生的液體使濾紙變色，根皮和木質部發生分離，同時有臭味產生，且病癥與大田中典型花椒根腐病的病癥相同(圖5B)；而接種拮抗菌W-5和病原菌的花椒根片發病癥狀與圖5B 相比，發病癥狀減輕，根片顏色較淺且未出現變軟現象，根皮和根片未發生完全分離(圖5C)。 說明離體狀態下拮抗菌W-5 對花椒根腐病病原菌仍有良好的拮抗效果，與2.3 中的結果一致。

圖5 拮抗菌W-5 對花椒根片的離體拮抗作用

2.6 拮抗菌W-5 的分子生物學鑒定和系統發育樹構建

采用通用引物對拮抗菌W-5 進行分子生物學鑒定，結果顯示:PCR 擴增有效片段的大小為1 480 bp。 對得到的測序結果進行BLAST 比對，選取數據庫中與拮抗菌W-5 相近的15 個菌株進行系統發育樹構建，發現菌株W-5 與HE659512.1 的親緣關系最近，同屬于枯草芽孢桿菌屬，結合其形態特征初步確定拮抗菌W-5 為枯草芽孢桿菌(圖6)。

圖6 基于16S rDNA 基因構建的拮抗菌W-5 系統發育樹

2.7 響應面法優化拮抗菌W-5 發酵條件的參數

2.7.1 拮抗菌W-5 生長曲線繪制與分析 菌株W-5 生長曲線(圖7)顯示，接種0 ～16 h 之間其生長速率較快，16～22 h 之間生長進入穩定期，22 h 后生長速率逐漸降低，故將拮抗菌W-5 的最佳生長周期確定為22 h。

圖7 拮抗菌W-5 生長曲線

2.7.2 拮抗菌W-5 單因素試驗結果分析 圖8為pH 值、溫度、接種量、轉速4 個發酵因素對拮抗菌株W-5 生長的影響結果。 pH 值在2.5～10.5之間菌株W-5生長呈現先快后慢的狀態；pH值在5.5～9.5 之間菌株生長良好，表明弱堿性條件下其依然具有一定的生長能力，即具有一定的耐堿性；pH 值為7.5 時其OD600達到峰值，因此確定該菌株生長的最佳pH 值為7.5。 溫度對菌株生長影響的結果顯示:26 ～34 ℃之間菌株均可生長，30 ℃為該菌的最佳生長溫度。 接種量在1%～11%之間，該菌生長良好，接種量為3%時其OD600達到峰值，因此確定3%為該菌的最佳接菌量。 搖床上轉速在140～220 r/min 之間菌株生長量呈現先升后降的狀態，180 r/min 時其OD600達到峰值，因此確定180 r/min 為最佳轉速。

圖8 不同發酵因素對拮抗菌株W-5 生長的影響

2.7.3 響應面法優化發酵條件結果分析 響應面法試驗設計和結果見表2。 通過響應面法獲得的方差分析結果(表3)來研究各因素對拮抗菌W-5發酵培養的影響，得出的回歸模型為:

表3 響應面試驗回歸方程方差分析

Y ＝1.94-0.0091A+ 0.0067B + 0.0168C +0.0195D+ 0. 0078AB + 0. 0257AC - 0. 0021AD +0.0544BC- 0.0217BD - 0.0516CD - 0. 2499A2-0.2650B2-0.3046C2-0.2700D2。

由該回歸方程分析及方差分析結果可知，回歸模型極顯著，說明該模型對響應值擬合良好；除AD、AB 項未達到顯著水平外，一次項B 對拮抗菌W-5 的OD600具有顯著水平，其余一次項、二次項、交互項(AC、BC、BD 和CD)對拮抗菌W-5 的OD600都達到極顯著水平，說明其OD600的變化復雜，各試驗因素對響應值不是簡單的線性關系。說明溫度、pH 值、接種量、轉速4 個因素對拮抗菌W-5的發酵培養工藝影響顯著或極顯著。 失擬度0.0601＞0.05，說明試驗點均能用該模型描述。 拮抗菌發酵培養工藝模型決定系數為R2＝0.9991，說明模型的相關性很好，并能較好地進行響應值的變化分析，確定最佳發酵條件。 經擬合檢驗后校正系數R2adj ＝0.9983，兩者非常接近，說明拮抗菌發酵培養響應面二次回歸擬合度很好。 信噪比Adeq Precision ＝104.3978＞4，說明該模型的試驗設計可靠，可信度較高，預測較為準確。 F 值分析結果顯示，對拮抗菌W-5 發酵的影響程度:轉速＞接種量＞溫度＞pH 值。

響應曲面坡度的陡峭與平緩能夠直接反映4個因素對OD600的影響，即可以直觀地反映出pH值、溫度、接種量、轉速對拮抗菌W-5 發酵培養的影響。 圖9 顯示，4 個因素之間的各個響應曲面均為凸型曲面且開口朝下，代表響應值有著極高值，而且曲面坡度都比較陡峭，說明其因子之間交互作用復雜。 各因素之間的交互作用對拮抗菌W-5 發酵培養的影響程度由大到小的順序為:CD＞BC＞AC＞BD＞AD，其中除AD、AB 項外，其余交互因素對拮抗菌W-5 OD600值的影響均達到極顯著水平。

圖9 菌株W-5 發酵中不同因素對OD600值影響的響應面圖

綜合以上試驗結果，可將拮抗菌W-5 發酵培養的最佳條件確定為:溫度31.3 ℃、pH 值7.5、接種量3.1%、轉速180.5 r/min，優化后的OD600值達到1.832。 考慮到生產實際情況及操作的便利性，將該菌的最佳發酵條件修正為:溫度31℃、接種量3.0%、pH 值7.5、轉速181 r/min。

3 討論與結論

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是自然界廣泛存在的重要生物防治微生物資源，植物病害防治中枯草芽孢桿菌(B. subtilis)被廣泛應用[18]。 據報道，篩選出的枯草芽孢桿菌對玉米圓斑病、煙草白粉病、水稻稻瘟病、西瓜枯萎病等植物病害均表現出良好的抑菌效果[19-22]。

本試驗從花椒根系土壤中分離獲得一株對花椒根腐病病原菌腐皮鐮刀菌具有良好抑制效果的拮抗細菌，編號W-5，形態學結合分子生物學鑒定其為枯草芽孢桿菌。 研究表明，拮抗菌W-5 對腐皮鐮刀菌的抑制率可達82.7%，體視顯微鏡下觀察其對腐皮鐮刀菌前端菌絲生長起到抑制作用；結合花椒根片的離體試驗結果說明，W-5 對供試5 種病原菌(禾谷鐮刀菌、梅毒鐮刀菌、藤倉赤霉菌、松針刺盤孢菌和層生鐮刀菌)均具有良好的抑菌效果，證實其具有廣泛的抑菌活性，可以作為生防菌的優良菌種資源開發利用。 拮抗菌W-5 胞外酶和產嗜鐵素能力檢測結果說明，該菌能夠很好地分泌蛋白酶和纖維素酶，且產嗜鐵素的能力極強。 生防菌的生防作用是通過生防菌產生胞外酶來降解病原菌的細胞壁而實現的[23]。微生物產生的嗜鐵素能夠與病原微生物競爭鐵營養，從而達到阻礙病原菌生長即實現生物防治的效果[24]。 以上試驗結果表明，枯草芽孢桿菌W-5 在花椒根腐病的防治方面具有良好的開發與應用前景。

采用響應面法優化拮抗菌發酵條件能更好地挖掘其拮抗作用，優化后的發酵體系不但能夠提高菌株活菌量，而且能使菌株產生更多的抑菌代謝產物，從而提高生防效果[25]。 本研究以OD600值作為菌株W-5 的考量指標，采用Box-Behnken設計并結合響應面法分析優化菌株的發酵條件，得出:在綜合考慮前期試驗結果的基礎上確定溫度31.3 ℃、pH 值7.5、接種量3.1%、轉速180.5 r/min為該菌的最佳發酵參數，在此條件下其OD600值可達1.832。 這驗證了響應面法對發酵條件優化的可行性。 優化后的發酵體系不但提高此菌的有效活菌數，而且從操作方面可降低發酵成本，可為菌株W-5 開發為微生物菌劑用于花椒根腐病的綠色防治提供一定的理論參考。