辣椒CUL家族基因的鑒定與表達(dá)分析

劉 芳, 段盼盼, 魏 敏, 匡小妍, 馬 艷, 張 濤, 馬玉虎, 魏兵強(qiáng)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

辣椒(CapsicumannuumL.)在世界范圍內(nèi)被廣泛種植,在種植的早期,主要用于調(diào)味和作為藥用植物。如今,辣椒被鮮食或加工成蔬菜和香料。辣椒也被視為觀賞植物,其提取物被用于各種醫(yī)藥產(chǎn)品和化妝品中[1]。辣椒對(duì)逆境脅迫反應(yīng)敏感,具有喜溫不耐熱的特性。干旱、低溫、高鹽等脅迫會(huì)嚴(yán)重影響辣椒的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝調(diào)控,進(jìn)而導(dǎo)致辣椒產(chǎn)量與品質(zhì)的下降[2]。缺水、干旱和高鹽等非生物脅迫因素會(huì)對(duì)植物生產(chǎn)力產(chǎn)生破壞性影響,因?yàn)樗鼈儠?huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,并損害葉綠體[3]。研究發(fā)現(xiàn),辣椒在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段,更容易受到干旱脅迫帶來的危害[4];在鹽脅迫下,辣椒的多項(xiàng)生理指標(biāo)都受到負(fù)調(diào)節(jié)作用[5];低溫弱光可抑制辣椒幼苗的生長(zhǎng)和光合特性[6]。植物在受到這些逆境脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生防御機(jī)制,例如:植物受到干旱脅迫會(huì)形成堅(jiān)硬的葉子,不會(huì)因萎蔫而受到永久性損害,氣孔變小和數(shù)量的減少也是干旱條件下植物生存的另一種適應(yīng)[7]。外源脫落酸(ABA)能夠顯著提高超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性及其基因表達(dá)水平,進(jìn)而增強(qiáng)辣椒對(duì)低溫誘導(dǎo)氧化脅迫的抵抗性[8]。富含水飛薊素的蜂蜜作為一種天然的多生物刺激劑,可以通過重塑抗氧化防御系統(tǒng)和提高植物生產(chǎn)力來減輕辣椒植物的鹽脅迫效應(yīng)[9]。在辣椒的生長(zhǎng)發(fā)育過程和生產(chǎn)中經(jīng)常遭到干旱、鹽堿和低溫等脅迫,導(dǎo)致辣椒的品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低[10],所以對(duì)辣椒響應(yīng)逆境脅迫中的功能方面的研究很有必要。

CUL蛋白是一種分子支架,在涉及泛素的細(xì)胞蛋白質(zhì)的翻譯后修飾中起著關(guān)鍵作用。在真核生物中,CUL蛋白(特別是Cullin-4)因其在介導(dǎo)蛋白質(zhì)泛素化中的作用而聞名,與形成E3連接酶或Cullin RING連接酶(CRL)的復(fù)合物的多種細(xì)胞成分結(jié)合[11]。CUL基因參與水稻植株的生長(zhǎng)和發(fā)育,在脅迫響應(yīng)中也起著重要作用,植物中CUL基因的突變會(huì)導(dǎo)致植物表型受干擾[12-13]。前人研究發(fā)現(xiàn),CUL家族是一類在進(jìn)化上非常保守的蛋白質(zhì)家族,酵母中CDC53是最早被發(fā)現(xiàn)的CUL蛋白[14]。目前在酵母中發(fā)現(xiàn)3個(gè)CUL基因,線蟲有6個(gè)CUL基因(CUL1～CUL6)[15],果蠅中有5種CUL基因(CUL1～CUL5)[16]。人類基因組中共發(fā)現(xiàn)9個(gè)CUL基因,分別為Cullin1、Cullin2、Cullin3、Cullin4A、Cullin4B、Cullin5、Cullin7以及Cullin類似基因(PARC、APC2)[16]。CUL基因在植物中也廣泛存在,目前已在水稻中鑒定了13個(gè)CUL基因[11];在擬南芥中發(fā)現(xiàn)5個(gè)CUL基因[16];從矮牽牛雄蕊中共鑒定出8個(gè)CUL基因,其中5個(gè)為Cullin1類型,2個(gè)為Cullin3類型,1個(gè)為Cullin4類型[17]。CUL家族基因參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、花粉的自交不親和性以及植物的免疫反應(yīng)等過程,在植物的整個(gè)生命過程中發(fā)揮重要作用[18]。對(duì)辣椒中CUL基因的研究尚未見報(bào)道。本研究對(duì)辣椒CUL基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)以及表達(dá)模式分析,將幫助我們?nèi)媪私釩UL基因家族的生物學(xué)功能。

1 材料和方法

1.1 辣椒CUL基因家族成員的鑒定

根據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)獲得了水稻CUL家族的基因賬號(hào)(ID)[11]。首先,從水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rice.uga.edu/)中下載水稻的CUL蛋白序列。然后,使用隱馬爾可夫模型(HMM)在線工具(HMMER v3.3.2,http://hmmer.janelia.org/)初步獲得辣椒的CUL蛋白。根據(jù)水稻的CUL蛋白序列,通過茄科植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(sol genomics network)中的辣椒品種遵辣1號(hào)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP搜索[19]。使用Pfam蛋白家族數(shù)據(jù)庫(kù)(Pfam:Home page(xfam.org))[20]和SMART[SMART:Main page(embl heidelberg.de)][21]在線工具驗(yàn)證辣椒的CUL候選基因。為了進(jìn)一步了解CUL蛋白物理和化學(xué)性質(zhì),我們使用ProtParam(ExPASy Compute pI/Mw工具)[22]預(yù)測(cè)辣椒CUL蛋白的等電點(diǎn)(pI)和相對(duì)分子質(zhì)量(Mw)。利用Euk-mPLoc 2.0服務(wù)器(sjtu.edu.cn)預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位[23]。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和分析

對(duì)辣椒、擬南芥、番茄和馬鈴薯CUL蛋白序列使用ClustaW進(jìn)行多序列比對(duì)。系統(tǒng)發(fā)育樹使用MEGA-X中的最大似然法(Maximum likelihood)構(gòu)建。在系統(tǒng)發(fā)育樹中,將參數(shù)設(shè)置為:bootstraps重復(fù)次數(shù)1 000,其余設(shè)置選擇默認(rèn)選項(xiàng)。然后通過Evolview (https://evolg enius.info/evolview-v2)[24]顯示結(jié)果。

1.3 染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序和啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用Mapchart 2.2對(duì)辣椒染色體上CUL基因的物理位置進(jìn)行定位,繪制物理位置圖。使用在線工具GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)顯示基因結(jié)構(gòu)。通過在線軟件 (http://meme-suite.org/index.html)預(yù)測(cè)CaCUL的保守基序[25]。使用TBtools提取CaCUL基因起始密碼子上游2 000 bp的區(qū)域。然后,通過PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)每個(gè)CaCUL啟動(dòng)子中的順式作用元件。

1.4 共線性分析

我們使用MCScanX分析辣椒和擬南芥CUL基因的共線性,用Circos軟件(http://circos.ca/software/download/circos/)展示CUL基因的共線性關(guān)系圖。

1.5 材料及CUL家族基因的表達(dá)譜分析

通過PepperHub(http//pepperhub.hzau.edu.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載辣椒CUL基因的不同組織及不同發(fā)育階段、激素和非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),獲得基因表達(dá)量[26],最后使用TBtools繪制表達(dá)量熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒CUL基因成員的鑒定與分析

在辣椒基因組中共鑒定出12個(gè)CUL基因,并根據(jù)與擬南芥CUL基因的序列相似性對(duì)12個(gè)基因進(jìn)行了命名(表1)。CaCUL的編碼序列(CDS)長(zhǎng)度為777～2 952 bp。CaCUL蛋白由258～983個(gè)氨基酸組成,相對(duì)分子質(zhì)量大小為29 553 240～114 416 790。CUL蛋白家族成員的等電點(diǎn)為5.28～8.65;CaCUL4.3的等電點(diǎn)最高(8.65),CaCUL1.5的等電點(diǎn)最低(5.28)。CaCUL的不穩(wěn)定性指數(shù)均大于40.00,其蛋白質(zhì)相對(duì)不穩(wěn)定。此外,其蛋白質(zhì)親水性平均系數(shù)(GRAVY)范圍為-0.507(CaCUL3A.2)～-0.094(CaCUL1.7),表明它們是親水性蛋白質(zhì)(GRAVY<0)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,所有CUL都被預(yù)測(cè)位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。CaCUL4.2具有雙重定位(細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核),CaCUL3A.1、CaCUL4.1、CaCUL4.3、CaCUL3A.2、CaCUL1.5、CaCUL1.7蛋白均位于細(xì)胞質(zhì)。CaCUL1.1、CaCUL1.2、CaCUL1.3、CaCUL1.4、CaCUL1.6均位于細(xì)胞核。

表1 辣椒CaCUL基因家族編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

2.2 辣椒CUL基因家族的染色體位置和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

辣椒CUL基因隨機(jī)且不均勻地分布在1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、6號(hào)、11號(hào)、0號(hào)染色體上(圖1)。第2條染色體上有4個(gè)基因,分布密度較高;第6條染色體上有3個(gè)基因,其余每條染色體上只有1～2個(gè)基因。

圖1 辣椒CUL基因家族在染色體上的分布

為了更好地理解辣椒和其他植物物種之間的進(jìn)化關(guān)系,在5個(gè)擬南芥CUL基因、12個(gè)辣椒CUL基因、16個(gè)馬鈴薯CUL基因和18個(gè)番茄CUL基因編碼的蛋白質(zhì)之間構(gòu)建了一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。系統(tǒng)發(fā)育樹分支顯示,CaCUL基因家族共分為4個(gè)亞家族,其中第1亞族只有CaCUL1.2和CaCUL1.62個(gè)基因;第2亞族有4個(gè)基因,占CaCUL基因家族總數(shù)的33.3%;第3亞族無CUL基因;第4亞族有6個(gè)基因,在CaCUL基因家族中占比最大,為50.0%。系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)化距離表明,辣椒與雙子葉植物番茄的親緣關(guān)系最近。

五角星、正方形、圓形和三角形分別代表辣椒、番茄、馬鈴薯和擬南芥,數(shù)字表示進(jìn)化距離。

2.3 辣椒CUL基因家族的基因結(jié)構(gòu)和保守基序及其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析

外顯子/內(nèi)含子模式分析結(jié)果(圖3)表明,所有CaCUL基因的編碼序列都包含內(nèi)含子,CaCUL基因的內(nèi)含子數(shù)量在1到18個(gè)之間,CaCUL1.1、CaCUL1.2、CaCUL1.3具有的內(nèi)含子數(shù)目最多。CaCUL3A.1、CaCUL3A.2僅有1個(gè)內(nèi)含子。辣椒CUL基因序列中共鑒定出10個(gè)保守基序(圖4A),motif 1、motif 4分布得最多。CaCUL3A.1、CaCUL3A.2、CaCUL1.1、CaCUL1.2、CaCUL1.3含所有保守基序,motif 10在CaCUL4.3中缺失,motif 8在CaCUL1.4中缺失,而CaCUL4.2只有motif 4。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果(圖4B)表明,所有CaCUL蛋白均含有Cullin結(jié)構(gòu)域,但有4個(gè)成員(CaCUL1.5、CaCUL1.6、CaCUL1.7和CaCUL4.2)缺少Cullin-Nedd8結(jié)構(gòu)域,而且只有CaCUL1.6有NB-ARC結(jié)構(gòu)域。

圖3 辣椒CUL基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

A圖中方框中的數(shù)字表示motif序號(hào)。

2.4 辣椒CUL基因家族的啟動(dòng)子順式作用元件分析

在本研究中,為了分析CaCUL啟動(dòng)子內(nèi)的順式作用元件,從TBtools中檢索了每個(gè)CaCUL基因起始密碼子(ATG)上游的2 000 bp序列。順式作用元件借助PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)。使用Microsoft Office Excel軟件處理數(shù)據(jù),然后構(gòu)建表格和圖表。結(jié)果表明,有9個(gè)順式作用元件主要對(duì)低溫和非生物脅迫作出反應(yīng)(圖5)。植物響應(yīng)低溫、激素信號(hào)的順式元件普遍存在于CaCUL的啟動(dòng)子區(qū)域。這些順式作用元件包括脫落酸反應(yīng)元件、茉莉酸甲酯反應(yīng)元件、水楊酸反應(yīng)元件、生長(zhǎng)素反應(yīng)元件和赤霉素反應(yīng)元件,表明這些激素可能調(diào)節(jié)CaCUL的表達(dá)。值得注意的是,厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件廣泛存在于CaCUL1.2中,提示CaCUL1.2可能受到厭氧誘導(dǎo)信號(hào)的調(diào)控;茉莉酸甲酯響應(yīng)元件在CaCUL4.1中廣泛存在,CaCUL4.1可能受到茉莉酸甲酯信號(hào)的調(diào)控。分析結(jié)果表明,CaCUL可能參與辣椒的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控,以及在響應(yīng)低溫和非生物脅迫等方面發(fā)揮重要作用。

A:CaCUL3A.1;B:CaCUL1.1;C:CaCUL4.1;D:CaCUL4.2;E:CaCUL4.3;F:CaCUL3A.2;G:CaCUL1.2;H:CaCUL1.3;I:CaCUL1.4;J:CaCUL1.5;K:CaCUL1.6;L:CaCUL1.7。

2.5 辣椒CUL基因家族的共線性分析

本研究構(gòu)建了辣椒與擬南芥的共線圖,以進(jìn)一步推測(cè)CUL家族的系統(tǒng)發(fā)育機(jī)制。在辣椒CUL基因內(nèi),存在1對(duì)共線基因?qū)?CaCUL1.2和CaCUL1.3)(圖6A)。在辣椒與擬南芥CUL基因間,存在5個(gè)共線基因?qū)Α９灿?個(gè)CaCUL基因與4個(gè)擬南芥CUL基因表現(xiàn)出共線性關(guān)系,其中CaCUL1.2與AT1G02980,CaCUL1.2和AT4G02570共線,CaCUL1.4與AT1G02980共線,CaCUL4.3與AT5G46210;CaCUL3A.2與AT1G69670共線(圖6B)。

圖6 CUL基因共線性分析

2.6 CaCUL基因的表達(dá)模式分析

2.6.1CaCUL基因在不同組織中的表達(dá)模式分析 辣椒CUL基因在不同生長(zhǎng)階段、不同組織中存在明顯的表達(dá)差異(圖7),CaCUL1.3的相對(duì)表達(dá)量整體較高,在成熟的根、授粉后55 d的胎座、授粉后60 d的種子中高表達(dá),且在成熟的根中的相對(duì)表達(dá)量約為幼葉的6倍,表明CaCUL1.3可能參與了根的發(fā)育。相反,CaCUL1.6在所測(cè)組織中相對(duì)表達(dá)量較低。此外,CaCUL1.5在F5～F7階段都有表達(dá),在F7(花蕾大小為1.20 cm)中的相對(duì)表達(dá)量最高,而在其他組織中幾乎不表達(dá),這一結(jié)果進(jìn)一步表明,CaCUL1.5可能與花的發(fā)育有關(guān)。CaCUL1.1在授粉后50 d、55 d、60 d的果皮和授粉后55 d的胎座中的相對(duì)表達(dá)量略高于其他組織。而CaCUL1.4基因在這些組織中的相對(duì)表達(dá)量很低甚至不表達(dá),由此推測(cè)CaCUL1.4基因在辣椒這些組織中不具有組織表達(dá)特異性。

L1:幼葉;AL:成熟的葉;AR:成熟的根;AS:成熟的莖;F5:花蕾大小為0.80 cm的花;F6:花蕾大小為1.00 cm的花;F7:花蕾大小為1.20 cm的花;P10:花瓣;O10:子房;STA10:花藥;G6:授粉后35 d的果皮;G9:授粉后50 d的果皮;G11:授粉后60 d的果皮;ST1:授粉后10 d的胎座和種子;ST2:授粉后20 d的胎座和種子;S5:授粉后30 d的種子;S11:授粉后60 d的種子;T3:授粉后20 d的胎座;T6:授粉后35 d的胎座;T10:授粉后55 d的胎座。圖中數(shù)據(jù)表示相對(duì)表達(dá)量。

2.6.2CaCUL基因在低溫、NaCl處理下的表達(dá)模式分析 由圖8可知,低溫處理后CaCUL1.1、CaCUL1.3、CaCUL1.6、CaCUL4.2在葉片中表達(dá)量下調(diào),表達(dá)受到抑制;與對(duì)照相比,CaCUL1.1、CaCUL1.2、CaCUL1.6、CaCUL4.2和CaCUL4.3在根中上調(diào)表達(dá)。在經(jīng)過低溫處理1.5 h后,CaCUL1.3基因在辣椒根中的表達(dá)量顯著上調(diào),達(dá)到峰值,其表達(dá)量在處理12.0 h后又下降,但與對(duì)照差距不大。低溫處理后CaCUL1.3基因在辣椒葉片中的表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢(shì)。低溫處理后CaCUL1.1在辣椒根中的表達(dá)量上調(diào),在處理12.0 h后下降。CaCUL1.4和CaCUL1.5基因在低溫處理后沒有顯著變化,說明這2個(gè)基因不參與低溫調(diào)控機(jī)制,對(duì)低溫脅迫沒有應(yīng)答反應(yīng)。

L:葉; R:根。圖中數(shù)據(jù)表示相對(duì)表達(dá)量。

在NaCl處理下,辣椒CUL基因家族在不同時(shí)間點(diǎn)的根和葉片中表達(dá)量存在差異(圖9)。大部分基因在根中上調(diào)表達(dá),其中,CaCUL1.3在根中上調(diào)表達(dá)最顯著,在處理1.0 h時(shí)達(dá)到最大值,約為對(duì)照的1.5倍,而在辣椒葉片中的表達(dá)水平在處理后下調(diào)。在NaCl處理下CaCUL3A.2、CaCUL4.1、CaCUL1.1和CaCUL1.2基因在辣椒根中的表達(dá)量整體上隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上調(diào)。經(jīng)NaCl處理后,CaCUL1.3、CaCUL3A.1、CaCUL1.1、CaCUL1.6、CaCUL4.2、CaCUL1.7和CaCUL1.2基因在葉片中的表達(dá)量整體上都顯著下調(diào),而在根中正好相反,說明這7個(gè)基因受鹽脅迫處理后在葉片和根中行使了不同的功能。經(jīng)NaCl處理后,CaCUL1.4和CaCUL1.5基因在2種組織中表達(dá)量無明顯變化,表明這2個(gè)基因在葉片和根中對(duì)鹽脅迫沒有應(yīng)答反應(yīng)。

3 討論

本研究在辣椒基因組中共鑒定了12個(gè)CUL基因,分別分布在1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、6號(hào)、11號(hào)、0號(hào)染色體上。據(jù)報(bào)道,在水稻中鑒定了13個(gè)CUL基因[11],在擬南芥中發(fā)現(xiàn)5個(gè)[16],在矮牽牛雄蕊中共鑒定出8個(gè)CUL基因[17],在扁桃中發(fā)現(xiàn)有15個(gè)PsdCUL成員[27]。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明,所有CUL都被預(yù)測(cè)位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。前人研究結(jié)果表明,AtCUL1蛋白主要定位在細(xì)胞核中,但也有少量定位在細(xì)胞質(zhì)中[11];小麥中發(fā)現(xiàn)有25個(gè)CUL蛋白位于細(xì)胞核中,2個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)中,12個(gè)具有雙重定位(細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì))[18],故推測(cè)CUL蛋白家族主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)揮作用。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示,辣椒CUL基因和番茄CUL基因之間同源性很高,進(jìn)化關(guān)系很近,這可能是由于辣椒和番茄都屬于雙子葉茄科植物,本研究結(jié)果與馬鈴薯CUL1和番茄的親緣關(guān)系最為密切,這是因?yàn)樗鼈兌紝儆谇芽浦参颷28]。本研究預(yù)測(cè)到辣椒CUL基因家族共有10個(gè)保守基序,在各CUL基因中都有分布,屬于高保守基序;研究發(fā)現(xiàn)不同亞族之間保守基序的相似性與亞族間的系譜進(jìn)化密切相關(guān),辣椒CUL基因家族除了個(gè)別基因之間的基序分布和數(shù)量存在差異外,各亞族保守基序大部分相同,表明辣椒CUL基因家族在進(jìn)化過程中具有高度保守性。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明,CaCUL蛋白含有Cullin、Cullin-Nedd8、NB-ARC 3種結(jié)構(gòu)域,且高度保守,這與扁桃的CUL家族,馬鈴薯CUL1的相關(guān)研究結(jié)果相似[27-28]。Hori等[29]研究發(fā)現(xiàn),Nedd8結(jié)構(gòu)域與CUL的連接激活了它們的E3連接酶介導(dǎo)的泛素化活性。根據(jù)辣椒中3個(gè)CUL基因缺失Nedd8結(jié)構(gòu)域推測(cè)這些蛋白質(zhì)不介導(dǎo)E3連接酶活性。

順式作用元件參與調(diào)控植物體內(nèi)各種生物過程中基因的表達(dá),在植物生長(zhǎng)發(fā)育及其對(duì)非生物或生物應(yīng)激反應(yīng)、激素響應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[30-34]。水稻等作物中CUL家族成員上游2 000 bp啟動(dòng)子序列中存在著大量的激素等脅迫響應(yīng)元件,且CUL的差異表達(dá)與分布在其啟動(dòng)子區(qū)域的多個(gè)應(yīng)激和信號(hào)響應(yīng)元件的存在相關(guān)[11];在扁桃PsdCUL啟動(dòng)子序列上也發(fā)現(xiàn)激素類和抗逆類等脅迫響應(yīng)元件[27],這與本研究結(jié)果相一致。CaCUL啟動(dòng)子區(qū)含有多種順式作用元件,研究結(jié)果表明,CaCUL可能受激素和脅迫調(diào)控,且在植物生長(zhǎng)、發(fā)育及抗逆等方面發(fā)揮重要作用。另外發(fā)現(xiàn),辣椒CUL和擬南芥CUL之間存在共線性關(guān)系,這將有助于推測(cè)CaCUL基因功能。在辣椒CUL基因中發(fā)現(xiàn)1對(duì)片段復(fù)制基因。基因家族成員的擴(kuò)增主要依賴于基因復(fù)制[35],在扁桃PsdCUL基因中發(fā)現(xiàn),具有2對(duì)片段復(fù)制基因,PsdCUL家族成員在進(jìn)化上發(fā)生復(fù)制擴(kuò)增現(xiàn)象[27]。這與本研究結(jié)果相似,表明CaCUL家族成員在進(jìn)化上可能也發(fā)生了復(fù)制擴(kuò)增現(xiàn)象。

對(duì)辣椒CUL基因家族成員的組織表達(dá)模式進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CUL基因表達(dá)模式具有差異。這表明它們?cè)诶苯返纳L(zhǎng)發(fā)育過程中可能起著不同的作用。對(duì)CaCUL基因組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),CaCUL1.3在成熟的根中表達(dá)量最高,其次是授粉后55 d的胎座、授粉后60 d的種子和果皮以及授粉后35 d的果皮,有研究發(fā)現(xiàn)水稻OsCUL1基因在種子中高表達(dá)[36],以上結(jié)果表明CUL可能與辣椒根和種子的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān),這還需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。此外,CaCUL1.5在F7(花蕾大小為1.20 cm)中的表達(dá)量最高,而在其他組織中幾乎不表達(dá)。這一結(jié)果進(jìn)一步表明,CaCUL1.5可能在花的發(fā)育過程中扮演重要的調(diào)控作用。CaCUL基因家族成員具有一定的組織特異性,說明其在辣椒不同器官組織中發(fā)揮特定的作用。

在不同植物中相同基因具有多種調(diào)控機(jī)理,且在應(yīng)對(duì)低溫和鹽分等非生物脅迫時(shí)的表達(dá)也表現(xiàn)出差異性。辣椒大部分CUL基因響應(yīng)低溫應(yīng)答。據(jù)報(bào)道,OsCUL1-3受到冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)水平特異性上調(diào)[36],這與本結(jié)果相似。CaCUL1.3基因在經(jīng)過低溫處理1.5 h后在辣椒根中的表達(dá)量顯著上調(diào),達(dá)到峰值。CaCUL1.4和CaCUL1.5基因在低溫處理后表達(dá)量沒有顯著變化,這說明這2個(gè)基因不參與低溫調(diào)控機(jī)制。NaCl處理后,辣椒大部分CUL基因在根中表達(dá)量上調(diào),在葉片中部分CUL基因表達(dá)量下調(diào),表達(dá)受到抑制。尤其是CaCUL1.3在NaCl處理1.0 h時(shí)在根中表達(dá)量達(dá)到最大值,但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)量整體呈下降趨勢(shì);CaCUL1.3在低溫和鹽脅迫下在辣椒根中的表達(dá)量都具有顯著上調(diào)趨勢(shì),表明CaCUL1.3可能是提高辣椒耐低溫和耐鹽能力的一個(gè)潛在基因。CaCUL家族基因受到低溫、鹽處理的誘導(dǎo)表達(dá)水平發(fā)生變化,說明CUL可能參與調(diào)節(jié)植物適應(yīng)不良環(huán)境的過程,在應(yīng)對(duì)不同脅迫時(shí)其表達(dá)模式的復(fù)雜程度也不同。據(jù)報(bào)道OsCUL1基因受到各種非生物脅迫(鹽、熱和干旱)上調(diào)表達(dá)[36]。本研究發(fā)現(xiàn),CUL在脅迫處理下的差異表達(dá)與它們的啟動(dòng)子區(qū)域中存在各種順式元件一致,進(jìn)一步表明它們除了非生物脅迫反應(yīng)外,還參與生長(zhǎng)和發(fā)育,這與水稻CUL家族的相關(guān)研究結(jié)果相似[11]。

4 結(jié)論

本研究鑒定了12個(gè)辣椒CUL基因家族成員,并分析了它們的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、結(jié)構(gòu)域以及順式作用元件。結(jié)果表明,CaCUL基因家族在進(jìn)化過程中高度保守。順式元件的分析結(jié)果表明,CaCUL基因有多種低溫、激素和應(yīng)激反應(yīng)元件。共線性分析結(jié)果表明,辣椒和擬南芥的CaCUL基因家族之間有5對(duì)共線性基因?qū)?CaCUL基因之間有1對(duì)片段重復(fù)基因?qū)Α１磉_(dá)量數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明,CaCUL1.3在辣椒根中表達(dá)量最高,CaCUL1.5在F7(花蕾大小為1.20 cm)中的表達(dá)量最高。辣椒大部分CUL基因?qū)Φ蜏丶胞}脅迫有應(yīng)答反應(yīng),低溫處理下CaCUL1.1、CaCUL1.3、CaCUL1.6、CaCUL4.2在葉片中表達(dá)受到抑制,表達(dá)量下調(diào);CaCUL1.3基因在經(jīng)過低溫和鹽脅迫處理后在辣椒根中上調(diào)表達(dá)。上述結(jié)果證明,CaCUL基因在辣椒生長(zhǎng)、發(fā)育及應(yīng)對(duì)非生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用。