普通白菜PRR5的克隆、表達及功能驗證

侯瑞澤 鮑悅 陳啟亮 毛桂玲 韋博霖 侯雷平 李梅蘭

（山西農業大學園藝學院，晉中 030800）

普通白菜（Brassica rapa ssp. chinensis Makino）是典型的種子春化型蔬菜，屬十字花科蕓薹屬，感受低溫后容易抽薹開花，但春季過早抽薹影響其品質和產量，會造成重大經濟損失。因此，闡明其成花機理以防止過早抽薹至關重要。

植物的成花過程可分為花的誘導、成花轉變和花器官的發育3個階段，此過程關系到植物的開花時間、開花數量、開花質量和花期長短［1］。在過去的幾十年里，擬南芥開花的生理和分子機制已經得到了研究，發現光周期途徑、春化途徑和環境溫度途徑主要傳遞光和溫度等外部信號；內源性信號是自主途徑、赤霉素途徑和年齡通路的主要途徑［1-8］。這些途徑既相互獨立又相互作用，形成一個復雜而獨立的調控網絡，共同調控抽薹和開花。開花決定了植物生長周期的長短，也直接關系到植物的產量和品質，因此，成花機理成為了人們研究的重點［9］。

PRR5（PSEUDO?RESPONSE REGULATOR 5）編碼一個偽響應調節器，其突變影響各種與晝夜節律相關的生物事件，例如長日光周期條件下的開花時間、早期光形態發生期間幼苗的紅光敏感性以及某些時鐘控制基因的自由運行節律周期。PRR基因之所以如此命名，是因為它們編碼類似于“響應調節蛋白”的蛋白質，在細菌、酵母和植物的磷酸化信號轉導中發揮輸出作用［10］。前人研究發現，擬南芥PRR5是一種轉錄抑制因子，但如果VP16這一強轉錄激活域與PRR5（PRR5?VP）串聯融合，則PRR5?VP將充當轉錄激活因子。超表達PRR5?VP的轉基因擬南芥具有晚開花和長下胚軸表型，這與超表達PRR5的擬南芥相反［11］。PRRs通過控制CDF來調節CO/FT從而調控開花時間［12］。在至少2個途徑中，擬南芥PRR誘導FT并促進開花［11,13］，但是在普通白菜中未見相關報道。

本研究以普通白菜‘75#’品系為試驗材料，克隆PRR5的同源基因Bra009768，分析其序列、蛋白結構和在不同器官及不同發育時期的表達情況，最后構建超表達載體，轉化擬南芥進行功能驗證，以明確其在普通白菜中的功能，為了解PRR5對普通白菜成花轉變的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

普通白菜‘75#’和擬南芥哥倫比亞野生型為實驗室保存種質資源。參照Shang等［14］方法進行材料處理，選取籽粒飽滿的種子均勻播種在含有雙層濾紙的培養皿中，催芽3 d后置于4℃低溫處理20 d，將幼苗移栽至50孔穴盤，進行常規管理。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA的合成 選取移栽后10 d的植株莖尖生長點，記作DAV10，用體視顯微鏡觀察花芽分化情況［15］，取花芽分化0級（S0）和1級（S1）時的莖尖生長點，以及根、莖、葉、花和果莢進行RT?qPCR分析，將上述樣品參照試劑盒說明書提取RNA并反轉錄為cDNA進行基因克隆和表達量分析。

1.2.2 過表達載體的構建 利用大白菜數據庫（http://brassicadb.org）查找Bra009768的序列，用NCBI中的 Primer?BLAST（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer?blast/）設計特異性引物（表1）。以S0 cDNA為模板，用引物C?Bra009768?F/R進行PCR擴增，電泳檢測、回收。將回收產物用同源臂引物G?Bra009768?F/R擴增，再回收，用無縫克隆試劑盒與線性化pBI121載體重組，并轉化至DH5α，待菌液渾濁后進行PCR驗證（引物為N?YZ），將條帶大小正確且無雜帶的菌液送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。將測序正確的菌液，參照天根質粒小提試劑盒說明書步驟進行質粒提取，使用NanoDrop 2000檢測質粒溶液濃度，?20℃保存，備用。

表1 Bra009768引物列表Table 1 Primers of Bra009768

上述過程反應體系為（共20 μL）：2×Phanta Max Master Mix 10 μL、Reverse/Forward Primer（10 μmol/L）各0.8 μL、cDNA 1 μL和RNase Free dH2O 7.4 μL。反應程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 90 s，35個循環；72℃ 10 min，4℃保存。

1.2.3 基因序列的生信分析 使用DNAMAN軟件對Bra009768進行蛋白質翻譯，以NCBI數據庫為基礎，利用MEGA 7.0軟件對Bra009768蛋白序列進行比對并構建進化樹。利用在線軟件ExPASy（https://www.expasy.org/）進行蛋白序列的理化性質分析。利用在線軟件SOPMA（https://npsa?prabi.ibcp.fr/cgi?bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測二級結構，SWISS?MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預測三級結構。利用在線分析工具Plant?mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant?multi/）進行亞細胞定位預測分析。

1.2.4 基因的表達分析 為了解Bra009768在普通白菜中的功能，取普通白菜‘75#’的根、莖、葉、花和果莢進行RT?qPCR檢測該基因在不同部位的表達情況，以DAV10、S0和S1三個時期的cDNA為模板，測定該基因在不同發育時期的表達情況，以大白菜ACTIN作為內參基因，相對定量使用內參基因的2-△△CT算法計算［16］。特異性引物見表2。

表2 RT-qPCR驗證引物Table 2 Primers of real time quantitative PCR

1.2.5 蘸花法轉化擬南芥

1.2.5.1 菌株準備 將1.2.2提取的pBI121?Bra0097 68質粒轉化至農桿菌感受態GV3101菌株，擴繁至菌液渾濁后使用特異性引物N?YZ?F/R進行菌液PCR驗證，用瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物，將條帶大小正確且無雜帶的GV3101?pBI121?Bra009768菌液?80℃保存備用。

1.2.5.2 植物材料準備 將野生型擬南芥種子用消毒液消毒后均勻播種至MS固體培養基中，先置于黑暗環境下4℃春化2 d，隨后移至光照16 h/黑暗8 h、溫度25℃、相對濕度55%的組培室中生長5-7 d。待植株兩片真葉展開后移栽至營養缽中進行常規管理。

1.2.5.3 擬南芥花序侵染 侵染菌液制備：將培養至OD600≈0.9的GV3101?pBI121?Bra009768菌體離心后重懸沉淀菌體至OD600≈0.8，加入0.05%Silwet?77，充分混勻后備用。

轉化植株準備：當野生型擬南芥移栽6周后，選擇長勢良好、抽薹期基本一致的野生型擬南芥進行花序侵染，然后將植株避光培養24 h后取出，進行常規管理。

1.2.6 轉基因擬南芥植株篩選及分子鑒定 將收獲的T0種子于MS固體選擇培養基上篩選獲得T1轉基因植株，觀察T1轉基因植株生長狀況，單株收種并繼續篩選得到T2植株。

使用DNA提取試劑盒提取野生型植株，T1和T2轉基因植株總DNA，以野生型擬南芥DNA為陰性對照，pBI121?Bra00976質粒為陽性對照，陽性轉基因植株總DNA為模板，引物為N?YZ?F/R，進行PCR分子鑒定。

1.2.7 轉基因擬南芥表達量分析 切取野生型、T1和T2轉基因擬南芥蓮座葉片，參照說明書提取蓮座葉片總RNA。使用NanoDrop 2000檢測RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，質檢合格且完整性良好的RNA使用反轉錄試劑盒構建cDNA文庫，以擬南芥ACTIN基因為內參基因（表2），Bra009768為目標基因，以T1和T2轉基因株系cDNA文庫為模板進行RT?qPCR驗證。

2 結果

2.1 基因克隆及過表達載體的構建

經瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR擴增產物，發現目的條帶大小約為1 700 bp，與目的片段大小一致（圖1?A），可進行后續的試驗。對pBI121?Bra009768的大腸桿菌菌液進行PCR驗證（圖1?B），該基因所對應條帶大小約2 000 bp且沒有雜帶，與目的基因大小相同，說明該基因已成功轉入大腸桿菌，可進行基因測序。

圖1 Bra009768的克隆及其菌液檢測結果Fig. 1 Cloning of Bra009768 and detection results of its broth

2.2 序列分析

2.2.1 基因序列分析 克隆片段經測序后得到核苷酸序列，片段大小為1 701 bp，使用DNAMAN軟件對Bra009768進行蛋白質翻譯，結果表明，Bra009768共編碼566個氨基酸，將該基因命名為BrcPRR5，GenBank ID: OQ715277。

2.2.2 氨基酸多重序列比對 BrcPRR5與BpPRR5（大白菜，Brassica pekinensis）、BnPRR5（歐洲油菜，Brassica napus）、AtPRR5（擬南芥，Arabidop?sis thaliana）、CsPRR5（亞麻芥，Camelina sativa）、RsPRR5（蘿卜，Raphanus sativus）、GaPRR5（棉花，Gossypium arboreum）、CsPRR5（歐洲栗，Castanea sativa）、FaPRR5（草莓，Fragaria ananassa）和Cc?PRR5（山核桃，Carya cathayensis Sarg）同源性分別為99.29%、98.41%、73.06%、71.19%、61.65%、38.81%、35.57%、34.44%和34.26%，同源性高，說明克隆片段是普通白菜的PRR5基因片段（圖2?A）。

2.2.3 蛋白質親緣關系分析 為進一步了解Bra009768編碼蛋白與其同源蛋白在不同植物之間的進化關系，用DNAMAN軟件構建該蛋白在不同植物物種間的系統進化樹。與Bra009768編碼蛋白親緣關系最近的是大白菜（Brassica pekinensis），其次是歐洲油菜（Brassica napus），它們同屬一個分支。與歐洲栗（C. sativa）、草莓（F. ananassa）和山核桃（C.cathayensis Sarg）親緣關系較遠（圖2?B）。

2.2.4 蛋白質理化性質分析 Bra009768蛋白由566個氨基酸組成，分子量為62 788.90 Da，理論等電點為6.98，脂肪指數為62.86，親水性總平均值為?0.792；帶負電荷的殘基總數為70，帶正電荷的殘基總數為69，不穩定指數為58.62，此類蛋白質為不穩定蛋白質。

2.2.5 二、三級結構及亞細胞定位預測 使用SOPMA預測蛋白質的二級結構，Bra009768編碼蛋白（圖2?C）的二級結構主要包括25.44%的α-螺旋、57.42%的無規則卷曲和13.25%的延伸鏈。使用SWISS?MODEL預測蛋白質的三級結構（圖2?D），二者結果相吻合。使用Plant?mPLoc對Bra009768進行亞細胞定位發現，其定位在細胞核上。

2.3 基因表達分析

為了解Bra009768在普通白菜不同器官與不同生育期中的表達情況，使用RT?qPCR方法對其進行定量分析（圖3?A），發現該基因在莖中的表達量最高，花中次之，在葉和果夾中的表達量最低，對比該基因在DAV10、S0和S1時期莖尖生長點的相對表達量（圖3?B），發現該基因在S0時表達量最高，這與RT?qPCR中莖和花表達量高相吻合，說明其對成花轉變有促進作用，有利于植株提早開花。

圖3 Bra009768在普通白菜不同器官（A）及不同發育時期（B）的表達Fig. 3 Expressions of Bra009768 in different organs（A）and different developmental stages（B）of pakchoi

2.4 抗性轉基因植株的獲得及PCR鑒定

將擬南芥T1、T2代轉基因種子播種于MS固體篩選培養基上，10 d后觀察種子發芽及植株生長情況。此時，抗性植株兩片真葉展開且葉片及根系發育良好，長勢健壯，而非抗性植株整株表現為黃化，葉片與根系生長發育停滯（圖4?A, B）。

圖4 轉基因擬南芥抗性植株篩選Fig. 4 Selection of transgenic Arabidopsis thaliana resistant plants

T0植株收種后進行T1轉基因植株篩選繼而進行T2植株篩選，均于生長室中進行常規管理，提取T1和T2轉基因植株的蓮座葉片總DNA作為模板，以同期生長的野生型擬南芥蓮座葉片總DNA為陰性對照，以pBI121?Bra009768質粒為陽性對照，以引物N?YZ?F/R進行PCR擴增，對抗性株系進行轉基因植株鑒定。結果表明，電泳條帶大小為2 000 bp，與陽性對照大小一致，陰性對照未檢測到條帶，說明BrcPRR5已經成功整合至擬南芥基因組中且能夠穩定遺傳。

將T1抗性植株收種后再次播種于MS固體篩選培養基以獲得T2轉基因植株，進行后續試驗。共篩選獲得T1抗性植株4株，T2抗性植株40株。

2.5 轉基因植株表型分析

通過表型觀察和統計學分析發現T1植株個體間存在差異，平均抽薹時間約為移栽后（12.50±2.38）d，早于野生型植株，蓮座葉片數明顯多于野生型植株，但是側薹數、株高和莖粗無明顯區別（表3，圖5?A-C）。

圖5 轉基因植株的表型觀察及BrcPRR5的RT-qPCR驗證Fig. 5 Phenotypic observation of transgenic plants and RT-qPCR validation of BrcPRR5

表3 T1、T2轉基因植株表型統計Table 3 Phenotypic statistics of T1 and T2 transgenic plants

觀察T2轉基因植株，發現其抽薹時間平均為（15.72±0.78）d，早于野生型約1.5 d；株高、莖粗均顯著高于野生型；與T1相比個體間差異明顯縮小，但是側薹數與野生型無顯著差別（表3，圖5?D-E）。

綜上所述，與野生型相比，轉基因植株的開花時間提前，株高和莖粗增加，說明在擬南芥中過表達BrcPRR5可以使擬南芥提早抽薹，花期提前，表明該基因具有促進開花的功能。

2.6 轉基因擬南芥表達量分析

為了進一步驗證BrcPRR5在擬南芥轉基因植株中的表達情況，提取經PCR分子鑒定的T1和T2轉基因植株和野生型擬南芥蓮座葉片的總RNA，以反轉錄總RNA獲得的cDNA為模板，進行RT?qPCR檢測，鑒定T1和T2轉基因株系中BrcPRR5的相對表達量（圖5?F）。結果表明，T1和T2轉基因株系中BrcPRR5表達量顯著高于野生型株系，說明BrcPRR5在擬南芥轉基因早花株系中過表達，從而促進開花，增加植株高度和莖粗。

3 討論

在擬南芥中，PRR蛋白由5個基因家族編碼，被定義為生物鐘的核心組成部分（TIMING OF CAB EXPRESSION 1（TOC1）、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9）［17-21］。在長日照植物中，TOC1（也稱PRR1）的衰減會導致晚花并增加生物量［22］，在PRR7/PRR3亞組中，擬南芥prr7突變體和PRR7過表達品系的開花時間表明PRR7促進開花［23-24］。但PRR3的過度表達導致開花晚［20］。

前人研究表明，在長日照條件下，CO轉錄受時鐘控制的藍光感光器FLAVIN?BINDING、KELCH REPEAT、F?BOX1（FKF1）、時鐘控制的循環自由因子CYCLING DOF FACTOR（CDF）和時鐘蛋白GIGANTEA（GI）控制。在這種機制中，FKF1?GI蛋白復合物通過以光依賴性方式結合并啟動CD（CO轉錄抑制因子）的降解來促進CO的轉錄［25-27］。CO通過其激活“成花素”基因FLOWERING LOCUS T（FT）轉錄的能力直接促進花的轉變［28］，也就是說，CO與FT結合可促進植株提早開花。

在PRR9/PRR5亞群中，擬南芥PRR蛋白被稱為開花啟動子［29］，PRR介導的CO與FT啟動子結合，可增加其穩定性，使FT增強轉錄和早花。此外，PRR將光照信息直接耦合到計時院并允許識別長日照［30］。PRR9/PRR5亞組基因可以控制短日照水稻的開花時間，促進長日照擬南芥開花（圖6）［11,23］。

圖6 PRR9/PRR5亞群對開花時間和植株生物量影響的模型Fig. 6 Model for the effect of the PRR9/PRR5 sub-group on flowering time and plant biomass

在轉錄組數據中，通過GO注釋分析差異表達基因發現，PRR5的差異倍數較高，由此推斷這可能會造成普通白菜花芽分化提前，因此，對該基因進行了克隆，并將克隆得到的1 701 bp開放閱讀框，編碼566個氨基酸，然后進行氨基酸序列多重比對、親緣關系分析、蛋白結構預測等生物信息學分析，確定克隆得到的基因為普通白菜PRR5基因。對于該基因在不同部位的RT?qPCR結果發現，該基因在花中、莖中都有高表達，這和PRR5在2個部位上的作用有關，除卻其在開花時間上發揮的作用，其對于植物莖粗也有一定的影響。之后進行超表達載體構建及轉基因功能驗證，通過統計植株生長指標，轉基因植株的莖粗要明顯高于野生植株，這印證了之前的結論，同時發現轉基因植株確實會使花期提前，這與前人研究的結果一致。研究結果為深入研究普通白菜成花機理奠定基礎。

4 結論

普通白菜BrcPRR5在莖和花蕾中的表達量高于葉和果莢。在S0時表達量最高，說明其對成花轉變有促進作用，有利于植株提早抽薹開花。