利用CRISPR/Cas9系統研究REVOLUTA參與煙草葉芽發育的調控

王兵 趙會納 余婧 陳杰 駱梅 雷波

（1. 貴州省煙草科學研究院 煙草行業分子遺傳重點實驗室，貴陽 550081；2. 貴州醫科大學生物與工程學院（健康醫藥現代產業學院），貴陽 550025）

植物葉芽由莖尖分生組織及側生分生組織、葉原基等組成，是直接影響作物結實和產量的重要農藝性狀之一，生產實踐中，人們通常通過調控葉芽生長發育以達到增產增效的目的［1-2］。栽培煙草（Nicotiana tabacum）作為特種葉用經濟作物之一，生產過程中因“打頂”后腋芽數量激增嚴重影響煙葉品質和產量。傳統消除腋芽主要通過“抹杈”及化學抑芽劑處理，不僅成本高，而且易導致煙草病蟲害滋生，嚴重制約煙葉生產高質量發展。隨著CRISPR/Cas9技術在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、油菜（Brassica napus）等植物株型改良中的廣泛應用，利用該技術調控煙草葉芽發育將會逐步實現［3-6］。當前關于煙草葉芽分子調控研究還較少，挖掘調控葉芽發育的相關基因，對于在煙草生產中減工降本和減少農藥使用具有重要的意義。

HD?Zip III（homeodomain?leucine zipper protein III）作為植物特有的轉錄因子家族，廣泛參與調控植物多種細胞分化，如分生組織形成、胚胎形態建成、維管組織發育、側生器官發生及極性建立等［5,7-10］。擬南芥HD?Zip III基因家族包括5個成員（PHV/PHB/ATHB8/REV/CNA），它們存在高度保守結構域，功能呈現冗余性，除AtHB8外，其余HD?Zip III家族基因在葉原基、側根原基、頂端分生組織均有不同程度的表達，而只有rev突變體表現出分枝數量顯著減少，同時葉片發育異常［11-13］。此外，rev隱性純合突變體ifl1還觀察到纖維細胞的細胞壁增厚過程受阻［14］。相較于擬南芥顯性突變體rev?10d，phv/phb/rev三重基因突變體表現出相對較少的側根數量，說明在根發育過程中PHV、PHB、REV存在協同作用［15］。擬南芥athb8/cna/rev三重基因突變體表現出比rev單突變體更多的側枝數量, 說明在側枝形成過程中AtHB8、CNA、REV存在拮抗作用［7］。Shi等［16］通過體內外實驗證實擬南芥HD?Zip III 轉錄因子家族的REV能直接結合 STM基因，使STM表達量上調，從而促使AM（axillary meristem）起始。此外，研究還發現 STM位點在不同組織中的組蛋白甲基化修飾差異會影響 REV 對 STM的表達調控。研究表明DRN/DRNL?REV和ZPR?REV蛋白互作調控模型影響AM起始，ZPR（LITTLE ZIPPER3）在葉腋中表達并干擾 DRN/DRNL?REV相互作用以負調節STM表達控制AM 啟動［17］。在AM起始的早期階段ARGONAUTE10（AGO10）可能通過結合miR165/166并導致miRNA的降解，而miR165/166靶基因REV活性激活，從而實現REV表達對 AM 啟動的時間和空間精確調控［18］。綜上可知，HD?Zip III轉錄因子成員間以拮抗或者協同方式參與調控植株的形態發育過程。

陳浣等［19］對煙草NtHD?Zip III基因家族進行鑒定及表達數據聚類分析，結果表明相較于擬南芥HD?Zip III基因家族數量，NtHD?Zip III基因家族數量顯著增加，共鑒定到19個，其中REV基因對于葉芽的發育是必需的。REV基因參與調節分生組織形成，但因煙草缺少rev 突變體，對REV基因在葉芽發育過程中的分子機制仍有待研究。本研究將通過CRISPR/Cas9編輯系統定向突變NtREV基因的不同單靶點，通過PCR測序鑒定NtREV基因編輯形式，以期獲得煙草rev純合突變體，探究NtREV基因不同靶點在調控煙草葉芽發育中功能，為闡述NtREV在調控煙草葉芽發育的分子機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為烤煙品種 K326（Nicotiana tabacum CV. K326）、農桿菌感受態細胞菌株LB4404（Agrobacterium tumefaciens）、大腸桿菌感受態細胞Top10（Escherichia coli），均由實驗室提供。質粒小提取試劑盒、DNA純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Taq酶、DNA Marker等試劑均從天根生化科技（北京）有限公司購置。限制性內切酶Bsa I?HF、Nhe I、Spe I和T4 DNA連接酶（T4 DNA ligase）購自NEB（北京）有限公司。抗生素：氨芐青霉素（ampicillin, Amp）、卡那霉素（kanamycin,Kan）、潮霉素（hygromycin, Hyg）和利福平（rifampicin,Rif）購自天根生化科技（北京）有限公司。引物合成和基因測序由上海生工生物技術有限公司完成。pYAO?based CRISPR/Cas9植物編輯載體系統由中科院遺傳與發育生物學研究所焦雨鈴教授饋贈，該系統由sgRNA（single guide RNA）表達盒中間載體AtU6?26?sgRNA?SK和轉化植物用的終載體pCAMBIA1300?pYAO?Cas9兩部分構成。

1.2 方法

1.2.1 靶點區域選擇和pYAO?based CRISPR/Cas9載體構建 通過數據庫（Nitab v4.5: https://solgenom?ics.net/organic/Nicotiana_tabacum/genome）檢索煙草REV基因并預測REV基因外顯子和內含子數量，利用（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/?term）分析REV氨基酸序列保守結構域。利用CRISPR?P軟件（http://crispr.hzau.edu.cn）［20］在煙草REV基因目標區域搜尋靶點，通過blast 檢索最佳靶點，由于編輯系統AtU6?26?sgRNA?SK載體的AtU6?26啟動子與gRNA序列中間包括兩個Bsa I和一個EcoR I酶切位點，使用Bsa I酶切后，會分別留下與ATTG和AAAC匹配的黏性末端，因此要求在靶標序列兩端分別添加5′?ATTG?3′和5′?AAAC?3′接頭引物，用黑色加粗字體表示接頭引物靶位點序列為5′?ATTGGCTCGATATTCGACAGAATAGGG?3′和 5′?AAACCCCTATTCTGTCGAATATCGAGC?3′（C15）/5′?ATTGACAGTAGTGGAAAGTATGTCCGG?3′和5′?AAACCCGGACATACTTTCCACTACTGT?3′（C16）。使用Bsa I酶切AtU6?26?sgRNA?SK質粒，將目標基因的靶點序列連入酶切后的AtU6?26?sgRNA?SK質粒，將其轉化大腸桿菌感受態細胞Top10，涂含有Amp抗性的LB平板，挑選單克隆利用AtU6?26?sgRNA?SK載體上正向引物SK?gR?NA?F：5′?CTCACTATAGGGCGAATTGG?3′和靶點序列反向引物C15NtREV?T1R：5′?AAACCCCTATTCT?GTCGAATATCGAGC?3′做菌落PCR鑒定并測序。將測序正確的重組子用Spe I和Nhe I進行雙酶切，回收酶切片段即sgRNA cassette，同時用Spe I 酶切pCAMBIA1300?pYAO?Cas9質粒，將含有靶點序列的sgRNA cassette片段連入pCAMBIA1300?pYAO?Cas9載體，將其轉化大腸桿菌Top10，涂含有Kan抗性的LB平板，挑選單克隆利用表1中位于Spe I上下游的引物做菌落PCR鑒定并測序。

表1 本研究引物序列及用途Table 1 Sequences and purpose of primers in this study

1.2.2 煙草REV基因轉化及陽性苗檢測 將構建成功的pCAMBIA1300?pYAO?Cas9重組子轉化農桿菌感受態細胞 LB4404，在含有抗性的LB固體培養基（50 μg/mL Kan, 25 μg/mL Rif）上進行陽性克隆篩選，并通過載體引物和靶點序列引物檢測陽性菌落（表1）。挑取陽性菌落利用農桿菌介導的葉盤轉化方法進行煙草遺傳轉化，并收集T0代種子［21］。取上述收獲的T0代煙草種子，用0.1%次氯酸鈉和75%酒精進行表面消毒后，利用無菌水清洗干凈置于超凈臺滅菌濾紙上，待風干之后，將種子撒播在1/2 MS固體培養基（25 μg/mL Hyg）培養15 d主根長于2-3 cm的幼苗，移栽到草炭土中放入人工氣候箱繼續培養（溫度25℃、濕度70%、16 h光照/8 h黑暗、4 000 lx）。同等條件下種植野生型煙草作為對照。等幼苗長出5-7片葉后，取葉片，通過CTAB法分別提取待檢測陽性苗和對照苗的基因組DNA，根據pCAMBIA1300?pYAO?Cas9質粒的Hyg基因設計特異性擴增引物（表1），鑒定煙草陽性苗。

1.2.3 煙草REV突變體的檢測 依據靶點序列設計上下游檢測引物（表1），利用CTAB方法提取陽性苗基因組DNA，通過PCR擴增含有靶點序列的煙草REV基因DNA序列，同時將煙草野生型材料作為對照。擴增產物通過回收直接送測序公司進行測序。利用Chromas軟件和DNAMAN軟件對所有測序獲得的序列和煙草參考基因組REV基因序列進行比對分析，并統計編輯形式，選取純合突變體用于后續表型分析。

1.2.4 煙草REV突變體的頂芽、葉片、腋芽表型觀測 將上述檢測的發生REV基因純合編輯煙草幼苗，播種草炭土中放入人工氣候箱繼續培養，生長10 d，用體式顯微鏡觀察觀測頂芽生長情況，同時利用解剖鏡解剖REV基因編輯純合突變體的煙草頂端分生組織，參考王兵［22］掃描電鏡樣品制作方法，通過用2.5%的戊二醛固定煙草解剖組織，0.1 mol/L的磷酸緩沖液多次清洗，再用乙醇濃度梯度逐級進行脫水，將脫水的材料置入乙酸異戊酯置換乙醇，然后將煙草樣品放入液態CO2臨界點干燥，最后把樣品黏在有雙面導電膠的金屬載臺上，放入離子濺射儀中噴金，置于掃描電子顯微鏡中觀察，工作電壓為10 kV，觀察記錄煙草頂端分生組織特點，并選擇具有代表性的視野拍照記錄，同時將煙草野生型材料作為對照。

2022 年在貴州省煙草科學研究院福泉基地種植正常生長的栽培煙草純合突變體和對照 K326，采用小區試驗，3次重復，每個重復種植 30 株，行距1.1 m，株距 0.55 m，移栽密度 16 500 株/hm2，施氮量105 kg/hm2。參照煙草行業標準《 YCT142?2010煙草農藝性狀調查測量方法》，在盛花期測量每個重復生長相對一致的代表性9株煙草的自然株高和著生葉數，中心花開放50%時進行打頂同時去除已長出的腋芽，在打頂后 28 d，一次性采集煙株的腋芽（打頂后生長的）并稱重。

1.2.5 數據分析 試驗數據采用SPSS Statistics 17.0軟件進行統計分析。采用比較均值（獨立樣本t檢驗）分析編輯基因的材料和對照組的自然株高、自然葉數、腋芽鮮重等農藝性狀的差異。

2 結果

2.1 sgRNA克隆框的構建

通過數據庫，獲得煙草REV基因序列，結果表明NtREV基因含有兩個拷貝數，即NtREV1（Nitab4.5_0004624g0050.1）和NtREV2（Nitab4.5_0003131g0030.1），全長分別為6 111 bp和6 105 bp，NtREV含18個外顯子和17個內含子，NtREV氨基酸序列分析表明從N端到C端含有4個保守結構域，分別是HD結構域、Zip結構域、START結構域和MEKHLA結構域，通過比對煙草NtREV氨基酸序列，NtREV1和NtREV2氨基酸同源性高達98.93%（圖1）。為了有效編輯煙草中NtREV，在NtREV基因的第一個外顯子上選取“脫靶可能性”較低的2個靶位點，靶點引物列于表1，下劃線表示PAM序列（圖2?A）。分別將合成的煙草NtREV單靶點引物經過引物變性退火、Bsa I酶切和T4 DNA連接酶成功構建AtU6?26?sgRNA?SK載體，轉化大腸桿菌、挑單菌落、擴菌、提取質粒，用Nhe I和Spe I 對提取的AtU6?26?sgRNA?SK?NtREV重組子質粒通過雙酶切進行核酸電泳，結果顯示，泳道1-10為NtREV靶點sgRNA表達盒和NtREV靶點序列，其中sgRNA表達盒序列和NtREV靶標序列大小分別為3 507 bp 和642 bp，泳道11為AtU6?26?sgRNA?SK?NtREV重組子質粒，表明NtREV靶標序列已成功連入AtU6?26?sgRNA?SK載體（圖2?B）。

圖1 NtREV1（Nitab4.5_0004624g0050.1）和NtREV2（Nitab4.5_0003131g0030.1）氨基酸序列的同源性比較Fig. 1 Homology comparison of NtREV1 and NtREV2 amino acid sequences

2.2 植物雙元表達載體pCAMBIA1300?pYAO?Cas9?NtREV的構建

為了將AtU6?26?sgRNA?SK?NtREV重組子中sgRNA表達盒序列連入線性化的 pCAMBIA1300?pYAO?Cas9載體，使用Spe I酶切pCAMBIA1300?pYAO?Cas9載體，同時將上述獲得Nhe I和Spe I酶切回收的產物與Spe I酶切pCAMBIA1300?pYAO?Cas9載體通過T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取12個單克隆使用載體特異引物1300?gRNA?F和1300?gRNA?R進行PCR擴增初步鑒定sgRNA表達盒序列是否連入表達載體（表1），實驗結果表明，泳道1-11均擴增出sgRNA表達盒條帶，泳道12未擴增出sgRNA表達盒條帶（圖3?A），最后挑選攜帶重組子的單菌落擴菌，提取質粒，通過Xba I 和 Kpn I 進行酶切驗證pCAMBIA1300?Pyao?Cas9?NtREV最終載體是否構建成功，實驗結果表明通過雙酶切獲得大小750 bp的含有NtREV靶標的表達盒序列（圖3?B）。

圖3 植物雙元表達載體pCAMBIA1300-pYAO-Cas9-NtREV的構建Fig. 3 Construction of the plant binary expression vector pCAMBIA1300-pYAO-Cas9-NtREV

2.3 煙草轉基因及陽性苗的篩選和檢測

分別將兩個單靶點的重組子pCAMBIA1300?pYAO?Cas9?NtREV質粒轉化農桿菌感受態細胞，通過農桿菌介導的葉盤轉化法浸染煙草，將煙草葉片置于含有Hyg抗性的培養基，共獲得48株能在培養基中正常生根的幼苗，其中靶點C15植株為24株，靶點C16植株為24株（圖4）。為進一步確認抗性苗為轉基因植株，提取抗性苗葉片基因組DNA，以Hyg基因特異引物對Hyg?F和Hyg?R進行PCR擴增檢測（表1），結果（圖4）顯示，48株待檢測材料中有44株材料的DNA模板擴增出約700 bp目的條帶，表明成功獲得44株REV轉基因編輯植株，總體轉化效率為90.90%，其中靶點C15植株為21株，C15植株轉化效率為87.50%（圖4?A），靶點C16植株為23株，C16植株轉化效率為95.83%（圖4?B）。

圖4 轉基因植株檢測的核酸電泳Fig. 4 Nucleic acid electrophoresis for the detection of transgenic plants

2.4 煙草NtREV突變體的編輯形式檢測

為了驗證構建的NtREV基因編輯載體的有效性，用NtREV?CRISPR test?F/R引物對上述NtREV基因C15和C16的單靶點編輯T0代植株和野生型基因組DNA進行PCR擴增并通過測序分析編輯形式（表1）。測序結果表明，靶點C16編輯Ko?C16Ntrev基因突變體4株，其中NtREV基因靶點C16編輯的雙基因純合突變體1株，Ko?C16Ntrev?2編輯形成為NtREV1靶點PAM區域上游4位置的A堿基被刪除和NtREV2靶點PAM區域上游3位置的A堿基被刪除，距離NtREV起始密碼子183 bp位置缺失T堿基，導致NtREV氨基酸第60位置之后的移碼突變（L61S62→C61R62）；雜合編輯突變體3株，Ko?C16Ntrev?1編輯形成為NtREV1并未發生編輯和NtREV2靶點PAM區域上游4位置的A堿基被刪除，距離NtREV起始密碼子181 bp位置A堿基被替換成T堿基，導致NtREV氨基酸第60位置異亮氨酸突變為苯丙氨酸（I60→F60）；Ko?C16Ntrev?3編輯形成為NtREV1靶點PAM區域上游1位置的A堿基被G替換，上游4位置的A堿基被刪除，上游6位置的A堿基被T替換和NtREV2靶點PAM區域上游4位置的A堿基被刪除，距離NtREV起始密碼子183 bp位置缺失T堿基，180 bp 位置T堿基被替換成C堿基，185 bp位置 T堿基被替換成A堿基，導致NtREV氨基酸第59位置和第62位置未發生突變，NtREV氨基酸第60位置之后的移碼突變（L61S62→C61R62）；Ko?C16Ntrev?4編輯形成為NtREV1并未發生編輯和NtREV2靶點PAM區域上游2位置處的A替換T，距離NtREV起始密碼子181 bp位置A堿基被替換成T堿基，導致NtREV氨基酸第60位置異亮氨酸突變為苯丙氨酸（I60→F60）。

靶點C15編輯Ko?C15Ntrev基因突變體4株，其中NtREV基因靶點C15編輯的雙基因純合突變體1株，Ko?C15Ntrev?2編輯形成為靶點PAM區域上游5位置插入A堿基和NtREV1靶點PAM區域上游5位置插入A堿基，插入A堿基距離NtREV起始密碼子78 bp位置，導致NtREV氨基酸第26位置之后的移碼突變（V26R27→C26P27）；雜合編輯突變體3株，Ko?C15Ntrev?1編輯形成為NtREV1靶點PAM區域上游5位置插入A堿基和上游14位置G堿基替換A堿基，19位置A堿基替換T堿基；插入A堿基距離NtREV起始密碼子78 bp位置，64 bp 位置A堿基被替換成T堿基，69 bp位置 T堿基被替換成C堿基，導致NtREV氨基酸第22位置絲氨酸被替換成半胱氨酸（S22→C22）、NtREV氨基酸第23位置氨基酸未發生變化，NtREV氨基酸第26位置之后的移碼突變（V26R27→C26P27）；Ko?C15Ntrev?3編輯形成為NtREV1靶點PAM區域上游5位置插入A堿基和上游13和14位置TG堿基替換CA堿基；插入A堿基距離NtREV起始密碼子78 bp位置，69-70 bp TG堿基被替換成AC堿基，導致NtREV氨基酸第23位置絲氨酸被替換成精氨酸和第24位置甘氨酸被替換成精氨酸（S23G24→R23R23）、NtREV氨基酸第26位置之后的移碼突變（V26R27→C26P27）；Ko?C15Ntrev?4編輯形成為NtREV1靶點PAM區域上游5位置處插入A堿基和上游14位置G堿基替換A堿基，插入A堿基距離NtREV起始密碼子78 bp位置，69 bp位置 T堿基被替換成C堿基，NtREV氨基酸第23位置氨基酸未發生變化，NtREV氨基酸第26位置之后的移碼突變（V26R27→C26P27）（圖5）。

2.5 煙草REV突變體的表型觀測

與正常發育的野生型（圖6?I）相比，煙草NtREV單靶點的突變體均發生了不同程度頂芽缺失和葉片畸形（圖6），其中雙拷貝同源突變株系Ko?C15Ntrev?2呈現葉片畸形表型，展示出漏斗形葉、荷葉形葉等形態，表明突變體中REV基因功能受到不同程度的影響（圖6?A?F），而單拷貝同源突變體Ko?C15Ntrev?1、Ko?C16Ntrev?3 展示植株正常生長（圖6?G, H）。為了進一步分析NtREV在煙草芽發育中的功能，選擇了Ko?C15Ntrev和Ko?C16Ntrev編輯形式的rev突變體觀測表型（圖7），通過光鏡觀察可知，與野生型頂芽發育相比較（圖8?A, D, G），Ko?C15Ntrev雙拷貝同源突變表現出頂芽缺失，無法正常生長（圖8?C, F, I）；Ko?C16Ntrev單拷貝同源突變體頂芽發育正常，但是頂芽發育遲緩（圖8?B, E,H）。通過大田種植統計煙草自然株高、葉片數量和腋芽鮮重，如圖9所示，Ko?C16Ntrev突變體自然株高較野生型增加3.76%（圖9?A），Ko?C16Ntrev突變體著生葉片數減少21.47%，達到極顯著差異（圖9?B, C），相較于WT（圖9?D），Ko?C16Ntrev突變體腋芽生長形態正常，但腋芽數量和鮮重減少（圖9?E），Ko?C16Ntrev突變體腋芽鮮重較野生型顯著減少23.41%。

圖6 突變體材料和野生型材料的葉形態表型Fig. 6 Leaf morphological phenotypes of mutant and wildtype materials

圖7 煙草Ko-C15Ntrev和Ko-C16Ntrev突變體編輯形式Fig. 7 Editing forms of Ko-C15Ntrev and Ko-C16Ntrev mutants in tobacco

圖8 突變體材料和野生型材料的頂芽觀測Fig. 8 Observations of apical buds of mutant and wild-type ones

圖9 Ko-C16Ntrev突變體的自然株高、葉數、腋芽鮮重表型Fig. 9 Phenotypes of plant height, leaf numbers and fresh weight of C16Ntrev mutants

3 討論

3.1 煙草NtREV參與調節側生分生組織的發育

植物側枝的發育存在精細而又復雜的調控網絡，研究報道植物HD?Zip III轉錄因子參與調控側生分生組織的起始，尤其是擬南芥HD?Zip III基因家族成員中REV（AT5G60690）基因對AM啟動的時間和空間精確調控。栽培煙草為異源四倍體，陳浣等［19］研究表明，栽培煙草NtHD?Zip III基因家族數量是擬南芥的4倍，表明隨著染色體加倍，NtHD?Zip III基因家族成員間功能出現分化以及功能冗余。相比較于擬南芥REV，栽培煙草中REV（NtREV1和NtREV2）存在兩個拷貝，因此，研究栽培煙草的REV基因功能需要將兩個基因同源拷貝同時敲除才可能實現表型。隨著CRISPR/Cas9編輯技術日趨完善，為栽培煙草等多倍體作物的基因功能和突變體創建提供了技術支撐。本研究創制的Ntrev突變體表現出頂芽缺失、葉畸形、葉片數量和腋芽鮮重顯著減少，說明NtREV參與調控頂端分生組織、側生分生組織發育。Shi等［16］證實擬南芥中REV直接調控STM表達量，從而促進側生分生組織起始。擬南芥ago10突變體研究表明，ARGONAUTE10（AGO10）結合miR165/166，通過降解miRNA，激活REV基因，從而實現調節AM起始［18］。煙草NtREV基因發揮的功能與擬南芥AtREV功能一致，它們均參與了調節側生分生組織的發育。

煙草NtREV基因存在兩個拷貝，不同位置的單靶點的sgRNA表達盒編輯NtREV基因，導致了編輯形式多樣化，煙草rev突變體產生了不同的表型，對NtREV基因C16靶點的編輯氨基酸形式進行分析，Ko?C16Ntrev?1和Ko?C16Ntrev?4材料NtREV氨基酸第60位置異亮氨酸均突變為苯丙氨酸（I60→F60），植株表現出頂芽生長延遲，植株生長正常，而Ko?C16Ntrev?2和Ko?C16Ntrev?3編輯材料的氨基酸編碼的蛋白形式進行分析，結果表明NtREV氨基酸第60位置之后的移碼突變（L61S62→C61R62），植株表現出頂芽畸形、葉畸形等性狀。以上結果表明REV蛋白HD結構域可能參與調節株型發育相關的基因，尤其是REV蛋白HD結構域第60位置異亮氨酸調節分生組織組織分化，最終影響植株形態建成。這一結果與水稻REV缺失突變體lf1表現出側生器官極性發育缺陷的表型一致［23］。此外，具有穩定遺傳性狀的Ko?C15Ntrev和Ko?C16Ntrev突變體表型最明顯，Ko?C15Ntrev頂芽缺失，Ko?C16Ntrev葉片數量和腋芽生物量顯著下降，這些突變體還表現出葉畸形、葉漏斗形、葉荷葉形等性狀變異，這些表型的出現可能是由于脫靶效應導致假表型，也可能是由于編輯NtREV不同結構域導致功能差異［4,24］。上述突變體為后續通過轉錄組學建立煙草NtREV調控葉芽發育的分子網絡提供了重要研究材料。

3.2 煙草NtREV通過調控生長素合成影響側芽發育

煙草NtREV結構分析表明存在HD?Zip III蛋白4個保守結構域，HD和Zip結構域比較保守，參與調控靶基因的表達，而START和MEKHLA結構域在動物研究中較多，參與了外界信號接收與傳遞［25-27］。然而，植物中關于HD?Zip III蛋白START和MEKHLA結構域發揮的作用報道較少。目前，在植物中僅知道PYR蛋白START結構域充當ABA的受體結合脫落酸，調控脫落酸的信號通路［28］。后續可利用CRISPR/Cas9編輯技術對NtREV的 START和MEKHLA結構域進行定點編輯，分析其功能。

植株通過IAA極性運輸，建立生長素濃度梯度調節植物頂端優勢。擬南芥REV缺失突變體ifl1生長素轉運蛋白PIN1的定位發生異常，生長素的極性運輸能力急劇下降，表現出植物頂端優勢喪失。Brandt等［29］發現REV通過直接結合生長素合成途徑的2個關鍵酶TAA1和YUCCA5的啟動子調控元件序列（ATG/CAT）參與了生長素的合成。這些結果表明，REV在轉錄水平上與生長素關系密切。本研究創制的煙草NtREV突變體表現出頂芽缺失、葉片畸形，這可能是由于煙草NtREV中MEKHLA結構域作為受體結合生長素誘導的信號分子改變REV構象，形成二聚體激活下游生長素合成的關鍵基因引起的表型。本研究證明了REV參與頂端分生組織和腋芽的發育。然而，栽培煙草中REV與生長素合成間的關系，有待下一步利用上述突變體材料開展NtREV調控生長素合成分子機制的研究。

4 結論

本研究通過CRISPR/Cas9編輯系統成功編輯了栽培煙草中的NtREV基因，獲得了該基因不同單靶點的突變體，靶點C15雙拷貝同源突變體Ko?C15Ntrev表現出頂芽缺失表型，而靶點C16單拷貝同源突變體Ko?C16Ntrev表現出煙草葉片數量和腋芽鮮重顯著減少，表明NtREV參與了煙草頂端分生組織和腋芽發育，同時也說明基因編輯位點不同將導致植株表型出現差異。