甘藍型油菜酪氨酸代謝關鍵基因FAH的克隆、功能鑒定和表達分析

支添添 周舟 陳紀鵬 韓成云

（1. 宜春學院生命科學與資源環境學院 宜春學院江西省作物生長發育調控重點實驗室，宜春 336000；2. 宜春學院化學與生物工程學院，宜春 336000）

酪氨酸降解途徑在動物中必不可少，若中斷將導致嚴重的代謝疾病［1-3］。這條途徑首先在動物和細菌中被發現［4-5］，是一條非常重要的代謝途徑。Dixon等［6］證明擬南芥（Arabidopsis thaliana）中存在酪氨酸降解途徑的關鍵酶，并且和動物中有相同的功能。越來越多的證據表明，植物具有典型的酪氨酸分解代謝途徑［7-13］。延胡索酰乙酰乙酸酶（fumarylacetoacetate hydrolase, FAH）是酪氨酸代謝途徑的最后一個酶，FAH（SSCD1）基因的突變導致擬南芥在短日照下產生模擬病斑并激活植物防御［11-12］。

模擬病斑突變體是一類在沒有明顯的逆境、損傷或病原物侵害時，在葉片上能自發地形成類似病原物侵染后的壞死斑的突變體，這類突變體在植物中廣泛存在，如擬南芥、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、小麥（Triticum aestivum）、大麥（Hordeum vulgare）等中均有報道［14-19］。這些突變體往往能激活植物體的系統獲得性抗性，通常具有與抗病反應相關的細胞學和生物化學特征，對許多病原物表現出局部和系統抗性，是研究植物抗病機理的理想材料［20］，如bon1（bonzai1）和cpr1/cpr30模擬病斑突變體對丁香假單胞菌有抗性［21-22］。水稻模擬病斑突變體oscul3a對稻瘟病菌和黃單胞菌均有很強的抗性［23］，大麥mlo突變體對白粉病具有非特異性抗性［24］，小麥模擬病斑突變體Ning7840和lm3分別對葉銹病和白粉病具有抗性［25-26］。

研究表明模擬病斑突變體的抗病性與植物抗病信號中的水楊酸（salicylic Acid, SA）、茉莉酸（jasmonic acid, JA）、乙烯（ethylene, ET）等信號分子均有相關，這些植物激素不同程度地參與了抗病過程中的不同環節，起著非常重要的作用［27-32］。前期研究證實sscd1突變體產生模擬病斑的同時積累JA，同時激活調控JA/ET信號途徑的部分病程相關基因PDF1.2，VSP1和SA病程相關基因PR1［12］。盡管sscd1中的模擬病斑的產生伴隨著SA誘導基因PR1的上調，但與SA信號轉導無關；而JA信號通路的中斷顯著抑制sscd1模擬病斑的產生［12］。這些結果說明FAH基因突變在短日照下激活擬南芥抗病信號途徑從而調控植物抗病。

甘藍型油菜（Brassica napus L.）是我國重要的油料作物，是第一大國產食用植物油來源和我國第二大飼用蛋白源［33］。然而，各種病害的頻繁發生嚴重影響著油菜的產量和品質［34］。因此，挖掘油菜抗病相關遺傳資源、提高油菜抗病性對于油菜生產具有重要意義。甘藍型油菜是白菜（Brassica rapa, AA, 2n=20）和甘藍（Brassica oleracea, CC,2n=18）通過自然雜交形成的異源四倍體作物（AACC,2n=4X=38）［35-36］，白菜和甘藍的基因組在古老的多倍化事件中都經歷了3倍化的過程［37］。因此，甘藍型油菜相比擬南芥，具有更加復雜的基因組特征并且大多數基因具有多個同源拷貝，具有冗余或不同的功能［38］。盡管在擬南芥中已證實FAH基因突變在短日照下產生模擬病斑并激活抗病反應，但鑒于甘藍型油菜相比擬南芥基因組更復雜，仍需要鑒定不同FAH基因在甘藍型油菜中的功能并分析其各自的表達模式。

本研究從甘藍型油菜克隆了2個與擬南芥高度同源的FAH基因BnaA06g38260D（BnaA06FAH）和BnaC05g49430D（BnaC05FAH），通過生物信息學分析其編碼的蛋白質序列和進化關系；構建過表達載體轉化擬南芥突變體sscd1進行功能驗證；進一步對BnaA06FAH和BnaC05FAH啟動子進行克隆，探究其序列特征和潛在的響應元件，構建含有報告基因GUS的植物表達載體，通過GUS染色揭示其表達模式，為深入研究BnaA06FAH 和BnaC05FAH在甘藍型油菜中的作用和功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

甘藍型油菜品種為‘westar’、擬南芥（Arabidopsis thaliana）生態型為哥倫比亞（Columbia, Col?0），突變體sscd1、大腸桿菌菌株DH5α、農桿菌菌株GV3101、啟動子分析載體pCAMBIA1301和過表達載體pBI121均由宜春學院江西省作物生長發育調控重點實驗室保存。擬南芥sscd1突變體在短日照下產生模擬病斑［11］。

1.2 方法

1.2.1 DNA、RNA的提取及cDNA合成 待甘藍型油菜長到四葉期，取適量的新鮮的葉片用液氮研磨，用高效植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取葉片基因組DNA，使用分光光度計（ND?1000, NanoDrop, Thermo Fisher Scientific）檢測濃度后儲存于?20℃，用作克隆啟動子序列的模板；用Trizol（RNAiso Plus, 寶生物工程有限公司）提取總RNA，進一步用DNase I（RNase Free,Thermo Fisher Scientific）去除基因組DNA后利用反轉錄試劑盒ReverTraAce qPCR RT試劑盒（perfect real time, Toyobo），將RNA反轉錄成cDNA，用作克隆CDS序列的模板。

1.2.2 BnaA06FAH和BnaC05FAH的CDS序列和啟動子的克隆以及載體的構建與轉化

1.2.2.1 引物設計及目的片段的擴增 在甘藍型油菜數據庫（https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/）中獲得BnaA06FAH和BnaC05FAH的cDNA預測序列。利用軟件Primer premier 5.0在2個基因非編碼區設計特異引物（表1），用TaKaRa高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，以擴增得到的cDNA為模板，在BnaA06FAH和BnaC05FAH上游引物的5′添加Xba I（TCTAGA）限制性內切酶和保護堿基（GC）以及下游引物5′添加Sac I（GAGCTC）限制性內切酶和保護堿基（C）（引物見表1），再次進行CDS序列的PCR擴增，目的片段大小預期為1 266 bp，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收并純化，測序。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in the experiment

在NCBI中獲得BnaA06FAH和BnaC05FAH翻譯起始位點ATG上游1.8 kb左右的DNA序列，根據啟動子序列，利用軟件Primer premier 5.0分別設計擴增引物（表1），在上下游引物的5′端分別加上Xba I和Bgl II酶切位點及其保護堿基，以‘westar’總DNA為模板進行PCR擴增，目的片段大小預期為1 980 bp（BnaA06FAH）和1 708 bp（BnaC05FAH），經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收并純化，測序。

1.2.2.2 35S∷BnaC05FAH和35S∷BnaA06FAH重組載體的構建 用限制性內切酶Xba I和Sac I對已測序驗證的BnaA06FAH和BnaC05FAH的CDS序列和pBI121載體分別進行雙酶切，然后將目的片段和載體進行連接，使目的基因替換原載體上的GUS，構建35S∷BnaC05FAH和35S∷BnaA06FAH過表達載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取菌落進行PCR鑒定，對鑒定的陽性菌落進行測序，以確保載體構建的準確性。

1.2.2.3 pBnaC05FAH∷GUS和pBnaA06FAH∷GUS重組載體的構建 用限制性內切酶Xba I和Bgl II對已測序驗證的BnaA06FAH和BnaC05FAH的啟動子序列及pCAMBIA1301載體進行雙酶切，然后進行連接，用BnaA06FAH和BnaC05FAH啟動子替換pCAMBIA1301載體上原有35S啟動子。通過熱激法將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α，隨機挑選陽性克隆進行菌落PCR及酶切檢測，測序。將測序驗證正確的陽性克隆進行搖菌和質粒提取。

1.2.2.4 擬南芥的遺傳轉化及篩選 用CaCl2凍融法將已驗證的重組質粒轉入農桿菌GV3101，挑選菌落PCR驗證正確的農桿菌單菌落進行培養，28℃、220 r/min振蕩培養18-24 h。7 352 r/min離心活化菌液2 min，棄上清，用農桿菌懸浮液（5%蔗糖+1/2 MS+0.02% Silwet?L77+0.01% 6?BA）將菌體重懸至OD600為0.6-1.0。利用浸花法轉化擬南芥，收取T0代種子，在含有潮霉素（25 mg/L）或卡那霉素（50 mg/L）的MS培養基上篩選成功轉入表達載體的轉基因植株，將篩選到的轉基因植株T0代抗性苗移入土中，后代單株收種。挑選T2代抗性符合3∶1分離比的轉基因株系，用GUS組織化學法檢測啟動子活性。

1.2.3 生物信息學分析 PLANTCARE在線分析啟動子序列包含的順式作用元件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。用Bioxm2.7軟件分析BnaA06FAH和BnaC05FAH序列的開放閱讀框（open reading frame, ORF）。從NCBI數據庫中下載不同物種FAH蛋白的氨基酸序列，用DNAMAN 6.0軟件對氨基酸序列進行比對，用MEGA 11.0軟件對氨基酸序列進行系統進化樹分析。

1.2.4 GUS組織染色 根據潮霉素抗性在MS固體培養基上篩選pBnaC05FAH∷GUS和pBnaA?06FAH∷GUS轉基因擬南芥至T3代，用GUS染色液（GUS Blue KIT, 北京華越洋生物科技有限公司）對MS培養基上9和14 d的擬南芥進行GUS染色，并將14 d幼苗移栽到土中生長至抽薹開花，剪下莖前端進行染色：將擬南芥被配置好的染色液完全覆蓋，抽真空2-3次，每次10 min后，用錫箔紙包好，37℃孵育24 h，70%乙醇脫色3 d，每天更換到脫色完全。染色結束后將植株置于體式顯微鏡下（Nikon SMZ800N）觀察并拍照記錄。

1.2.5 RT?qPCR 采用SYBR qPCR混合試劑盒（Toyobo）和ABI 7300序列檢測系統（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）按照說明書進行實時定量PCR。RT?qPCR檢測的基因引物見表1，以ACTIN2作為內參。每個樣本的基因表達量在3次分析重復中計算，相對表達量用2-ΔΔCt方法定量。所有試驗至少重復3次。表中的數據表示為RT?qPCR中3次生物重復的平均值±SE。

2 結果

2.1 BnaA06FAH和BnaC05FAH的CDS序列擴增

根據AtFAH氨基酸序列，通過BnIR（Brassica napus multi?omics information resource）進行BLAST比對，獲得同源性最高的2個甘藍型油菜（Brassica napus L.）FAH基因：BnaA06g38260D（BnaA06FAH）和BnaC05g49430D（BnaC05FAH）。根據基因cDNA序列設計引物，以甘藍型油菜品種‘westar’葉片cDNA為模板進行擴增，獲得BnaA06FAH和BnaC05FAH的CDS序列（圖1），測序。

圖1 BnaA06FAH和BnaC05FAH CDS序列的PCR擴增Fig. 1 PCR products of CDS sequences of BnaA06FAH and BnaC05FAH

2.2 BnaA06FAH和BnaC05FAH的CDS序列生物信息學分析

測序后的CDS序列翻譯成氨基酸序列，與擬南芥AtFAH（NP 172669.2）進行同源比對，同源性分別為93.11%和92.40%（圖2?A）?；贐naA06FAH和BnaC05FAH的氨基酸序列，與蘿卜、擬南芥、薺菜、亞麻芥、玉米和短花藥野生稻的FAH基因全長預測氨基酸序列構建系統進化樹，結果（圖2?B）顯示，甘藍型油菜中該基因與白菜和甘藍的親緣關系最近，其次是蘿卜，再而是擬南芥，與單子葉植物的親緣關系較遠。

圖2 BnaA06FAH和BnaC05FAH氨基酸序列比對（A）和進化樹分析（B）Fig. 2 Amino acid sequences alignment（A）and phylogenetic tree（B）of BnaA06FAH and BnaC05FAH

2.3 BnaA06FAH和BnaC05FAH的功能驗證

為了驗證BnaA06FAH和BnaC05FAH的功能，構建35S∷BnaA06FAH和35S∷BnaC05FAH過表達載體，通過浸花法轉入擬南芥sscd1突變體，以T2代純合株系的蓮座葉cDNA為模板，分別選擇4個獨立株系進行熒光定量PCR分析，結果（圖3）顯示，BnaA06FAH和BnaC05FAH在sscd1突變體中本身無表達，其相對表達量為0；擬南芥突變體sscd1轉基因植株中35S∷BnaA06FAH?sscd17?2和35S∷BnaC05FAH?sscd14?11的相對表達量最高，作為后續試驗的研究材料。

圖3 過表達擬南芥株系中BnaA06FAH和BnaC05FAH的相對表達量Fig 3 Relative expressions of BnaA06FAH and BnaC05?FAH in overexpressed A. thaliana line

當在擬南芥sscd1突變體中過表達甘藍型油菜BnaA06FAH和BnaC05FAH，sscd1突變體在短日照下的模擬病斑完全被抑制（圖4）。結果表明，甘藍型油菜BnaA06FAH和BnaC05FAH的功能都與擬南芥AtFAH相似。

圖4 短日照下過表達BnaA06FAH和BnaC05FAH抑制擬南芥突變體sscd1的模擬病斑Fig. 4 Overexpressions of BnaA06FAH and BnaC05FAH repress the simulated disease spot in Arabidopsis mutant sscd1 under short-day condition

2.4 BnaA06FAH和BnaC05FAH啟動子序列的擴增和生物信息學分析

在甘藍型油菜數據庫和NCBI中獲得BnaA?06FAH和BnaC05FAH對應的基因組序列，選取ATG上游1.8 kb左右的序列。以甘藍型油菜‘westar’基因組DNA為模板，設計特異性的引物進行PCR擴增（表1），分別獲得BnaA06FAH和BnaC05FAH的啟動子片段（圖5）。在TAIR（http://www.arabi?dopsis.org/）網站獲得擬南芥AtFAH基因（AT1G12050）ATG上游1.8 kb的啟動子序列，通過PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）數據庫在線分析，并與BnaA06FAH和BnaC?05FAH啟動子順式作用元件進行比較。結果發現，BnaA06FAH、BnaC05FAH和AtFAH啟動子序列除了都含有基本轉錄元件CAAT?box、TATA?box外，還含有多種應答元件。應答元件又可分為生長發育、光響應、脅迫響應和激素響應4類元件（圖6），說明甘藍型油菜BnaA06FAH和BnaC05FAH和擬南芥AtFAH的表達都可能響應光、植物激素和脅迫的誘導。生長發育類別中，涉及胚乳表達（AAGAA?mo?tif）、晝夜節律（circadian）和玉米醇溶蛋白代謝（O2?site）等，其中O2?site占比例最高，為43%。光響應有12種順式作用元件，包括AE?box、AT1?motif、ATCT?motif、Box 4、G?Box、G?box、GA?motif、GT1?motif、Sp1、TCT?motif和MRE，其中G?box占比最大，為21%。脅迫響應類別有6種順式作用元件，分別與防御應激（STRE、as?1）、厭氧誘導（ARE）、脫水（DRE core）、創傷（WRE3和WUN?motif）和病原誘導（W?box）相關，其中as?1和WRE3所占的比例最高，為32%。激素響應類別中的元件包括脫落酸（ABRE、ABRE3a、ABRE4）、生長素（TGA?element、TGA?box）、赤霉素（GARE?motif）、茉莉酸甲酯（CGTCA?motif、TGACG?motif）應答元件，其中響應茉莉酸甲酯的順式作用元件占比最大，為25%。另外，這些應答元件還參與抗病響應，如W?box、ERE、GT1?motif、G?box、as?1、TGACG?motif和CGTCA?motif，其中BnaA06FAH、BnaC05FAH和擬南芥AtFAH共有的啟動子順式作用元件有as?1、GT1?motif、TGACG?motif和CGTCA?motif，說明無論擬南芥還是甘藍型油菜FAH基因的表達很可能與植物抗病性相關。

圖5 BnaA06FAH和BnaC05FAH啟動子的PCR擴增產物Fig. 5 PCR products of BnaA06FAH and BnaC05FAH promotors

圖6 AtFAH、BnaC05FAH和BnaA06FAH啟動子應答元件分析Fig. 6 Analysis of promoter response elements of AtFAH, BnaC05FAH and BnaA06FAH

BnaA06FAH相比BnaC05FAH與擬南芥AtFAH啟動子共同擁有更多順式作用元件，如激素響應順式作用元件（ABRE、ABRE3a、ABRE4）、光響應元件（Sp1和G?box）、脫水響應元件（DRE core）和創傷響應元件（WRE3, 表2）。除了兩者共同的啟動子順式元件，兩者都存在特異的啟動子順式作用元件：BnaC05FAH特異的大部分都是光響應元件（如AE?box、GA?motif和AT1?motif）；而BnaA06FAH沒有光響應元件，有激素防御相關（GARE?motif、TGA?element、W?box）誘導和與生長發育相關的順式調控元件（表3）。說明甘藍型油菜BnaA06FAH和BnaC05FAH的表達調控可能存在差異。

表2 BnaC05FAH、BnaA06FAH和AtFAH啟動子區共同順式作用元件Table 2 Common cis-acting elements in BnaC05FAH, BnaA06FAH and AtFAH promoter regions

表3 BnaC05FAH、BnaA06FAH和AtFAH啟動子區包含的不同順式作用元件Table 3 Different cis-acting elements in BnaC05FAH, BnaA06FAH and AtFAH promoter regions

2.5 BnaA06FAH和BnaC05FAH表達模式分析

為了探明BnaA06FAH和BnaC05FAH的表達模式，構建BnaA06FAHPro∷GUS和BnaC05FAH?Pro∷GUS融合表達載體，通過電擊法轉入根癌農桿菌GV3101中，并通過農桿菌介導的浸花法轉化野生型擬南芥Col?0，利用潮霉素抗性篩選轉基因擬南芥至T3代，同時以未轉入任何載體的GV3101菌株侵染的擬南芥作為陰性對照（CK）。分別對生長9和14 d的T3代陽性和陰性植株幼苗、花和角果進行GUS組織化學染色，在實體顯微鏡下觀察染色情況。結果（圖7）顯示，在9 d的幼苗中，轉化BnaC05FAHPro∷GUS和BnaA06FAHPro∷GUS的陽性植株都在子葉、葉柄、下胚軸和根部位檢測到GUS的表達；待植株生長至14 d，BnaC05FAHPro驅動的GUS幾乎在所有部位都有表達，而BnaA06FAHPro∷GUS轉基因植株中GUS表達集中在子葉、幼嫩的真葉、下胚軸以及根。對花的染色結果顯示，BnaC05FAHPro∷GUS轉基因植株中GUS在莖稈、花萼、花絲，雌蕊的柱頭、花柱和子房中表達，相比之下，BnaA06FAHPro∷GUS轉基因植株的表達部位只集中在莖稈、花萼、花柱和子房，而柱頭、花藥、花絲和花瓣都沒有表達；二者幼嫩角果里的胚珠都可以染色，但BnaC05FAHPro∷GUS轉基因植株角果的心皮上也有染色。表達強度上，轉化BnaA06FAH啟動子的陽性苗組織藍色斑點顏色在所有時期均比轉BnaC05FAH啟動子的陽性苗淺，說明BnaC05FAH啟動子對GUS的驅動強度明顯比BnaA06FAH強。綜上所述，BnaA06FAH和BnaC05FAH啟動子驅動GUS在擬南芥中的表達在無論其組織部位還是強度上都存在明顯差異。

圖7 甘藍型油菜BnaC05FAH、BnaA06FAH啟動子驅動GUS在擬南芥中的表達Fig. 7 GUS expressions driven by BnaC05FAH and BnaA?06FAH promoters from B. napus in Arabidopsis seedlings

3 討論

油菜是僅次于玉米和油棕的第三大重要油料作物［39］。甘藍型油菜具有株型高大或較高大，單產高和適應性強等優良特性，成為我國和全世界主要栽培和種植的油菜類型［40］。但是，在甘藍型油菜的生長過程中會遭受很多病害的威脅，目前，生產上主要釆用栽培和化學的方法防治病害，但其效果十分有限［41-42］。因此，選育抗病品種無疑成為油菜抗病育種最根本也是最有效的方法。然而，當前栽培的甘藍型油菜品種缺少相關抗性基因，嚴重制約著油菜抗病育種進程。近年來，植物功能基因組學和基因工程的研究發展迅猛，特別是在模式植物擬南芥中抗病相關基因以及抗病分子機制研究取得了突破性進展。在與擬南芥同科的甘藍型油菜中，克隆和研究抗病相關基因，對提高甘藍型油菜的抗病性具有重要的理論和實踐意義。

油菜與擬南芥同屬十字花科蕓薹屬植物，研究證明二者基因組的同源性很高。課題組前期研究證實酪氨酸降解途徑在植物中具有生物功能，編碼酪氨酸降解途徑FAH的基因SSCD1突變后導致擬南芥在短日照下產生模擬病斑［8］，并激活JA/ET途徑和病程相關基因的表達［11］。本研究克隆兩個與擬南芥高度同源的甘藍型油菜FAH基因BnaA06FAH和BnaC05FAH，分析發現其編碼的氨基酸序列與擬南芥ATFAH的氨基酸序列相似性高達93.11%和92.40%，分子進化分析表明，BnaA06FAH和BnaC05FAH雖然分別與白菜和甘藍同源性最高，進化關系最近，但與擬南芥同樣具有較高同源性，并且BnaA06FAH和BnaC05FAH在雙子葉植物中親緣關系較近，而與單子葉植物的親緣關系較遠。通過構建過表達載體，進一步驗證2個甘藍型油菜FAH基因的過表達都能抑制擬南芥突變體sscd1在短日照下模擬病斑的形成，說明FAH基因在甘藍型油菜中的功能很可能與擬南芥非常相似。另外，對甘藍型油菜和擬南芥FAH基因啟動子區域順式作用元件的分析表明，AtFAH和BnFAH的啟動子中包含7種參與抗病響應的順式作用元件（W?box、ERE、GT1?motif、G?box、as?1、TGACG?motif和CGTCA?motif）以及植物激素響應元件。W?box是一類植物病原誘導相關基因的順式作用元件［43-44］，ERE元件能夠調控真菌誘導表達，分別存在于BnaA06FAH和BnaC05FAH啟動子中。G?box能與bZIP蛋白結合［45］，分別存在于BnaA06FAH和AtFAH的啟動子中。三者的啟動子中都含有GT1?motif和as?1元件，GT1?motif的表達由病原體誘導，部分與GT?1?like轉錄因子相互作用，GT?1?like轉錄因子結合病程相關PR?1a啟動子，影響水楊酸誘導基因的表達水平［46］。另外，三者啟動子都含有響應JA的TGACG?motif和CGTCA?motif。JA響應死體型病原菌的侵入，并且能誘導許多植物產生防衛應答反應。在擬南芥中，酪氨酸代謝相關基因TAT3、HGO、MAAI以及FAH（SSCD1）的表達已證實受到JA的誘導［11］。綜上所述，甘藍型油菜FAH基因BnaA06FAH和BnaC05FAH的功能很可能與擬南芥相似，并且都與抗病和JA相關。

蕓薹屬是十字花科中包含許多重要經濟作物的一個屬，包括白菜、甘藍、油菜等常見的蔬菜和油料作物，是農業育種研究中非常重要的研究材料。甘藍型油菜由二倍體祖先種白菜（B. rapa, 2n=20,AA）和甘藍（B. oleracea, 2n=18, CC）經過自然雜交形成的［27］。蘿卜是十字花科植物中與蕓薹屬親緣關系最近的物種［47］，研究者普遍認為蕓薹屬及其近緣屬蘿卜屬起源于一個共同的祖先種，因此在進化樹分析中，甘藍型油菜FAH基因與白菜和甘藍親緣關系最近，其次是蘿卜，再者是擬南芥。白菜是蕓薹屬第一個完成基因組測序的栽培種，通過與擬南芥的比較基因組分析發現，它們有著很好的共線性關系。甘藍也是一種重要的蔬菜作物，與白菜比較發現其基因組局部上存在著大量的染色體重排，特定通路內基因的保留以及同源基因的表達也存在顯著差異［48］。甘藍型油菜BnFAH基因一個來源白菜（BnaA06FAH），另一個來源甘藍（BnaC05FAH）。啟動子順式作用元件分析結果表明，與BnaC05FAH相比，BnaA06FAH和擬南芥擁有更多相同的順式作用元件，此外，它們存在各自的特異順式元件。GUS組織化學染色結果顯示，BnaA06FAH和BnaC05FAH啟動子驅動GUS在不同生長時期擬南芥中表達的部位和強度都存在差異，BnaC05FAH在各種生長時期擬南芥中的表達都比BnaA06FAH強；在14 d蓮座葉、花及果莢中，不僅表達強而且表達的部位更多。綜上所述，甘藍型油菜BnaA06FAH和BnaC05FAH無論是啟動子順式元件還是啟動子驅動的組織表達上都存在差異，這些結果為深入研究甘藍型油菜BnaA06FAH和BnaC05FAH的功能奠定基礎，為油菜抗病育種工作提供種質資源。

4 結論

克隆獲得與擬南芥AtFAH同源性最高的2個甘藍型油菜FAH基因BnaA06FAH和BnaC05FAH，其編碼的氨基酸序列與擬南芥的同源性高達93.11%和92.40%。過表達BnaA06FAH和BnaC05FAH都能夠完全抑制擬南芥sscd1突變體在短日照下的模擬病斑表型。二者可能都與模擬病斑形成相關。甘藍型油菜FAH基因BnaA06FAH和BnaC05FAH的功能與擬南芥AtFAH高度相似，但兩者的啟動子在擬南芥中對下游基因的驅動無論在強度還是部位上均存在顯著差異。