微流控技術在病原微生物檢測中的研究進展

萬其武 包旭東 丁柯 牟華明 羅陽

（1. 重慶大學醫學院智慧檢驗與分子醫學中心，重慶 400044； 2. 重慶大學生物工程學院，重慶 400044；3. 重慶大學附屬江津醫院科教外事部，重慶 402260；4. 重慶大學附屬三峽醫院心血管內科，重慶 400044）

病原微生物是指能夠引起人類或動物疾病的微生物，包括病毒、細菌、真菌、衣原體和支原體等。病原微生物可以通過空氣、體液等介質傳播，危害人體健康，造成財產損失［1］。因此，對病原微生物快速、準確以及靈敏的檢測是降低其危害的重要手段［2］。傳統的病原微生物檢測方法包括染色、培養、生化鑒定等方法，存在耗時長、成本高、操作復雜等缺點。微流控技術的出現為病原微生物的低成本、高通量、高效率檢測提供了新的研究思路和方法［3］。本文基于微流控技術在不同病原微生物檢測中的研究進展作一綜述，旨在為微流控技術在病原微生物檢測中的研究提供參考，進而推動微流控技術在病原微生物檢測中的應用。

1 微流控概述及其分類

1.1 微流控的簡介

微流控（microfluidics）指的是使用微管道（尺寸為數十到數百微米）處理或操縱微小流體（體積為納升到阿升）的系統所涉及的科學和技術。微流控系統通常包含閥門、微通道、反應室、壓力系統和檢測系統，通過控制微流控裝置內流體的運動來實現樣品制備、反應、分離和檢測等功能。微流控技術能夠控制微小流體，整合多種反應，其在病原微生物檢測中可以在微觀水平上精確控制樣品體積并減少體內和體外環境之間的差異，進而達到縮短反應時間和降低檢測成本的目的［4］，具有快速、準確、樣品消耗少等優點，為病原微生物的檢測提供了廣闊的前景。微流控技術在病原微生物檢測中的應用如圖1。

圖1 微流控在病原微生物檢測中應用Fig. 1 Application of microfluidic in the detection of pathogenic microorganisms

1.2 微流控技術的分類

微流控技術發展迅速，種類眾多，應用十分廣泛，對于微流控技術種類的劃分還沒有統一的標準。基于微流控芯片的驅動方式可將其分為主動型微流控和自驅型微流控。主動型微流控一般利用的是外源性驅動力進行微流體的操控，主要包括壓力型微流控、離心型微流控、磁力型微流控、數字化微流控等。各類型微流控特點如下：（1）壓力型微流控：利用氣體壓力或液壓或氣液壓混合，來控制液體在芯片中的運動；（2）離心型微流控：一般為對稱盤式構型，利用旋轉產生的離心力來驅動液體在芯片中的運動；（3）磁力型微流控：利用磁場來控制流體中的磁性物質，以驅動流體的運動；（4）數字化微流控：基于微升至納升范圍內的液滴精準操作，來實現復雜的實驗室分析的獨立平臺，其微滴由液體表面張力特性形成。上述是常見的幾種微流體驅動方式，研究人員通常將多種驅動方式組合來實現特定的目標功能。

自驅型微流控通常利用表面親疏水特性或毛細力來進行流體的輸運與處理，具有自驅動、無需外接動能、操作方便和容易控制等特點。其原理是基于紙質材料的易塑形、多孔、親水、毛細管作用等特性進行物理或化學加工后構建出的平面（2D）或立體（3D）的紙基微流道，該微流道集樣品前處理、分離、分析等功能于一體，可實現微量樣本的快速檢測。目前文獻所報道的微流控裝置多是外源驅動型微流控，而高通量、低能耗或無需外源驅動的微流控檢測技術是未來主要發展趨勢。

2 微流控技術在病原微生物檢測中的應用

2.1 微流控技術檢測病毒

基于微流控技術的病毒檢測方法主要針對病毒細胞數量、表面特異性蛋白和特異性核酸片段來開展檢測［5-6］。基于病毒細胞培養的空斑測定法是病毒鑒定和診斷的金標準，但存在通量低、所需樣品量大等問題，因此 Su等［7］設計了可以同時培養5種病毒的聚二甲硅氧烷芯片，該芯片系統不僅實現了病毒的高效鑒定，還完成了病毒的分離和抗病毒藥物的篩選，具有通量高和檢測樣本量少的優點。

微流控芯片培養法解決了傳統培養法存在的一些問題，但仍存在培養周期長等限制，所以需要開發耗時少、精確度高的檢測方法。而靶向病毒表面特異蛋白的微流控技術可以很好地解決目前培養法存在的問題，因而，Saraf等［8］基于適體和適體功能化的金納米粒子與目標蛋白形成三明治夾心結構，然后和銀試劑反應獲得比色信號，設計了對寨卡病毒和基孔肯雅病毒等病毒包膜蛋白進行多重檢測的微流控檢測芯片，該芯片系統在2 h內完成了對磷化氫緩沖鹽水和小牛血中寨卡病毒和基孔肯雅病毒的高特異性檢測。為了在微流控檢測系統中實現對多靶標蛋白的靈敏識別，Guan等［9］設計了一個集成兩種單克隆抗體（mAb）的微流體系統，用于腸道病毒71（EV71）的靈敏檢測。該系統將EV71的主要衣殼蛋白VP1的單克隆抗體1F4和2H2分別與羧基官能化磁珠和羧基官能化量子點偶聯，最后通過熒光強度來直接評估靶標蛋白的濃度。該微流體系統在30 min內對VP1的檢測限（LOD）達到10 pg/mL，與使用相同抗體的夾心酶聯免疫吸附試驗的結果（310 pg/mL）相比，提升了31倍。

隨著技術的不斷完善與發展，基于病毒表面特異蛋白的微流控技術在耗時、特異性以及靈敏度等方面均有很大的提升，但是面對低豐度、高感染性的病毒靶標時，仍存在靈敏度不夠的問題，而以精確度高著稱的核酸檢測法可以彌補蛋白檢測法存在的缺陷［10］。基于此，Tian等［11］開發了一種檢測病毒特異性核酸序列的全自動離心微流控系統（圖2?a），所有檢測流程被整合到封閉的自動化微流體系統之中，當口咽拭子樣品被注入微流控盤后，該系統自動進行樣品處理、反轉錄環介導等溫擴增、熒光信號檢測等檢測流程，其在70 min內完成了對21個樣本的高靈敏檢測，最低檢測限達到0.5 copies/μL。而當面對致病率極高的病毒時，快速且高效地篩查出陽性患者是有效開展防疫工作的保障，因此，Li等［12］基于一個獨立的微流控系統開發了一種簡單、靈敏和無需儀器的病毒檢測系統（圖2?b）。該系統將等溫擴增、CRISPR技術和側向流動檢測集成在一個封閉的微流體芯片中，當RNA病毒樣本加入到微流控芯片后，通過側向流動試紙，肉眼即可直接觀測檢測結果。這種操作簡單、靈敏度高、成本低的微流控系統有望被推廣應用到大規模的病毒篩查檢測中。

圖2 病毒檢測微流控系統Fig. 2 Microfluidic system for virus detection

目前常見的微流控系統通常需要外源驅動，所以動力供應會限制微流控技術的應用和發展。基于此，Yao等［13］設計了一種自供電快速加載微流控芯片（圖2?c），可同時檢測裂谷熱病毒、基孔肯亞病毒和登革熱病毒I、II、III和IV亞型等8種病毒，無需外源驅動，50 min內即可完成檢測，靈敏度可達50-100 copies/μL。Kim等［14］研究發現具有毛細作用力的紙基微流控在無外源驅動條件下即可實現對病毒的捕獲和檢測，利用其獨有的特性開發了一種手持式紙基微流控系統，可直接捕獲空氣中的液滴進行檢測。通過在空氣中噴灑含有病毒的人類唾液樣本來模擬自然環境，驗證發現該系統從捕獲病毒到智能手機完成數據分析總耗時30 min。這項技術為提高微流控系統的病毒檢測效率提供了新思路。

2.2 微流控技術檢測細菌

細菌是許多疾病的病原體，可以通過皮膚、消化道、呼吸道、血液等方式傳播疾病，具有較強的傳染性［15］。快速、高靈敏、高特異性的病原菌現場檢測已成為迫切需要，現有的細菌檢測方法存在操作繁瑣、耗時長等問題，無法滿足即時檢測的需求；微流控芯片技術由于其小型化、便攜性好和低試劑消耗，為各分析物提供了一種方便、快捷的檢測工具。常見的基于微流控的細菌檢測方法有阻抗檢測法、表面蛋白檢測法以及核酸檢測法等方法。

微流控芯片上細菌的信號轉導通常通過光學、聲學、阻抗或電化學測量來實現，其中基于阻抗的芯片傳感器具有響應快速、制造簡單和靈敏度高等優點。近年來，基于阻抗的細菌芯片傳感器得到了長足發展，其原理是通過檢測細菌直接沉積在或穿過電極陣列而引起的阻抗變化實現對靶標的靈敏檢測。Boehm等［16］展示了一種基于電阻抗的方法來同時識別和檢測細菌的全功能微流控系統。當該系統感應腔表面被抗體功能化后，樣品溶液中的細菌可以被選擇性地捕獲到測量腔內，從而增加了感應腔的電阻率，即可完成靶標菌的檢測，該傳感系統具有操作簡單、選擇性好及拓展性強等優點。

基于阻抗的細菌微流控檢測法部分解決了傳統基于培養檢測方法存在的問題，但仍存在特異性和靈敏度不夠的問題。而基于細菌表面抗體的微流控檢測方法能特異、高效、快速地對體積復雜樣本進行檢測，且無需專業操作人員［17］。基于此原理，Costa等［18］開發了一種基于高特異性受體結合蛋白（RBPs）的微流控識別系統（圖3?a），用于快速檢測大腸桿菌和銅綠假單胞菌，該系統將兩種重組RBP（Gp54和Gp17）與不同的熒光蛋白融合，并通過測量獲得的不同熒光信號實現對銅綠假單胞菌和大腸桿菌的靈敏檢測，檢測限達到103CFU/mL。為了進一步增加檢測通量和靈敏度，Kim等［19］將蛋白偶聯的熒光顆粒裝載于紙基微流體芯片，并通過智能手機熒光顯微鏡計算顆粒聚集的程度，其對金黃色葡萄球菌的檢測限為102CFU/mL，而大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的檢測限達到10 CFU/mL。隨著病原菌高靈敏度檢測需求的到來，Song等［20］提出了一種具有單細胞分辨率的微流控芯片系統（圖3?b），通過計數細胞而不是細菌斑塊或濁度來跟蹤細菌狀態，檢測時間從2 h縮短到約30 min，實現了對致病菌的快速、高靈敏檢測。

圖3 細菌檢測微流控系統Fig. 3 Microfluidic system for bacterial detection

隨著低濃度樣本檢測需求的出現，對微流控檢測有了新的要求：高靈敏度和高選擇性，基于核酸序列互補原理的核酸微流控系統因快速、精確的檢測優勢成為了熱點研究技術。Sun［21］團隊開發了一種基于多信號放大策略的微流控化學發光生物傳感器，通過細菌競爭性結合觸發催化發夾組裝（CHA）和催化反應，實現了多重信號擴增，其檢測限低至130 CFU/mL，耗時僅需1.5 h，但是該方法只能實現定性檢測。基于此，Liu等［22］在此基礎上開發了一種基于免疫磁性分離、酶催化和電化學阻抗分析的微流控生物傳感器（圖3?c），將細菌樣品、被捕獲抗體修飾的磁性納米顆粒和被檢測抗體和葡萄糖氧化酶修飾的酶探針同時添加到微流控芯片后，通過交叉指狀微電極和電化學阻抗分析儀確定目標細菌濃度。整個檢測過程耗時縮短至1 h，最低檢測限達到73 CFU/mL，其不僅縮短了檢測時間，提高了靈敏度，而且還實現了定量檢測。為了進一步提高靈敏度，Kao等［23］研究了一種新型的微流控免洗熒光原位雜交（FISH［24］）液滴檢測系統（圖3?d）。其將樣品與試劑混合并裝入微流體盒中，通過離心使微流體乳化，將樣品制成微液滴用于細菌包封，使用鎖定核酸的LNA/DNA分子信標和基于NaCl尿素的雜交緩沖液，然后進行原位滲透、雜交和信號檢測。該檢測系統以大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌為對象進行驗證，檢測限為3×103bacteria/mL，該系統達到單細胞靈敏度水平。

2.3 微流控檢測其他病原微生物

除病毒、細菌等常見病原微生物檢測外，微流控技術近年來也被廣泛應用于真菌、支原體及衣原體等其他病原微生物的檢測研究。

真菌感染可導致嚴重的臨床結果，如引發多器官衰竭和感染性休克，因此對真菌的快速檢測是治療真菌感染疾病的關鍵［25］。常規真菌檢測方法包括血培養、平板培養和聚合酶鏈式反應，這些方法普遍存在耗時長、檢測設備昂貴等問題。隨著微流控芯片技術的發展，科學家將微流控芯片與真菌檢測相結合，實現了更高的檢測效率和準確性。Soares等［26］報道了一種新型的超快速單步熒光競爭性免疫分析方法，利用微流控室中固定的、經功能化納米多孔瓊脂糖珠修飾的蛋白質來檢測黃曲霉素B1，檢測時間為2 min，檢測限為1 ng/mL。為了實現對真菌的靈敏檢測，Schell等［27］開發了一種數字微流控實時PCR平臺，用于檢測血液中白色念珠菌的DNA，與金標準法相比，總靈敏度達到94%。隨著各種真菌毒素特異性單克隆抗體的開發以及針對單一或多種真菌毒素的免疫親和柱的建立，微流控芯片高通量、高靈敏度、靈巧和快速的優勢將在真菌的同步檢測中更加突出。

支原體致病機制為支原體頂端吸附于細胞表面，將其微管侵入細胞，從而奪取細胞營養物質，再釋放出過氧化氫等引發細胞溶解、壞死，導致炎癥發生。其主要的檢測方法有培養法、血清法及PCR等方法，存在操作繁瑣、需要專業操作人員及周期長等問題。Wulff?Burchfield等［28］基于PCR平臺構建出的快速、便攜和全自動的微流控實時檢測系統，通過生物素化捕獲探針和鏈霉親和素偶聯磁珠聯合Taqman探針和引物，對咽拭子樣本中的肺炎支原體特異性DNA進行快速檢測，準確率達到98%，該微流控平臺與PCR靈敏度一致，但速度提高了3倍，為肺炎支原體檢測側提供了一種準確且靈敏的檢測方法。為了進一步提高微流控系統對支原體的檢測效率，Wang等［29］設計了一種3D打印微流體系統，通過在PCR室預加載指定的引物和探針，80 min內完成了對肺炎支原體及其突變型的靈敏檢測。該系統具有操作簡單、速度快等優點，為感染現場和醫院急診科提供了一種快速、便攜的檢測手段。

衣原體是一種專性細胞內病原體，是當今世界上細菌性傳播疾病發病率最高的病原體，根據世界衛生組織統計，全球每年有超過1億例衣原體感染病例發生。衣原體篩查最常用的檢測方法是核酸擴增試驗，這種方法具有良好的敏感性和特異性，但只能在專門的實驗室中完成，且需要一天甚至更長時間才能得出結果。因此，迫切需要一種敏感、快速且具有成本效益的診斷方法。基于此，Dean等［30］等開發了一種基于微流體的多重檢測沙眼衣原體的方法，該微流控系統在20 min的擴增反應中同時檢測出9個沙眼衣原體位點，實現了對衣原體病菌的快速檢測。為了實現多靶標同步檢測，Ye等［31］建立了一個多功能微流控核酸診斷系統，其在單個集成的微流控芯片上完成了核酸的純化、分離、擴增和檢測。該微流控系統高度自動化，能直接從泌尿生殖道分泌物中同時檢測出沙眼衣原體、淋病奈瑟菌、人支原體和解脲支原體。其診斷效果與PCR一致，從樣本提取到結果分析總耗時不到50 min。這種具有高度集成、自動化、無需預處理樣本的新型衣原體診斷工具，可以改善性傳播疾病的預防和控制狀況，實現早診斷早治療。

2.4 小結

微流控平臺在經歷了芯片設計的蓬勃發展后，隨著近幾年新型檢測技術不斷涌現，流體機理理論也日趨成熟和完備。目前，已發展出三大主流應用技術：微流控芯片技術，以及基于微流控芯片技術發展而來的液滴微流控技術和紙基微流控技術。這些技術在病原微生物的快速檢測中實現了多功能集成、高通量和無能耗自驅動的功能，展現了微流控技術在單細胞分析水平中的發展前景。

從整個微流控技術領域的發展角度來，未來隨著材料科學與電子測量技術的發展，多重信號放大融合的多靶標檢測的微流控平臺可能開辟出更有發展應用前景的POCT新途徑：（1）多納米技術與新材料的融合。臨床診斷和環境監測中的許多樣品都比較復雜，其中存在多種不同的物質，由于背景信號較強，可能會干擾檢測過程。集成先進的納米技術有利于樣品的富集，同時選擇用于信號轉換的材料可以大大提高微流控傳感的效率。（2）同時分析多種不同類型重要生物標志物。在臨床診斷、治療和預后中，進行多靶標檢測以確保準確評估是必不可少的。因此，將蛋白質、核酸等多種生物標志物的檢測以全自動的方式整合到一個平臺上，不僅可以在不同層面提供有價值的疾病信息，提高檢測的可信度，還可以促進POCT的實際應用。合理設計的微流控芯片，結合先進的檢測技術和多功能材料，有望實現廣泛的臨床應用。

3 總結與展望

3.1 微流控檢測病原微生物的優勢

與傳統的病原微生物檢測方法相比，微流控檢測技術極大地提升了檢測便利化水平。例如，針對乙肝病毒檢測和基因分型存在操作復雜、耗費時間長的問題，多功能集成離心式微流控平臺的出現，成功地基于全血樣本一步實現了血清分離、吸附、洗滌、洗脫、檢測DNA等一系列功能，極大地縮短了檢測時間，提升了診療效率［32］；而自供電快速加載微流控芯片的研發實現了對包括登革熱病毒在內的8種病毒的同時檢測，顯著地提高了檢測通量，縮短了診斷時間［13］，讓在野外或者醫療條件差的偏遠地區亦可實現對致病病菌的快速自助檢測。總之，微流控的優點主要包括：（1）集多個檢測步驟于一體，在微流控芯片上進行反應，操作更加便捷，將實驗室功能整合到微流控平臺上，實現了檢測自動化、一體化；（2）封閉式的自動化管理不僅減少了污染，保證了安全，同時微通道多樣性滿足了對不同病原體的檢測需求，保證了各通道的獨立性，在實現快速檢測的同時能夠對多個靶標進行檢測，具有高通量性；（3）基于微流控技術的病原微生物檢測減少了對實驗環境的要求，降低了對專業技術人員的依賴，極大地提高了對突發公共衛生事件的處理效率和可靠性。基于病原微生物檢測的微流控技術發展迅速，彌補了傳統檢測技術的缺陷，使得病原微生物的檢測朝著即時、快速分析、自動化、高通量、高特異性、高精度、無損便攜、低成本和便捷化方向發展。

3.2 存在的問題及發展前景

微流控檢測裝置是微流控檢測系統的核心，其開發的難點在于，必須根據病菌的特點量身設計微流控裝置或芯片的結構，同時實現高靈敏度和高精確度檢測。基于此，微流控技術還需要在以下幾個方面進行改進：（1）在保證細胞活力方面，一些微流控裝置不能完全保證靶細胞的內部結構成分不被破壞，增加了精確檢測細胞的難度，需要根據靶細胞特性精確結構設計。（2）在自動化方面，目前系統設計、樣品裝樣、細胞培養、數據采集和分析的全過程消耗掉大量的時間和人力，需要提高微流控系統的自動化程度。（3）在成本方面，目前微流控的開發成本較高，多數微流控研究成果還停留在實驗室，無法推廣應用。因此，開發便攜、低成本的微流控裝置是成果轉化的關鍵。（4）在質量控制方面，目前微流控檢測技術尚缺乏成熟的管理體系和統一的行業標準，因此需要進一步提高精確度和穩定性助力臨床推廣應用，建立行業標準。

最近，機器學習和數學建模等人工智能工具從更新的角度分析病原菌給微流控技術帶來了前所未有的機會。基于數學建模建立單擬合參數的適用數學模型，探索某一細菌在表面積體積比方面特有的動態特性，實現對表面積和體積合成適應之間時間延遲的預測，進而作為微流控系統檢測其他病菌的適用策略。此外，還可以將待測細胞與計算機連接，建立一個網絡遺傳系統，進而實現細胞周期的自動同步。因此，我們認為優化微流體與人工智能算法的結合可能是未來潛在的發展趨勢，對促進疾病檢測、環境監測、食品安全檢測等多領域的快速發展具有重要意義。