植物bHLH基因家族研究進(jìn)展及在藥用植物中的應(yīng)用前景

安昌 陸琳 沈夢千 陳盛圳 葉康卓 秦源， 鄭平

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基因組與生物技術(shù)中心，福州 350002；2. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004；3. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002）

外界環(huán)境因子如光照、氣候、土壤等持續(xù)影響著植物的生長和發(fā)育，植物通過基因的特異性表達(dá)來響應(yīng)外界環(huán)境的變化［1］。轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控基因表達(dá)的級(jí)聯(lián)控制開關(guān)，可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控或影響植物的許多生物過程［2］。藥用植物在長期適應(yīng)各類生長環(huán)境的過程中，發(fā)生了一系列的基因表達(dá)調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，逐漸形成了許多獨(dú)特的生活型。近些年，“中藥生態(tài)農(nóng)業(yè)” “藥用植物擬境栽培”等中藥栽培新模式的提出［3-4］，各種藥用植物生長發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究不斷取得新進(jìn)展，闡述藥用植物適應(yīng)環(huán)境脅迫的策略及其對(duì)中藥材品質(zhì)形成的影響，推動(dòng)中藥生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展，是中藥現(xiàn)代化研究的新方向和新任務(wù)［5］。在藥用植物中，影響其活性成分生物合成及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制通常是復(fù)雜且多層次的。因此，許多轉(zhuǎn)錄因子家族成員陸續(xù)被人們關(guān)注并研究。大量報(bào)道證明，MYB、bHLH、AP2/ERF、WRKY和bZIP等轉(zhuǎn)錄因子家族在植物生長發(fā)育和非生物脅迫條件下發(fā)揮重要作用［6］，是調(diào)控植物中許多生物過程信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分。

在植物中，bHLH是繼MYB之后的第二大轉(zhuǎn)錄因子家族，具有多種生物學(xué)功能，其通過與相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物的適應(yīng)性反應(yīng)，在調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、非生物脅迫及代謝網(wǎng)絡(luò)的響應(yīng)中發(fā)揮作用［7］，是參與藥用活性成分合成的重要家族。在中藥研究中，道地藥材是指產(chǎn)在特定地域，與其他地區(qū)所產(chǎn)的同種中藥材相比，品質(zhì)和療效更好的中藥材［8］，不難看出，其原植物是長期適應(yīng)特定環(huán)境的生態(tài)型，且次生代謝產(chǎn)物的含量是評(píng)價(jià)藥用植物質(zhì)量的重要指標(biāo)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作為環(huán)境信號(hào)和活性成分合成之間的橋梁，可以很好地解釋道地藥材的“逆境效應(yīng)”。因此，深入了解植物bHLHs等轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的次生代謝產(chǎn)物分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)促進(jìn)藥用植物的分子育種、品種改良及農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)的發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義，同時(shí)可為道地藥材形成機(jī)制的探討提供新思路。

1 植物中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子

1.1 bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)特征

轉(zhuǎn)錄因子（TFs），也被稱為反式作用因子，是一類專門與真核生物基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合的蛋白質(zhì)。它們?cè)谵D(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)細(xì)胞的特定生理或生化過程，因此在生物體的不同發(fā)育階段發(fā)揮著重要作用。bHLHs是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，它們廣泛分布于真核生物中。自1989年首次發(fā)現(xiàn)bHLH以來，許多bHLH轉(zhuǎn)錄因子已在動(dòng)物、植物和真菌中被發(fā)現(xiàn)［9］。bHLH轉(zhuǎn)錄因子因其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)而被命名，所有的bHLH轉(zhuǎn)錄因子都有一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，包含大約50-60個(gè)氨基酸（aa），由兩個(gè)子區(qū)域/保守基序組成：一個(gè)是堿性DNA結(jié)合區(qū)（basic DNA binding region, b），另一個(gè)是螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)（helix?loop?helix region, HLH）。參與DNA結(jié)合的堿性區(qū)域（b）位于bHLH結(jié)構(gòu)域的N端，長度為10-15個(gè)氨基酸不等，能夠識(shí)別并特異性結(jié)合下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控元件E?box（5′?CANNTG?3′）或 G?box（5′?CACGTG?3′）；HLH結(jié)構(gòu)域位于C端，主要包括兩個(gè)含有疏水殘基的α螺旋和一個(gè)長度不等的氨基酸環(huán)，該區(qū)域由大約40-50個(gè)氨基酸殘基組成，是與其他轉(zhuǎn)錄因子形成同源二聚體或異源二聚體的基本結(jié)構(gòu)（圖1）。

圖1 黃花蒿bHLH家族成員結(jié)構(gòu)域特征與分布Fig. 1 Domain characteristics and distribution of bHLH family members from A. annua

1.2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的分類

bHLH轉(zhuǎn)錄因子最早在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，在接下來的深入研究中，根據(jù)其組織分布、二聚化能力和DNA結(jié)合特性等，將bHLH分為6個(gè)組（A-F組）［10］。植物中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子最早在玉米（Zea mays）中被鑒定［11-12］，同時(shí)廣泛存在于各類植物中，大多數(shù)植物的bHLH與B組的關(guān)系更為密切［13］。早在2003年，Toledo?Ortiz等［14］就將從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中鑒定出的147個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因劃分為21個(gè)亞家族。隨著分子生物學(xué)及生物信息學(xué)學(xué)科的發(fā)展，越來越多不同植物的bHLH轉(zhuǎn)錄因子被報(bào)道，尤其是非典型性（novelatypical）的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的鑒定使得該家族成員具有越來越豐富的多樣性［15-16］，目前，更多的是基于系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分類，2010年Carretero?Paulet等［17］對(duì)擬南芥、白楊（Populus trichocarpa）、水稻（Oryza sativa）、小立碗蘚（Physcomitrella patens）和5種藻類（algae）的全基因組的bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了全面的系統(tǒng)發(fā)育分析，將鑒定出的638個(gè)bHLH基因分為32個(gè)亞家族，并且定義了植物bHLH的保守區(qū)域，這為將來鑒定新的bHLH轉(zhuǎn)錄因子提供了堅(jiān)實(shí)的框架。近年來，得益于基因家族分析的成熟開展，bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的報(bào)道日益增多，涉及的物種也逐漸廣泛，覆蓋蕨類、裸子及被子植物中的40余個(gè)物種［18］。在不同植物中，所鑒定得到的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目差異明顯（圖2），如Hong等［19］從紅花（Carthamus tinctorius）中鑒定出41個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員；Shen等［20］從歐洲油菜（Brassica napus）中鑒定出了460個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員?？傊罅縝HLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定為其結(jié)構(gòu)及功能的研究提供了豐富的基礎(chǔ)材料。

圖2 部分種子植物中bHLH家族成員個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig. 2 Statistics of the number of bHLH family members in vascular plants

2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的功能研究

在不同植物中，已經(jīng)有許多bHLH家族成員的功能被分析，擬南芥中約有30%的bHLH已在不同程度上進(jìn)行了功能鑒定［21］。家族成員中序列結(jié)構(gòu)雖然具有共同特征，但在植物中發(fā)揮的功能作用存在著較大差異，作用于靶基因后所具有的生物學(xué)作用也存在較大差異，這使得 bHLH家族成員具有多種生物學(xué)功能，并能廣泛地參與到植物生命活動(dòng)中［22］。例如在花生（Arachis hypogaea）中鑒定出61個(gè)bHLH參與豆莢的發(fā)育及地下部分的特異性生長［23］。在蓮（Nelumbo nucifera）中預(yù)測了69個(gè)NnbHLH的功能，主要與發(fā)育生理和脅迫響應(yīng)有關(guān)［24］。在人參（Panax ginseng）中發(fā)現(xiàn)至少6個(gè)bHLH參與人參皂苷生物合成的調(diào)控［25］。以上這些研究為深入了解bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族在植物中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。但應(yīng)該清楚的是，目前bHLHs的研究更多的是停留在家族成員的鑒定和表達(dá)分析上，其中大多數(shù)的生理作用和調(diào)節(jié)功能還有待進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

2.1 調(diào)控生長發(fā)育

植物生理與轉(zhuǎn)錄調(diào)控息息相關(guān)，bHLHs參與許多生長和發(fā)育過程，包括種子萌發(fā)、花器官發(fā)育及側(cè)根的生長等。果實(shí)的發(fā)育是由復(fù)雜的細(xì)胞和分子事件參與完成的［26］。Zhu等［27］報(bào)道番茄（Solanum lycopersicum）中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子SlPRE2可通過調(diào)節(jié)果皮細(xì)胞的分裂，增大果皮厚度進(jìn)而影響果實(shí)大小，是果實(shí)發(fā)育的調(diào)控因子；SlPRE2高表達(dá)品系的果實(shí)直徑略有增加，而功能缺失品系的果實(shí)大小略有減?。?8］，同時(shí)，其在草莓（Fragaria × ananassa）中的同源物FaPRE1可以激活與花托成熟過程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)草莓的成熟［16］。在甜瓜（Cucumis mleo）中，bHLH傾向于在果實(shí)發(fā)育早期表達(dá)，然而CmbHLH9和CmbHLH114的表達(dá)在成熟期至收獲期階段樣品中上調(diào)，過表達(dá)CmbHLH32的轉(zhuǎn)基因甜瓜與野生型相比，果實(shí)存在早熟現(xiàn)象［29］。蘋果（Malus domestica）中的MdbHLH3直接結(jié)合MdcyMDH（蘋果細(xì)胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶）的啟動(dòng)子，激活其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而促進(jìn)蘋果酸在蘋果果實(shí)中的積累［30］；此外，MdbHLH3的過表達(dá)增加了蘋果葉片的光合能力和碳水化合物水平，通過調(diào)節(jié)碳水化合物從源（葉片）到庫（果實(shí)）的分配，也增強(qiáng)了果實(shí)中碳水化合物的積累。根是植物的重要器官，高等植物具有形成側(cè)根的能力，以高效地獲取水分和養(yǎng)分，而側(cè)根發(fā)育的主要來源是位于根系中柱最外層的中柱鞘細(xì)胞（pericycle cells）。研究表明，中柱鞘細(xì)胞形成后會(huì)長時(shí)間保持細(xì)胞分裂能力，從而使得植物能夠響應(yīng)環(huán)境變化靈活地形成側(cè)根，Zhang等［31］揭示了bHLH轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)中柱鞘細(xì)胞形成側(cè)根原基的機(jī)制，PFA和PFB可以結(jié)合成二聚體，進(jìn)而形成正反饋回路調(diào)控鄰近木質(zhì)部極的中柱鞘（xylem pole pericycle）細(xì)胞的分裂潛力，在側(cè)根原基的形成中發(fā)揮重要作用。另外，SPT是擬南芥中重要的、功能發(fā)散的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與一系列植物發(fā)育過程［32-34］。在擬南芥中SPT可以限制細(xì)胞的增殖和擴(kuò)張［35］。SPT的突變體可以使主根發(fā)育得更長，同時(shí)還會(huì)出現(xiàn)其他多效性表型，例如更多的花、更短的節(jié)間和更長的花期［36］。果實(shí)類藥材來源于完整的果實(shí)或果實(shí)的一部分，應(yīng)用較廣。如大棗、山楂等藥食同源藥材；枸杞、梔子等常用大宗藥材。在中藥商品流通中，果實(shí)類藥材的質(zhì)量主要體現(xiàn)在果實(shí)的形狀及大小，因此，對(duì)其原植物果實(shí)生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制的研究具有重要意義；另外，藥用植物的根作為次生代謝產(chǎn)物主要積累的器官，其大小是根類藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，探究藥用植物根系形態(tài)建成的機(jī)制可為其定向育種提供理論指導(dǎo)。這些報(bào)道可為根莖類、果實(shí)類藥材的研究提供新的視角。

2.2 響應(yīng)非生物脅迫

近年來，環(huán)境問題制約著我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展，分析藥用植物栽培面臨的主要脅迫類型，是中藥生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要內(nèi)容。同時(shí)，研究藥用植物響應(yīng)脅迫的策略，不僅可以了解藥用植物生物學(xué)特性，還可以闡明藥用植物品質(zhì)形成的機(jī)制，從而為認(rèn)識(shí)和理解藥用植物栽培模式提供新思路。

2.2.1 bHLH與植物的抗旱性 干旱是嚴(yán)重限制全球農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的主要環(huán)境因素。bHLH響應(yīng)干旱脅迫，參與提高植物對(duì)缺水環(huán)境的耐受性。研究發(fā)現(xiàn)，bHLH誘導(dǎo)的植物抗旱性增強(qiáng)一般與脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及活性氧（ROS）的清除有關(guān)［37］。例如，在保衛(wèi)細(xì)胞中高表達(dá)的AtbHLH122可以抑制脫落酸的分解代謝，從而通過增加脫落酸的含量來增強(qiáng)擬南芥的抗旱性［38］。在小麥（Triticum aestivum）中，TabHLH1基因的過表達(dá)可以改變植物干旱脅迫下的氣孔運(yùn)動(dòng)、葉片失水率等生長特征，調(diào)節(jié)脫落酸途徑來提高干旱適應(yīng)性［39］。在水稻中，OsbHLH148可以作為茉莉酸信號(hào)模塊的一個(gè)組成部分賦予水稻耐旱性，過表達(dá)的OsbHLH148可以提高其抗旱性［40-41］?；ㄉ械腁hbHLH112與過氧化物酶（POD）基因的啟動(dòng)子直接、特異地結(jié)合并激活，從而減少活性氧的積累，同時(shí)提高脫落酸水平來增強(qiáng)抗旱性［42］。此外，bHLH還可以通過調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、氣孔運(yùn)動(dòng)、光合作用和氧化應(yīng)激等來響應(yīng)植物的干旱脅迫。例如，蘋果中的MdbHLH130在煙草中過表達(dá)，可通過調(diào)節(jié)不同途徑提高煙草（Nicotiana tabacum）對(duì)水分脅迫的耐受性，包括上調(diào)活性氧（ROS）清除相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)氣孔的關(guān)閉［43］。另外，一些物種的基因在擬南芥中的異源表達(dá)也可以提高擬南芥植株的抗旱性，過表達(dá)胡楊（Populus euphratica）中PebHLH35基因的擬南芥可以通過調(diào)節(jié)氣孔密度、氣孔開度和蒸騰速率使水分損失減少，同時(shí)提高葉綠素含量和光合作用速率來對(duì)抗干旱脅迫，且過表達(dá)PebHLH35擬南芥植株在水分充足的條件下，主根更長、葉片更多、葉面積更大［44］。密羅木（Myrothamnus fla?bellifolia）的MfbHLH38基因在擬南芥中的異源表達(dá)可以通過調(diào)節(jié)滲透平衡，增強(qiáng)脅迫誘導(dǎo)的ROS清除系統(tǒng)，提高干旱脅迫下脫落酸的水平，上調(diào)與脫落酸生物合成和脫落酸響應(yīng)相關(guān)的基因，從而顯著提高擬南芥的耐旱性［45］；剛毛檉柳（Tamarix hispida）中ThbHLH1、枳（Poncirus trifoliata）中PtrbHLH66的研究也得到了類似的結(jié)果［46-47］。此外，bHLH家族成員是否通過調(diào)控特定基因的表達(dá)提高植物的抗旱能力，也是目前的一大研究方向，Liu等［48］研究發(fā)現(xiàn)小麥TabHLH49正向調(diào)控小麥脫水WZY2的表達(dá)，增強(qiáng)小麥的抗旱性；同樣Gu等［49］的研究結(jié)果表明，干旱可以誘導(dǎo)水稻OsbHLH130的積累，進(jìn)而激活 OsWIH2的表達(dá)，通過參與角質(zhì)層蠟質(zhì)的生物合成，降低失水率和活性氧積累，提高水稻的抗旱性。這些結(jié)果表明，bHLHs在植物抗旱性中起重要作用，可為作物抗旱性研究提供新的研究方向。

2.2.2 bHLH與植物耐鹽性 bHLH轉(zhuǎn)錄因子通過影響植物的滲透平衡，來調(diào)節(jié)植物對(duì)鹽脅迫的耐受性。植物通常采取兩種滲透調(diào)節(jié)策略來響應(yīng)高鹽環(huán)境，一是調(diào)節(jié)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)；二是合成積累有機(jī)小分子物質(zhì)如脯氨酸、抗壞血酸和黃酮類化合物等。鈣被認(rèn)為是介導(dǎo)鹽脅迫信號(hào)通路的第二信使，在植物中，第一個(gè)被鑒定的與耐鹽性有關(guān)的bHLH基因AtNIG可以與參與鈣離子結(jié)合介導(dǎo)鹽脅迫信號(hào)的響應(yīng)［50］。AtMYC2和AtbHLH122可以作為上游基因調(diào)控Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，進(jìn)而提高擬南芥的耐鹽性［38,51］，其中，AtMYC2還可通過調(diào)節(jié)脯氨酸的生物合成來實(shí)現(xiàn)高鹽環(huán)境的適應(yīng)［52］。在水稻中，OrbHLH001在耐鹽性方面起著積極的調(diào)節(jié)作用，過表達(dá)OrbHLH001可以激活OsAKT1（弱整流鉀離子通道），從而改變鹽脅迫下水稻根系的離子通量（Na+/K+），增強(qiáng)對(duì)鹽脅迫的耐受性。在其他作物中，辣椒CabHLH035通過影響細(xì)胞內(nèi)Na+/K+的比值和脯氨酸的生物合成，在耐鹽性中發(fā)揮重要作用［53］。葡萄（Vitis vinifera）的VvbHLH1基因在擬南芥中過表達(dá)，可以顯著增加黃酮類化合物的積累并增強(qiáng)其抗旱性［54］。在玉米中，ZmbHLH55通過直接調(diào)節(jié)抗壞血酸生物合成相關(guān)基因的表達(dá)來增加抗壞血酸的積累，從而提高玉米的耐鹽性［55］。值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)bHLH既可以正向調(diào)節(jié)又可以負(fù)向調(diào)節(jié)植物對(duì)鹽脅迫的耐受性［56-57］。SbbHLH85是高粱（Sor?ghum bicolor）根系發(fā)育的關(guān)鍵基因，過表達(dá)SbbHLH85可以激活A(yù)BA和生長素信號(hào)通路導(dǎo)致根毛數(shù)量和長度顯著增加，增加Na+的吸收；酵母雙雜交和BiFC實(shí)驗(yàn)均證實(shí)SbbHLH85可以和SbPHF1（磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1）相互作用，破壞鹽脅迫下植物體內(nèi)磷的運(yùn)輸和積累，加劇了高鹽引起磷的不均勻分布，大大降低高粱的耐鹽性［58］。目前，土壤鹽漬化已成為全球性問題，我國鹽土面積大、范圍廣，培育耐鹽性高的作物品種在鹽堿土壤上的種植，既可以充分利用土地資源，改善土壤的生態(tài)環(huán)境，又可增加作物的總產(chǎn)量。

2.2.3 bHLH轉(zhuǎn)錄因子與植物低溫逆境 低溫脅迫是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域最重要的災(zāi)害之一，持續(xù)的低溫會(huì)損害植物組織結(jié)構(gòu)和生理功能，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大影響。bHLH轉(zhuǎn)錄因子可以通過ICE?CBF?COR途徑在植物應(yīng)對(duì)低溫逆境中發(fā)揮作用。Chinnusamy等［59］從擬南芥中成功分離出bHLH轉(zhuǎn)錄因子ICE1，與CBF3基因啟動(dòng)子序列中的MYC識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，在擬南芥中過表達(dá)ICE1能夠增加CBF3基因表達(dá)，提高植株對(duì)低溫脅迫的耐受性。在擬南芥中過表達(dá)山葡萄（Vitis amurensis）的兩個(gè)bHLH基因VaICE1和VaICE2，可顯著誘導(dǎo)下游冷響應(yīng)基因CBF1、COR15A和COR47的表達(dá)，增強(qiáng)擬南芥的耐寒性［60］。IbbHLH79是一個(gè)在番薯（Ipomoea batatas）中高效表達(dá)的ICE1樣基因，可以激活CBF途徑；且過表達(dá)IbbHLH79的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐冷性［61］。同樣，在水稻中過量表達(dá)AtICE1可上調(diào)CBF/DREB途徑相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫脅迫的耐受性［62］。蘋果中鑒定出的MdCIbHLH1，煙草中發(fā)現(xiàn)的NtbHLH123，均能上調(diào)CBF2基因的表達(dá)，進(jìn)而增加植物的耐旱性。在其他植物中，同樣存在許多受低溫逆境特異性誘導(dǎo)的bHLH，如水稻中的OsbHLH1，苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）中的FtbHLH2等［63］。Yang等［64］以龍眼（Dimocarpus longan）為材料，研究了CBF基因誘導(dǎo)子DlICE1的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，其在擬南芥中的過表達(dá)可增加幼苗中的脯氨酸含量，降低丙二醛含量，從而提高擬南芥的耐冷性，此外，低溫下MdbHLH3通過增加花青素的積累來提高蘋果的耐寒性［30］。在中藥農(nóng)業(yè)中，許多南方的特色藥材因山地丘陵等地理環(huán)境，很難開展大批量種植，這限制了中藥種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，突破原有農(nóng)業(yè)氣候劃區(qū)的限制，適當(dāng)將種植帶北移可以擴(kuò)大藥材產(chǎn)量，但需要克服持續(xù)的低溫脅迫。在植物適應(yīng)低溫脅迫的過程中，其體內(nèi)發(fā)生了一系列分子水平的反應(yīng)，這些反應(yīng)按照有序的時(shí)空順序發(fā)生，相互聯(lián)系，形成了一整套低溫應(yīng)答的分子機(jī)制。了解植物低溫應(yīng)答的分子機(jī)制可為藥用植物往北種植拓展奠定基礎(chǔ)。

2.3 參與重金屬的平衡與穩(wěn)態(tài)

重金屬殘留會(huì)嚴(yán)重制約作物的生長和生產(chǎn)力［65］，現(xiàn)今環(huán)境污染日益加劇，研究植物對(duì)重金屬的生理響應(yīng)和代謝的分子機(jī)制尤其重要。近年來，不斷有研究證明bHLH廣泛參與鐵穩(wěn)態(tài)，在擬南芥中鐵吸收主要受到bHLH 轉(zhuǎn)錄因子FIT的調(diào)控，且至少涉及16個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，它們通過形成錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)緊密參與到鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)［66-67］，例如bHLH轉(zhuǎn)錄因子ILR3和PYE可以在鐵脅迫下幫助植物細(xì)胞形成光保護(hù)作用，并改變?nèi)~綠體形態(tài)，阻止有害的活性氧（ROS）生成，加快光系統(tǒng)II的修復(fù)［68］。不同植物的不同bHLH成員在缺鐵調(diào)控中發(fā)揮不同的作用。如菊花（Chrysanth?emum morifolium）中CmbHLH1通過H+?ATP酶介導(dǎo)的根際酸化促進(jìn)鐵的吸收。在缺鐵條件下，NtbHLH1的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致根系變長、根際pH值改變，并增加鐵?；€原酶活性，進(jìn)而激活缺鐵反應(yīng)基因的表達(dá)［69］。研究表明，GmbHLH57和GmbHLH300的過表達(dá)上調(diào)了參與鐵吸收相關(guān)基因的表達(dá)，并增加了轉(zhuǎn)基因大豆（Glycine max）植株的鐵含量［70］。鐵相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子IRO2已被確定為水稻鐵吸收的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)OsbHLH156可與IRO2形成協(xié)同互作模式，在鐵穩(wěn)態(tài)中的發(fā)揮作用［71］。Wang等［72］報(bào)道指出057在側(cè)根中高表達(dá)，并參與維持鐵的動(dòng)態(tài)平衡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OsbHLH061可通過與OsPRI1相互作用并招募轉(zhuǎn)錄抑制輔助因子OsTPL/TPRs來抑制關(guān)鍵下游基因OsIRO2和OsIRO3的轉(zhuǎn)錄，從而抑制鐵在水稻地上部的積累［73］。鎘（Cd）是一種廣泛存在于環(huán)境中的重金屬，在Cd脅迫下bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因（FIT、 AtbHLH38和AtbHLH39）會(huì)協(xié)同MSR3的表達(dá)，參與提高擬南芥對(duì)Cd的耐受性［74］。大豆GmORG3 可以通過增加光合作用系統(tǒng)的穩(wěn)定性來降低Cd脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株的傷害，并增加葉片葉綠素含量［75］。宋倩［76］發(fā)現(xiàn)，GmbHLH30在煙草中的過度表達(dá)，可以通過維持滲透壓來增強(qiáng)其鋁耐受性。在酸性土壤中，錳毒性也是限制作物產(chǎn)量的一個(gè)重要因素，研究發(fā)現(xiàn)ZmbHLH105可能通過調(diào)節(jié)抗氧化機(jī)制，來調(diào)節(jié)植物體內(nèi)ROS清除和Mn/Fe相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，提高玉米對(duì)錳脅迫的耐受性［77］。近年來，國內(nèi)外中藥材市場需求旺盛，許多藥用植物開始像水稻、果蔬等作物一樣，進(jìn)行農(nóng)業(yè)化人工種植。現(xiàn)階段，農(nóng)殘、重金屬超標(biāo)等問題已嚴(yán)重影響了中藥材安全性，成為制約中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大瓶頸。進(jìn)一步闡明植物對(duì)重金屬等脅迫的響應(yīng)機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，定向選育高耐受性、強(qiáng)代謝性的優(yōu)質(zhì)藥用植物品種，有助于進(jìn)一步提高中藥產(chǎn)業(yè)的整體發(fā)展質(zhì)量與效益。

2.4 參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成

除了在生長發(fā)育中發(fā)揮作用外，植物通過產(chǎn)生廣泛的具有生物活性的專門代謝物來應(yīng)對(duì)壓力。bHLH還在植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成過程中發(fā)揮重要作用，包括黃酮類、萜類、生物堿類、酚酸類等的生物合成［78］?；ㄇ嗨貙儆邳S酮類化合物，是作物果蔬的主要呈色物質(zhì)，同時(shí)也是保健活性物質(zhì)。以擬南芥為例，研究證明AtTT8（Transparent Testa突變）是植物體內(nèi)花青素合成的關(guān)鍵酶基因［79］，其表達(dá)調(diào)控是黃酮類相關(guān)基因表達(dá)特異性激活的重要調(diào)控步驟，可以誘導(dǎo)花青素的合成［80］。在蓮和細(xì)莖石斛（Dendrobium candidum）中的同源基因也表現(xiàn)出誘導(dǎo)活性［81-82］。在牡丹（Paeonia ×suffruticosa）中，花青素的生物合成受PsbHLH1正向調(diào)控，PsbHLH1可直接與二氫黃酮醇4?還原酶（PsDFR）和花青素合成酶（PsANS）基因的啟動(dòng)子結(jié)合，轉(zhuǎn)錄激活它們的表達(dá)［83］，這為牡丹新品種的分子育種奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。在桑（Morus alba）中，MabHLH3是調(diào)控果實(shí)顏色形成的關(guān)鍵基因，其異常表達(dá)可破壞花青素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的平衡，打亂桑樹果實(shí)的色素組成［84］。bHLH對(duì)下游基因除了多被表征的激活現(xiàn)象，還存在阻遏現(xiàn)象，蠟梅（Chimonanthus praecox）中CpbHLH1基因抑制擬南芥中花青素的積累［85］；丹參（Salvia miltiorrhiza）中SmbHLH92在其根和韌皮部中高表達(dá)，在SmbHLH92?RNAi轉(zhuǎn)基因株系的毛狀根中，丹參酚酸和丹參酮的含量顯著增加，表明SmbHLH92是參與調(diào)節(jié)丹參酚酸和丹參酮生物合成的負(fù)調(diào)控因子［86］，而SmbHLH10可以直接與丹參酮途徑基因啟動(dòng)子中的G?box結(jié)合，激活其表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)丹參酮的生物合成［87］。此外，在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中鑒定出2個(gè)JA誘導(dǎo)的bHLH基因TSAR1和TSAR2，可以通過不同的激活模式激活MVA途徑的相關(guān)基因，導(dǎo)致三萜皂苷含量增加［88］。bHLH還調(diào)控植物中生物堿類成分的生物合成［89］，在日本黃連（Coptis japonica）中，CjbHLH1在體內(nèi)與IQA生物合成基因的啟動(dòng)子序列直接相互作用，激活相應(yīng)的通路，進(jìn)而導(dǎo)致生物堿類成分的特異性積累；研究還發(fā)現(xiàn)，CjbHLH1的同源物只在產(chǎn)生IQA的植物物種中發(fā)現(xiàn)，這對(duì)藥用植物的研究具有重要參考價(jià)值。另有研究表明，PlbHLH79/148/149是最有可能參與粉葛（Pueraria montana var. thomsonii）中葛根素生物合成途徑的候選基因［90］；杏仁（Prunus domestica）中PdbHLH2參與了苦杏仁苷的生物合成［91］。植物的次生代謝在植物適應(yīng)環(huán)境、生物間信息交流以及協(xié)同進(jìn)化過程中發(fā)揮重要作用，藥用植物在遭受脅迫后各項(xiàng)生理生化指標(biāo)發(fā)生的變化以及次生代謝產(chǎn)物的積累，是評(píng)價(jià)藥用植物品質(zhì)的重要依據(jù)。進(jìn)一步研究bHLH的功能，對(duì)于系統(tǒng)闡釋藥用植物有效成分的積累、道地藥材的成因，以及藥用植物資源合理開發(fā)利用等具有重要意義。

3 bHLH轉(zhuǎn)錄因子在藥用植物中的研究

藥用植物中的高價(jià)值活性成分因其對(duì)人類健康的益處而受到研究關(guān)注，例如抗瘧疾的青蒿素、抗心血管疾病的丹參酮等［92］。目前，有關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究還集中在各類重要作物上，對(duì)于藥用植物的研究仍涉及較少。我國是藥用植物資源豐富的國家之一，對(duì)藥用植物的栽培、采收和加工有著悠久歷史。隨著基因組學(xué)和現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，藥用植物的功能基因組學(xué)研究與應(yīng)用變得極為重要。因此，本文對(duì)兩種常見且重要藥用植物中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，為藥用植物功能基因資源更深層次的開發(fā)和利用提供參考，對(duì)于藥用植物合成生物學(xué)及細(xì)胞工廠的應(yīng)用研究有著重要的意義。

3.1 丹參

丹參是較早發(fā)布全基因組的藥用植物，為其生命科學(xué)研究提供了系統(tǒng)的工具，以丹參作為藥用模式植物而開展的分子生物學(xué)研究、組學(xué)研究和代謝工程研究逐步深入。Zhang等［93］對(duì)丹參bHLH基因家族進(jìn)行了全基因組分析，共鑒定出127個(gè)ApbHLH基因，根據(jù)它們?cè)谌旧w上的物理位置和重疊群數(shù)量進(jìn)行了重新命名；通過系統(tǒng)發(fā)育分析，將它們劃分為25個(gè)亞家族；根據(jù)MeJA處理后的基因特異性表達(dá)模式和上調(diào)表達(dá)模式，揭示了7個(gè)bHLH基因可能參與丹參酮生物合成的調(diào)節(jié)；其中，SmbHLH37、SmbHLH74和SmbHLH92的基因表達(dá)與丹參酮生物合成及積累模式的規(guī)律一致，研究結(jié)果為進(jìn)一步了解丹參bHLH轉(zhuǎn)錄因子的分子基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。李林［94］從丹參中鑒定出一個(gè)參與丹酚酸和丹參酮調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子SmbHLH59。多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，SmbHLH59屬于IIIe亞家族成員，該家族的成員包括MYC2、MYC3、MYC4和MYC5，它們協(xié)同調(diào)控JA介導(dǎo)的植物次生代謝產(chǎn)物的積累；表達(dá)模式分析表明，SmbHLH59在丹參葉中高表達(dá)，而且受到MeJA的誘導(dǎo)，說明SmbHLH59可能與JA信號(hào)和丹酚酸合成相關(guān)。隨后實(shí)驗(yàn)證明SmbHLH59通過結(jié)合E/G?box元件激活丹酚酸和丹參酮合成途徑上關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子，促進(jìn)丹參酮和丹參酚酸的積累，初步闡釋了SmbHLH59的分子機(jī)制。在擬南芥中，JA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要受到轉(zhuǎn)錄因子MYC2的影響［95］，Liu等［96］在丹參中鑒定并表征了由MeJA最為顯著負(fù)調(diào)控的新型bHLH轉(zhuǎn)錄因子SmbHLH60，并且SmbHLH60過表達(dá)毛狀根中的酚酸和花青素含量顯著降低，而通過CRISPR/Cas9敲除SmbHLH60則導(dǎo)致毛狀根中酚酸和花青素含量的顯著升高；另外，SmbHLH60的表達(dá)與酚酸和花青素濃度呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)，參與花青素和酚酸合成的關(guān)鍵基因在SmbHLH60敲除系中上調(diào)，而在SmbHLH60過表達(dá)株系中下調(diào)。在此基礎(chǔ)上，該研究進(jìn)一步解析了SmbHLH60 調(diào)節(jié)丹參中次級(jí)代謝過程的分子機(jī)制。結(jié)果顯示，SmbHLH60可以直接結(jié)合SmTAT1和SmDFR等靶基因的啟動(dòng)子抑制它們的表達(dá)并導(dǎo)致丹參中酚酸和花青素生物合成的顯著減少。此外，研究還揭示了SmbHLH60可以和 SmMYC2形成異二聚體，以拮抗的方式調(diào)節(jié)酚酸和花青素的生物合成。方慶［97］以過表達(dá) SmbHLH124的丹參毛狀根為材料，結(jié)合高效液相色譜技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SmbHLH124根系中的4種丹參酮類化合物的含量顯著增加，而丹參酚酸類化合物含量減少，初步解析了bHLH124參與了丹參次生代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控機(jī)制。綜上所述，丹參中bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究取得了一定的進(jìn)展，但還需繼續(xù)深入。

3.2 黃花蒿

黃花蒿（Artemisia annua）是一線抗瘧藥物青蒿素的唯一天然來源，隨著青蒿素及其衍生物不斷擴(kuò)大抗瘧以外的適應(yīng)癥范圍，黃花蒿的市場需求日趨增加，高青蒿素含量黃花蒿新品種的選育是目前相關(guān)研究的重點(diǎn)方向。甘雨等［98］基于黃花蒿全基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共鑒定出99個(gè)黃花蒿AabHLH基因，通過系統(tǒng)發(fā)育分析將其分為13個(gè)亞族；同時(shí)進(jìn)行AabHLH基因家族成員在不同光處理下的基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，AabHLH基因在不同水平上響應(yīng)藍(lán)光、紅光、遠(yuǎn)紅光、白光調(diào)控；根據(jù)表達(dá)量推測其中6個(gè)亞族基因?yàn)楣庹諚l件下青蒿素合成途徑調(diào)控基因，7個(gè)亞族基因?yàn)榉枪庹諚l件下青蒿素合成途徑調(diào)控基因，為深入了解AabHLH基因功能及其在不同光環(huán)境下青蒿素生物合成調(diào)控機(jī)制提供參考。黃花蒿中的amorpha ?4,11?diene合成酶（ADS）和CYP450單加氧酶（CYP71AV1）是參與青蒿素生物合成的兩種關(guān)鍵酶［99-100］，他們的啟動(dòng)子均含有E?box原件，是bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)［101-102］。青蒿素主要在青蒿葉片表面的分泌型腺毛中合成和積累［103］，Ji等［104］從青蒿的腺毛的cDNA文庫中鑒定并克隆了一個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子bHLH1，通過生化分析發(fā)現(xiàn)bHLH1可以通過與ADS和CYP71AV1等青蒿素生物合成相關(guān)基因啟動(dòng)子中的E?box結(jié)合來正向調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄水平，此外，bHLH1在青蒿葉片中的瞬時(shí)表達(dá)可增加青蒿素生物合成相關(guān)基因如ADS、CYP71AV1和HMGR的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步的脅迫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外ABA處理可以誘導(dǎo)AabHLH1的表達(dá)，從而激活A(yù)BA信號(hào)通道提高其對(duì)脅迫的耐受性。這些結(jié)果表明，AabHLH1對(duì)青蒿素的生物合成具有正向調(diào)節(jié)作用。Zhang等［105］鑒定了一個(gè)在花蕾和腺體分泌毛中高表達(dá)的bHLH成員，命名為AaPIF3，能夠顯著增強(qiáng)青蒿素生物合成基因的啟動(dòng)子活性，包括ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1，正向調(diào)控青蒿素的生物合成。并且通過AaPIF3的高表達(dá)，已成功培育出青蒿素高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植株。Xiang等［106］通過系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，AabHLH112與擬南芥冰結(jié)合蛋白（IBP）聚為一類，IBPs可能通過限制質(zhì)外體中冰晶的生長來幫助防止與冷凍相關(guān)的損傷［107］?？估涿{迫研究中發(fā)現(xiàn)，AabHLH112過表達(dá)顯著上調(diào)了AaERF1和青蒿素生物合成基因的表達(dá)水平，從而促進(jìn)了青蒿素的合成。Shen等［108］通過基因共表達(dá)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定了與青蒿素生物合成相關(guān)的兩個(gè)MYC型轉(zhuǎn)錄因子AabHLH2和AabHLH3，并且它們的表達(dá)模式與青蒿素合成途徑基因相關(guān)；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者過表達(dá)株系的青蒿素積累顯著降低，而RNAi株系的青蒿素含量顯著升高，表明AabHLH2和AabHLH3作為轉(zhuǎn)錄抑制因子負(fù)調(diào)控青蒿素生物合成，揭示了一個(gè)新的青蒿素生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為植物次級(jí)代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了新見解，并為青蒿素生產(chǎn)的代謝工程提供了新的靶基因。在青蒿中，除青蒿素外還含有豐富的其他萜類化合物，倍半萜是其萜類化合物的主要成分之一。周琪［109］采用分子生物學(xué)、生物化學(xué)和生物技術(shù)等多學(xué)科綜合手段對(duì)腺毛中高表達(dá)的AabHLH106基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，AabHLH106在青蒿中能夠激活A(yù)aBFS、AaCPS和AaECS的表達(dá)，從而促進(jìn) β-法尼烯、β-石竹烯和雪松醇的生物合成，在倍半萜生物合成中起到正向調(diào)控作用；此外，AabHLH106還能夠響應(yīng)ABA誘導(dǎo)，推測其可能在植物逆境脅迫方面也發(fā)揮重要作用。

4 總結(jié)與展望

本文總結(jié)了各植物物種中關(guān)于bHLH的最新研究進(jìn)展，并展示了一個(gè)相對(duì)全面的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族研究概況（圖3）。目前，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)構(gòu)和功能方面的研究已取得重大突破，通過獲得bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因的過表達(dá)植株或RNAi缺失體，對(duì)植株進(jìn)行生理生化研究，能夠進(jìn)一步明確bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能。因此利用基因工程的方法研究bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族功能，闡明bHLH協(xié)調(diào)多種內(nèi)外環(huán)境來調(diào)控植物生理的機(jī)制，改良植物的脅迫抗性從而為植物抗逆育種服務(wù)將是未來bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族相關(guān)研究的一個(gè)主要方向。由于bHLH轉(zhuǎn)錄因子功能豐富、作用機(jī)制較為復(fù)雜，進(jìn)一步全面、深入地闡明bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族功能及其作用機(jī)制，仍是一個(gè)重要課題。

圖3 bHLH家族成員參與植物生長發(fā)育和非生物脅迫過程的預(yù)測模型Fig. 3 A predictive model for the involvement of bHLH family members in the growth and development of plants and abiotic stress processes

bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多，結(jié)構(gòu)功能多樣，但是目前對(duì)其功能的大部分研究僅在擬南芥、煙草、水稻等模式植物中展開，具有一定的局限性。bHLH在高等植物中廣泛存在，并且隨著物種的分化進(jìn)化出具有不同生化特性的功能；另外，根據(jù)蛋白序列的同源性，bHLH家族已被分類，相同的亞家族通常具有相似的序列結(jié)構(gòu)，以及更相似、保守的功能［110］。藥用植物種類繁多，具有復(fù)雜的生境、豐富的生活型，是進(jìn)一步完善其起源進(jìn)化多樣性及功能研究的可靠材料，同時(shí)，bHLH基因功能的精確定義可以進(jìn)一步為藥用植物的栽培提供指導(dǎo)。近年來，各類藥用植物全基因組圖譜的完成，為全面、系統(tǒng)地分析轉(zhuǎn)錄因子分布和基因準(zhǔn)確功能的鑒定奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

在許多轉(zhuǎn)錄因子基因家族中，蛋白質(zhì)需要與同一家族或另一個(gè)家族中的另一個(gè)分子發(fā)生物理相互作用，以形成功能性二聚體并結(jié)合DNA，從而行使特定的功能［111-112］。根據(jù)合作伙伴的選擇和細(xì)胞環(huán)境，每個(gè)二聚體都會(huì)觸發(fā)一系列調(diào)節(jié)事件，從而出現(xiàn)更高階的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在植物中，有許多實(shí)例證明bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族能夠與自身結(jié)合形成同源二聚體，也能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成異源二聚體、三聚體發(fā)揮作用，每個(gè)獨(dú)特的bHLH二聚體都會(huì)觸發(fā)一系列調(diào)節(jié)事件，從而導(dǎo)致特定的細(xì)胞命運(yùn)，這賦予了bHLH多樣的生化特性以及廣泛參與植物生理活動(dòng)的能力。因此，僅對(duì)單個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能研究能獲取的信息十分有限，進(jìn)一步研究bHLH二聚化的特異性，結(jié)合后的交互特性以及功能產(chǎn)物，對(duì)于理解植物轉(zhuǎn)錄翻譯的復(fù)雜性以及新一代育種策略都至關(guān)重要。

植物對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)受分子網(wǎng)絡(luò)級(jí)聯(lián)控制。它們激活應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制以重新建立內(nèi)穩(wěn)態(tài)，保護(hù)和修復(fù)受損的蛋白質(zhì)和膜，在這過程中bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族起著極其關(guān)鍵的作用，改良植物對(duì)各種脅迫的抗性從而為植物抗逆育種服務(wù)將是未來關(guān)于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族研究的一個(gè)主要方向。但是，與植物響應(yīng)生物脅迫主要依賴于單基因性狀不同，植物對(duì)非生物脅迫的抗性是復(fù)雜的多基因控制的數(shù)量性狀，因此更難控制和工程設(shè)計(jì)。一般轉(zhuǎn)入單個(gè)抗逆基因?qū)χ仓甑目鼓嫘蕴岣叻扔邢?，甚至不能提高抗逆性，因此?yīng)加速多基因（尤其是調(diào)節(jié)基因）共同導(dǎo)入植物的系統(tǒng)研究，才有可能全面闡明植物的抗逆調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。事實(shí)上，各類脅迫存在一定的相似之處。例如，無論是在鹽脅迫還是干旱脅迫下，植物都會(huì)產(chǎn)生缺水脅迫，合成高水平的ABA，另外，活性氧（ROS）是在各種環(huán)境脅迫下產(chǎn)生的一種重要而常見的信使，它們結(jié)合下游靶點(diǎn)激活特定的反應(yīng)，另外，游離脯氨酸的積累也是植物應(yīng)對(duì)各類脅迫的主要手段［113］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，對(duì)作物的危害往往是幾種脅迫的同時(shí)發(fā)生［114］，對(duì)不同脅迫組合的耐受性是一個(gè)較為復(fù)雜的生理特征，涉及多種途徑以及不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的串?dāng)_，在藥用植物的種植加工中亦是如此。因此，加強(qiáng)多種脅迫模式的探索，才能為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供更切實(shí)的指導(dǎo)。

藥用植物發(fā)揮功效、防病治病的基礎(chǔ)是在植物體內(nèi)積累的具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，這些藥用活性成分都貯存在它們的藥用部分（根、莖、樹皮、葉、花、果實(shí)或種子等）內(nèi)。因此，研究藥用植物的結(jié)構(gòu)發(fā)育與生理功能、次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，具有重要的理論和實(shí)踐意義。研究發(fā)現(xiàn)，bHLH基因家族成員中只有部分基因在同一基因型、植物器官或發(fā)育階段中表達(dá)，并且它們的表達(dá)譜在不同的基因類型、組織或發(fā)育階段之間存在著倍數(shù)的差異［115］。這些表達(dá)特異性可能反映了它們的功能分化。在藥用植物中，應(yīng)該更著重于藥用部位高表達(dá)bHLH基因功能的挖掘，解析與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的分子機(jī)制和關(guān)鍵的信號(hào)通路，進(jìn)一步為藥用植物的高效定向育種提供新思路與新方法。