甘肅部分地區蘋果褐腐病病原分離鑒定及拮抗細菌篩選

蔣晶晶 周昭旭 杜蕙 呂昭龍 王春明 郭建國張新瑞 李繼平1，，3

（1. 甘肅省農業科學院植物保護研究所，蘭州 730070；2. 甘肅農業大學植物保護學院，蘭州 730070；3. 農業農村部天水作物有害生物科學觀測試驗站，天水 741299）

蘋果在我國北方廣泛種植，甘肅的蘋果種植面積達44.13萬hm2，是全國蘋果的主產省份之一［1］。病蟲害導致的檢疫問題是我國蘋果國際市場準入的重要挑戰［2］。蘋果褐腐病是美國、加拿大、澳大利亞等國的檢疫對象，是嚴重危害蘋果生產的一種世界性病害，該病不僅在果樹生長期進行危害，造成花腐、果腐、枝條潰瘍等，還能引起儲藏期爛果，對蘋果產業造成嚴重威脅［3］。

蘋果褐腐病病原菌主要有6種，其中有性態3個種［4］：實生鏈核盤菌（M. fructicola）、核果鏈核盤菌（M. laxa）和果生鏈核盤菌（M. fructigena）；未發現有性態的3個叢梗孢屬種［5-7］：梅生鏈核盤菌（M.mumecola）、云南鏈核盤菌（M. yunnanensis）和多子座鏈核盤菌（M. polystroma）。雖然不同的褐腐病菌種群都能侵染果樹引起褐腐病，但其分布及寄主偏好有一定差異。目前，世界上報道的能侵染蘋果并引起褐腐病的病原菌種類主要有：M. fructicola［8］、M. laxa、M. fructigena［9］、M. polystroma［10］和M.yunnanensis［11］，其中陜西、河北、北京、云南、新疆等蘋果產區的優勢致病菌為（M. yunnanensis），甘肅地區蘋果褐腐病的致病菌種類報道較少。因此，明確蘋果褐腐病致病菌種類對甘肅地區蘋果病害防治具有重要指導意義。

對蘋果褐腐病的防治，生產上主要采用化學殺菌劑，如波爾多液、甲基托布津等［12］。化學殺菌劑的長期大量使用，導致病原菌產生抗藥性，同時農藥殘留會污染生態環境，影響蘋果的品質與安全。生物防治是一種高效、無毒、無污染的防治策略，且不易使病原菌產生抗藥性。近年來，越來越多的生物農藥被開發應用，毛殼菌是一種極具生防潛力的真菌，能夠產生大量的纖維素酶［13］，可以抑制病原菌生長，如球毛殼菌（Chaetomium globosum）可用于防治蘋果褐腐病并開發為防治蘋果采后病害的生防制劑［14］；芽孢桿菌屬的菌株因其營養需求簡單、繁殖生長快、代謝產物豐富、可產抗逆性芽孢等特點而具有顯著的生防潛力，成為研發生防菌劑的理想菌株［15］。目前報道的對褐腐病菌有顯著抑制作用的芽孢桿菌有死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）、高地芽孢桿菌（B. altitudinis）和特基拉芽孢桿菌（B.tequilensis）［16-17］，但國內外對于拮抗M. yunnanensis的生防芽孢桿菌篩選研究較少。

本研究從甘肅蘋果主產區（靜寧及榆中縣）采集褐腐病病果，分離并鑒定病原菌。以其為供試靶標菌，從本實驗室已保存的內生拮抗菌庫中篩選優良拮抗菌，測定其對褐腐病防病效果，明確拮抗菌種類與特性，旨在探明引起甘肅靜寧縣及榆中縣蘋果褐腐病的病原菌種類，以期獲得對蘋果褐腐病有較強生防作用的拮抗菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試病原真菌：蘋果褐腐病病果采集于甘肅省靜寧縣和榆中縣，品種為‘秦冠’和‘紅富士’，并于同地區采集‘秦冠’和‘紅富士’健康果實若干作為離體接種試驗用材料。

供試拮抗細菌：健康葡萄植株的根、莖、葉中分離篩選得到的5株具有廣譜性的內生拮抗菌，由甘肅省農業科學院植物保護研究所經濟作物病害研究室保存。

1.1.2 供試培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（NA）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；牛肉膏蛋白胨培養基（NB）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 采用常規組織分離法［18］，在超凈工作臺內選取發病中期的褐腐病病果，在病健交界處用手術刀切取約為5 mm×5 mm的組織，用75%的酒精浸泡30 s，再用1%次氯酸鈉溶液處理3 min，滅菌水沖洗3次后，在滅菌干燥濾紙上自然風干，然后置于PDA培養基中，25℃恒溫培養箱黑暗培養3-4 d，待長出菌落后挑取菌絲尖端進行純化，轉接至PDA斜面4℃保存。對分離所得的菌株依據病害縮寫（HF）+字母原則對其進行命名。

1.2.2 病原菌回接（柯赫氏法則） 采用室內離體果實打孔接種菌餅和孢子懸浮液的方法進行致病性測定。選擇大小均勻、成熟度一致無病蟲斑和機械損傷的‘秦冠’和‘紅富士’蘋果作為接種材料。試驗前將果實用75%酒精擦洗，隨后用滅菌水沖洗3次，待果實表皮自然風干后備用。

打孔接種菌餅法：先用滅菌打孔器（直徑5 mm）在果實赤道部位打孔，深度為3 mm，用滅菌打孔器（直徑5 mm）在事先活化5 d的新鮮菌落邊緣打取菌餅，菌絲面緊貼于孔內，以空白PDA菌餅為對照。

打孔接種孢子懸浮液法：用移液器吸取濃度約為1×105個/mL的孢子懸浮液15 μL注于孔內，以接種滅菌水為對照。以上每處理3個果實，每個果實設3個接種點，共9個重復。將處理后的果實置于鋪有保濕紗布的密封15 L塑料盒中，25℃ 12 h光暗交替培養，第5天觀察并統計果實發病情況，對發病果實進行病原菌再分離。

1.2.3 病原菌形態鑒定 將分離純化的病原菌轉接于PDA平板上，置于25℃恒溫培養箱中黑暗培養。6 d后進行菌落形態、生長速率、孢子大小等觀察和測定。參照Lane［19］形態學鑒定方法和《真菌鑒定手冊》［20］進行供試菌株的形態學鑒定。

1.2.4 病原菌分子生物學鑒定 將菌株接種在鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上進行培養，25℃恒溫黑暗培養5 d后收集菌絲，采用CTAB法［21］提取菌株基因組DNA。選取真菌通用引物ITS1（5′?TCCGTAG?GTGAACCTGCGC?3′）和ITS4（5′?TCCTCCGCTTATT?GATATGC?3′）進行擴增。25 μL PCR反應體系為2×PCR Master Mix 12.5 μL、正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL、DNA模板1.0 μL，ddH2O補至25 μL。PCR擴增程序為94℃ 2 min；94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環；72℃ 10 min，4℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將陽性條帶的樣送生工生物工程（上海）有限公司測序，所測序列在NCBI網站進行BLAST同源性比對分析比對。下載GenBank中的相似性較高的序列用MEGA 5.0程序中的鄰接法構建系統發育樹，共循環1 000次。

1.2.5 拮抗細菌的篩選與鑒定

1.2.5.1 拮抗細菌的篩選 以蘋果褐腐病病原菌為靶標菌，采用平板對峙法［22］篩選拮抗細菌。將病原菌置于PDA培養基25℃活化培養7 d后打成直徑0.5 cm的菌餅，接種在PDA培養基中央，5株拮抗菌經NA培養基28℃，48 h活化后點接在距菌餅2.5 cm處，每平板4點，以不接生防菌為對照，重復3次。置于25℃培養，待對照病菌長滿培養皿時，測量菌落直徑，計算抑制率。

1.2.5.2 離體果實防效測定 參考Sadeghian等［23］方法，用紅富士蘋果測定拮抗菌對褐腐病菌的抑制活性。拮抗菌菌懸液的制備：將拮抗菌接種于150 mL的NB培養基，在28℃，轉速150 r/min搖培48 h，到達穩定期得到菌懸液。選取大小均一的紅富士蘋果果實，用75%酒精擦洗，滅菌水沖洗后晾干，用滅菌打孔器（直徑5 mm）在果實赤道部位打5 mm（寬）×3 mm（深）的傷口，用于接種。設置3個處理：（1）預防組，接種M. yunnansis菌餅前24 h往孔口內接種15 μL菌懸液。（2）治療組，接種M. yunnansis菌餅時接種菌懸液及接種M. yunnansis菌餅24 h后接種菌懸液。（3）對照組，僅接種M.yunnansis菌餅。以上每處理3個果實，每個果實設3個接種點，共9個重復。將處理后的果實置于鋪有保濕紗布的密封15 L保鮮盒中，25℃ 12 h光暗交替培養，接種生防菌液5 d后測量病斑大小。

1.2.5.3 拮抗菌形態學及生理生化指標測定 將拮抗菌株于NB和PDA平板上劃單菌落，37℃培養24 h，參照東秀珠《常見細菌系統鑒定手冊》［24］進行菌落形態觀察和生理生化特性鑒定，并對菌株進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察形態特征。

1.2.5.4 拮抗菌分子生物學鑒定 采用天根細菌基因組提取試劑盒，按照說明方法提取菌株基因組DNA。根據16S rRNA兩端的保守序列，采用細菌鑒定通用引物27F（5′?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3′）和1492R（5′?GGTTACCTTGTTACGACTT?3′）及gyrA基因引物gyrA?F（5′?CAGTCAGGAAATGCG?TACGTCCTT?3′）和gyrA?R（5′?CAAGGTAATGCTC?CAGGCATTGCT?3′）進行擴增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。50 μL PCR反應體系為10×buffer（含2.5 mmol/L Mg2+）5.0 μL、Taq聚合酶（5 U/μL）1.0 μL、dNTP（10 mmol/L）1.0 μL、正反向引物各0.5 μL、基因組DNA 1.0 μL和ddH2O 41.0 μL。16S rRNA擴增程序為94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃45 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃ 10 min。gyrA擴增程序為94℃ 5 min；94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃1 min，30個循環；72℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認PCR擴增片段，并送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。用NCBI網站將所得序列與GenBank數據庫進行同源性比對分析，用MEGA 5.0程序中的鄰接法構建系統發育樹。

1.2.6 數據處理 數據用Excel 2007處理后，采用統計學軟件SPSS 17.0對各組數據進行單因子方差分析，結果以“平均值±標準差”表示，組間采用t檢驗法多重比較其差異顯著性，以P＜0.05作為判斷其顯著性的標準。

2 結果

2.1 蘋果褐腐病病原菌分離鑒定及致病性測定

2.1.1 蘋果褐腐病病原菌的分離 蘋果褐腐癥狀主要表現為果實黃褐色軟腐并在表面形成褐色圓形斑點，后期病斑蔓延至全果，褐色圓形斑點變為藍黑色并凹陷致使果實皺縮，提前黃化形成畸形僵果（圖1?A），部分病果上出現點狀灰色霉層（圖1?B）。從自然發病的蘋果果實上分離純化得到5個形態一致的培養物，命名為HF?A-HF?E。

圖1 蘋果褐腐病果實自然發病癥狀及病原菌接種癥狀Fig. 1 Disease characteristics of brown rot of apple and symptoms of pathogenic inoculation

2.1.2 病原菌致病性測定 將分離的真菌回接于健康蘋果上進行致病性測定。接種2 d后接種部位附近出現褐色病斑，5 d后接種部位褐色軟腐狀嚴重，已經完全覆蓋果實的一側，果實表面陸續出現藍黑色菌絲斑塊，有少量白色菌絲及分生孢子產生，且菌餅接種后病斑擴展速率為7.3 mm/d，快于孢子懸浮液接種的病斑擴展速率6.9 mm/d；菌餅接種的腐爛病斑上更容易長出菌絲和分生孢子；病原菌在‘紅富士’品種上的致病力明顯強于‘秦冠’（圖1?CF）；發病癥狀與自然條件下發病癥狀一致且對照均未發病。

2.1.3 病原菌的形態特征 分離得到的5株病原菌在PDA平板上生長良好［（8.5±0.59）mm/d］，菌落最初為灰白色，后逐漸加深，最后變為灰褐色。菌落中間顏色較深，邊緣整齊，氣生菌絲貼近培養皿生長，呈灰褐色纖維絮狀或絨氈狀，背面可見黑色的基質或黑環。分生孢子梗不分枝，或二叉狀分枝，分枝多呈銳角，產孢梗長短不一。分生孢子無色，單孢［（10-21）μm×（7-12）μm］，鏈狀排列，卵圓形、長橢圓形和檸檬形，產孢量較少（圖2）。結合Lane［19］的褐腐病菌形態鑒定方法和魏景超《真菌鑒定手冊》［20］，5個分離株形態特征均與（M.yunnanensis）模式菌相似。

圖2 蘋果褐腐病菌的菌落形態及分生孢子形態Fig. 2 Colony and conidial morphology of apple brown rot bacteria

2.1.4 ITS序列擴增與系統發育分析 5個分離菌株的ITS片段大小均為482 bp，且比對后只有1個堿基存在差異，因此，將5個分離物視為同一種菌，序列上傳至GenBank，獲得登錄號為OL440404。在NCBI中進行BLAST分析，分離株ITS序列與M.yunnanensis相似度在99%以上。從GenBank數據庫中下載相似性最高的同種和近似種褐腐病菌菌株的若干序列，以核盤菌科蠟盤菌屬（Rutstroemia paludosa）為外群，用MEGA 5.0軟件，采用鄰接法構建系統發育進化樹。結果（圖3）表明，代表菌株HF?A與M. yunnanensis聚在同一分支，與M.fructigena歸在同一個大分支，表明甘肅靜寧縣及榆中縣蘋果褐腐病的病原菌為M. yunnanensis，與M.fructigena親緣關系較為接近。

圖3 基于rDNA-ITS序列采用鄰接法構建的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree constructed using the neighbourjoining based on rDNA-ITS sequences

2.2 拮抗菌的抑菌效果與鑒定

2.2.1 拮抗菌對蘋果褐腐病菌的抑制作用 從5株廣譜性較好的拮抗菌中篩選得到3株對M.yunnanensis具有較好抑制效果的菌株。其中，拮抗菌X2?2和Zyx?3對褐腐病菌的抑制效果最好，抑菌率分別為（81.29±0.57）%和（80.08±0.66）%，抑菌帶寬度分別達（7.42±0.17）mm和（5.42±0.51）mm，各處理間差異均達顯著水平（P＜0.05）（表1）。因X2?2菌株對褐腐病菌的抑制效果最好，后續對其進行離體果實上抑菌效果測定（圖4）。

圖4 拮抗菌X2-2對蘋果褐腐病菌的拮抗效果Fig. 4 Effect of antagonistic bacteria X2-2 against M. yun?nanensis

2.2.2 拮抗菌在果實上的抑菌效果 在25℃光暗交替條件下，第5天時處理A（治療組）全部發病，果實上病斑面積達24.3 cm2，對照病斑遍及果實的一側（面積達50.5 cm2），整體防治效果達52.0%；處理B（治療組）和處理C（預防組）病斑面積分別為0.5和0.4 cm2，防效分別為98.4%和98.8%，且差異不顯著，防治效果優于處理組A（圖5和圖6）。表明菌懸液和病原菌同時接種或提前接種菌懸液均能發揮較好的防治效果。

圖5 接種時間對病斑面積和防治效果的影響Fig. 5 Effect of inoculation time on lesion area and control effect

圖6 X2-2菌懸液對蘋果褐腐病病斑擴展的抑制效果Fig. 6 Inhibition effect of X2-2 bacterial suspension on the lesion expansion of M. yunnanensis

2.2.3 X2?2菌株的形態學鑒定 將菌株接種至PDA平板上，28℃培養5 d后，拮抗菌X2?2菌落似火山堆，呈乳白色不透明，表面粗糙有褶皺，邊緣不規則。顯微觀察發現，菌體呈桿狀，革蘭氏染色陽性（圖7）。

圖7 拮抗菌X2-2的單菌落（A）和革蘭氏染色（B）Fig. 7 Colony（A）and Gram stain（B）of antagonistic bacterium X2-2

2.2.4 X2?2菌株的生理生化特性 根據常見微生物鑒定手冊可知，該拮抗細菌與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens的生理生化特性一致（表2）。

表2 拮抗菌X2-2的生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical identification results of antagonistic bacterium X2-2

2.2.5 X2?2菌株的分子鑒定 在NCBI數據庫中BLAST比對分析發現，菌株X2?2的16S rRNA序列與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、甲基營養型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）和貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）同屬近緣種，序列同源性達100%，從構建的系統發育樹中可以看出與其處在同一分支上，無法明確菌株X2?2種的分類地位。菌株X2?2的gyrA基因序列與已知解淀粉芽孢桿菌KU904810、KU847915和LC096068的gyrA基因序列同源性分別為99%，菌株X2?2與以上解淀粉芽孢桿菌屬同一分支，可將菌株X2?2鑒定為解淀粉芽孢桿菌（圖8）。根據gyrA基因序列構建的系統發育樹，可將更接近的解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌清晰區分為2個分支。

圖8 基于16S rRNA（A）和gyrA（B）基因序列構建的拮抗菌X2-2的系統發育樹Fig. 8 Phylogenetic tree of antagonistic bacterium X2-2 based on 16S rRNA (A) and gyrA (B) sequences

3 討論

本試驗對采自甘肅省靜寧縣和榆中縣蘋果產區的褐腐病果上分離的菌株，采用ITS序列結合形態學將其鑒定為云南鏈核盤菌（M. yunnanensis），這與報道的中國梨和蘋果的褐腐病菌優勢種為M.yunnanensis的研究結果一致［11］，而與周芳［25］和牛程旺等［26］報道的山西省和新疆蘋果、梨褐腐病主要病原菌種群為M. fructigena［25］研究結果不一致，這可能與不同地區的生態環境、氣候類型等因素有關。M. yunnanensis是2011年發現于我國云南省的新種，分布于云南的大部分地區［6］，同時也在北京、河北、陜西、甘肅、新疆及遼寧等省（市）采集到，可以危害桃、杏、山楂、蘋果及梨等［27-28］。據報道，不同地區蘋果褐腐病菌種群之間存在差異，本試驗僅對甘肅靜寧縣和榆中縣蘋果主產區的蘋果褐腐病進行了研究，但有關全省和全國不同地區的褐腐病菌種群的遺傳多樣性需進一步探索，為該病原菌的種群分化及不同地區核果類及仁果類果實褐腐病的有效防治提供理論依據。

芽孢桿菌屬由于其具有較好的抑制植物病原菌的能力，并且其產生的芽孢具有很強的抗逆性，有利于生防菌劑的生產、劑型加工及在環境中存活、定殖與繁殖，目前被廣泛用于農業領域［29］。近幾年，已有學者篩選出了一些拮抗M. fructigena的貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）［30］、拮抗M. fructicola的解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）和特基拉芽孢桿菌（B. tequilensis）［17］、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）［31］，但國內外對于拮抗M. yunnanensis的生防菌篩選研究較少，本研究通過平板對峙篩選出抑菌效果最好的解淀粉芽孢桿菌X2?2，對M.yunnanensis的菌絲抑制率達（81.29±0.57）%，在離體果實上打孔接種拮抗菌菌懸液24 h后再接種病原菌菌餅，拮抗菌的防治效果高達98.8%，說明該拮抗菌具有很強的附著能力，能在受傷果實表面迅速定殖，有效降低果實病斑擴展速度。現在普遍認為，與病原物進行營養物質與空間位點競爭是拮抗微生物防治病害最主要的作用機制之一［32］。本研究中接種M. yunnansis菌餅同時接種菌懸液的處理與接種M.yunnansis菌餅24 h后接種菌懸液的處理，培養5 d后防治效果分別為98.4%和52.0%，說明病原菌與拮抗菌同時接種時拮抗菌能夠更快地利用果實機械傷口處的營養，阻止病原菌的侵入和擴展，這也很好解釋了為什么越早接種拮抗菌生防效果越好。但關于該菌株在實際儲藏果實上的防治效果還需進一步試驗驗證。

4 結論

甘肅靜寧縣及榆中縣的蘋果褐腐病的病原菌為云南鏈核盤菌（M. yunnanensis）。以該病原菌為靶標，以分離自葡萄的5株優良拮抗內生菌為研究對象，篩選得到抑制效果最好的拮抗細菌X2?2，將其鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。該菌株具有較好的生防潛力，病原菌與菌懸液同時接種至離體果實，培養5 d后防效仍達98.4%，可用于開發蘋果采后病害防治的生防制劑。