粉蕉PAL家族基因的鑒定及其在逆境脅迫下的表達(dá)分析

曾 堅(jiān), 王舒婷, 周潔薇, 胡 偉, 曾力旺

(1.韶關(guān)學(xué)院廣東省粵北食藥資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院,廣東 韶關(guān) 512005;2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所,海南 海口 571101;3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技信息研究所,海南 海口 571101)

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶,PAL廣泛存在于各種植物中[1],能夠?qū)⒈Ｊ氐腖-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸。在植物中,苯丙烷代謝途徑是重要的次生代謝途徑,它會(huì)影響植物中多種次級(jí)代謝產(chǎn)物合成,如類黃酮、木質(zhì)素、花青素等,因此會(huì)參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程和響應(yīng)多種非生物環(huán)境脅迫[2-3]。此外,PAL還是重要激素水楊酸合成途徑的限速酶,因此,PAL在植物的生物脅迫過程中也發(fā)揮著重要作用[4]。在植物中,PAL通常是由小基因家族編碼,最早從大麥中分離出了具有苯丙氨酸解氨酶活性的PAL[5]。目前已經(jīng)在不同物種中鑒定到PAL家族基因,例如擬南芥[6]、水稻[7]、蘋果[8]等。PAL家族基因影響著植物的不同生長(zhǎng)發(fā)育過程,如擬南芥中的PAL2和PAL4在種子中表達(dá)較高,而PAL1、PAL2和PAL4在莖中表達(dá)較高[1]。在蘋果中,PAL在果實(shí)發(fā)育的早期和成熟期高表達(dá)[8],表明其可能影響著果實(shí)的發(fā)育過程和最終果實(shí)的品質(zhì),這和PAL影響類黃酮和花青素等次生代謝產(chǎn)物的合成和含量密切相關(guān)[3]。PAL和木質(zhì)素的合成密切相關(guān),木質(zhì)素對(duì)提高植株抵御干旱和病原菌侵染等逆境脅迫能力具有重要作用,在擬南芥中PAL能促進(jìn)木質(zhì)素的合成來增加細(xì)胞壁的厚度[6];在小麥中,TaPAL基因在根中的高表達(dá)可能提高了植株響應(yīng)干旱脅迫的能力[9];在感染不同病原菌后的玉米、小麥和水稻中,PAL的表達(dá)水平都顯著提高[10-12]。因此,PAL基因家族在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中都發(fā)揮不同的作用。

香蕉(Musassp.)是熱帶地區(qū)廣泛種植的水果,也是數(shù)百萬人的重要糧食。大多數(shù)可食用栽培香蕉起源于種內(nèi)或種間雜交的Musaacuminata和Musabalbisiana[13]。香蕉在生長(zhǎng)過程中會(huì)遭受到香蕉枯萎病、低溫、干旱等不同逆境的影響,對(duì)香蕉的產(chǎn)量和最終果實(shí)品質(zhì)產(chǎn)生重要影響[14-15]。而次級(jí)代謝產(chǎn)物影響著香蕉果實(shí)品質(zhì)和抵抗不同逆境脅迫的能力,因此,研究香蕉中PAL家族基因種類和不同逆境處理下的表達(dá)情況具有重要意義。本研究擬從香蕉基因組中鑒定得到PAL家族基因,并研究它們的進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域,同時(shí)對(duì)其在不同器官、果實(shí)發(fā)育和成熟的不同階段以及非生物/生物脅迫響應(yīng)中的表達(dá)模式進(jìn)行分析,以期為香蕉遺傳改良提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料和處理方法

粉蕉(Musa.ABB group,Pisang Awak subgroup)是一種具有良好風(fēng)味的優(yōu)良香蕉品種,對(duì)逆境具有很好的適應(yīng)性。將粉蕉苗種植在無菌土壤塑料盆中,在生長(zhǎng)室中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為溫度28 ℃,相對(duì)濕度70%,光照周期16 h/8 h,光合光子通量密度200 μmol/(m2·s)。為了分析不同組織中PAL家族基因的表達(dá),從5葉期幼苗中采集根和葉樣本;為了分析果實(shí)發(fā)育過程中PAL家族基因的表達(dá),采集開花后0 d、20 d和80 d的果實(shí),同時(shí)收集采收后3 d和6 d的果實(shí)。用300 mmol/L NaCl或200 mmol/L甘露醇連續(xù)灌溉香蕉幼苗(5葉期)7 d,分別作為鹽脅迫處理和滲透脅迫處理。將5葉期香蕉幼苗置于4 ℃生長(zhǎng)室22 h作為低溫脅迫處理。采集處理后葉片樣本(每個(gè)處理5 g)進(jìn)行非生物處理的PAL家族基因表達(dá)分析。將香蕉幼苗根部(5葉期)浸泡在每1 ml含有1×106個(gè)香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種(Foc4)分生孢子的孢子懸液中2 h。將香蕉幼苗根部(5葉期)浸入無菌蒸餾水中2 h作為對(duì)照。所有接種植株移栽到無菌土壤塑料盆中,在生長(zhǎng)室中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為:溫度28 ℃,相對(duì)濕度70%,光照周期16 h/8 h,光合光子通量密度200 μmol/(m2·s)。培養(yǎng)2 d后,采集根系樣品進(jìn)行PAL家族基因表達(dá)分析。每個(gè)樣本包含2個(gè)生物重復(fù)樣本。

1.2 香蕉PAL家族基因的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用從PF00221中下載的HMMs模型,從香蕉A基因中搜索得到MaPAL基因序列,然后利用得到的MaPAL基因序列構(gòu)建新的HMMs模型,利用新HMMs模型從基因組中搜索鑒定MaPAL基因。使用保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和PFAM數(shù)據(jù)庫 (http://pfam.sanger.ac.uk/)來驗(yàn)證鑒定得到的MaPAL家族基因。利用下載得到的AtPAL和OsPAL基因編碼的氨基酸序列,以MEGA-X中的MUSCLE方法進(jìn)行序列比對(duì),使用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,Bootstrap值設(shè)置為1 000。采用Wolf Psort網(wǎng)站(https://wolfpsort.hgc.jp/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3 香蕉PAL家族基因結(jié)構(gòu)及編碼蛋白質(zhì)特性

通過ExPASy數(shù)據(jù)庫(http://expasy.org/)對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用MEME軟件和InterProScan數(shù)據(jù)庫對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行鑒定。采用GSDS數(shù)據(jù)庫(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.4 轉(zhuǎn)錄組分析

RNA測(cè)序中的RNA提取、文庫制備和測(cè)序等工作由美吉生物技術(shù)有限公司(中國(guó)上海)完成。進(jìn)行RNA-seq分析樣本的收集過程參考之前的研究[16]。每個(gè)樣本包含2個(gè)生物重復(fù)序列。測(cè)序平臺(tái)為Illumina GAII(Illumina,San Diego,CA,USA)。FASTX(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)和FastQC(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)用于刪除接頭序列和低質(zhì)量序列。通過Tophat V.2.0.10將粉蕉樣本clean read與香蕉基因組進(jìn)行比對(duì)[17],使用Cufflinks進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組組裝[18]。基因的表達(dá)值使用FPKM值表示。使用DEGseq工具鑒定差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果

2.1 MaPAL家族基因的鑒定

根據(jù)MaPAL基因編碼的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)建HMM模型,總共從香蕉A基因組中鑒定到8個(gè)MaPAL基因,分別命名為MaPAL1～MaPAL8(表1)。香蕉MaPAL家族基因中MaPAL6編碼的氨基酸序列最長(zhǎng),為782個(gè)氨基酸殘基,MaPAL7編碼的氨基酸序列最短,為700個(gè)氨基酸殘基。MaPAL1～MaPAL8編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為7.596×104～8.595×104,等電點(diǎn)為5.76～6.23,MaPAL2基因編碼的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)最低,MaPAL3基因編碼的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)最高。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,MaPAL1～MaPAL8編碼的蛋白質(zhì)都定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。為了研究香蕉MaPAL家族基因的進(jìn)化關(guān)系,分別下載了擬南芥和水稻中的AtPAL和OsPAL家族基因編碼的氨基酸序列(表1),采用NJ法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖1所示,所有PAL基因可以分成兩類,除MaPAL6基因外,所有香蕉PAL基因和擬南芥及水稻的PAL基因聚在一起,而MaPAL6基因則單獨(dú)成一支,說明MaPAL6基因和水稻、擬南芥PAL基因之間的同源性低。

圖1 香蕉、擬南芥和水稻的PAL家族基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

表1 MaPAL家族基因信息

2.2 MaPAL家族基因結(jié)構(gòu)及編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析

為了研究香蕉MaPAL家族基因可能的功能和其結(jié)構(gòu)差異,利用MEME數(shù)據(jù)庫從MaPAL家族基因編碼的蛋白質(zhì)中鑒定到10個(gè)保守基序,并利用InterPro數(shù)據(jù)庫對(duì)10個(gè)保守基序分別進(jìn)行鑒定,結(jié)果(表2)顯示,Motif1～Motif10都含有結(jié)構(gòu)域IPR001106,該結(jié)構(gòu)域功能為芳香族氨基酸裂解酶。所有的MaPAL家族基因編碼的蛋白質(zhì)都呈現(xiàn)出類似的基序組成(圖2),MaPAL6缺少M(fèi)otif10。進(jìn)一步對(duì)MaPAL家族基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,MaPAL6只有1個(gè)內(nèi)含子,而其他7個(gè)基因包含2個(gè)內(nèi)含子(圖3)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明,同一類有類似的基因結(jié)構(gòu),這也和系統(tǒng)發(fā)育樹中MaPAL6基因單獨(dú)成一類的結(jié)果一致。

圖2 MaPAL家族基因編碼蛋白質(zhì)的保守基序分布

圖3 MaPAL家族基因的結(jié)構(gòu)分析

表2 保守基序Motif1～Motif10的注釋

2.3 粉蕉不同組織MaPAL家族基因的表達(dá)

對(duì)MaPAL家族基因在粉蕉不同組織的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果(圖4)表明,除MaPAL5外,其他7個(gè)MaPAL基因在根中都高表達(dá)(FPKM>5);在葉片中,MaPAL1、MaPAL4、MaPAL6、MaPAL7這4個(gè)基因高表達(dá),在果實(shí)中則只有MaPAL4高表達(dá)。MaPAL家族基因中只有MaPAL4基因在根、葉和果實(shí)中高表達(dá),在根中高表達(dá)的MaPAL家族基因最多。

圖4 粉蕉不同組織MaPAL家族基因的表達(dá)分析

2.4 粉蕉果實(shí)不同發(fā)育階段MaPAL家族基因的表達(dá)

為研究MaPAL家族基因在果實(shí)發(fā)育階段的功能,對(duì)該家族基因在粉蕉果實(shí)不同發(fā)育階段中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。如圖5所示,在果實(shí)發(fā)育早期(花后0 d和20 d),只有MaPAL3和MaPAL4基因呈現(xiàn)出高表達(dá)(FPKM>5);在果實(shí)發(fā)育后期(花后80 d、采收后3 d、收獲后6 d),MaPAL4、MaPAL6、MaPAL8基因高表達(dá)。MaPAL2和MaPAL5基因在果實(shí)發(fā)育后期沒有表達(dá),可能不參與該過程;而MaPAL4基因在果實(shí)發(fā)育的所有階段都呈現(xiàn)出高表達(dá),推測(cè)該基因可能在果實(shí)發(fā)育過程中發(fā)揮了作用。

圖5 粉蕉果實(shí)發(fā)育和成熟階段的MaPAL基因表達(dá)分析

2.5 不同逆境下MaPAL家族基因的表達(dá)

為研究MaPAL家族基因的功能,本研究分析了在不同逆境條件下該家族基因的表達(dá)情況。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),除了MaPAL5基因外,其他MaPAL家族基因在逆境下都有響應(yīng)表達(dá)(圖6)。在低溫脅迫下,3個(gè)基因(MaPAL1、MaPAL4、MaPAL7)表現(xiàn)出上調(diào),MaPAL2基因表現(xiàn)出下調(diào);在滲透脅迫下,4個(gè)基因(MaPAL1、MaPAL3、MaPAL4、MaPAL7)表現(xiàn)出上調(diào),沒有基因呈現(xiàn)出下調(diào);在鹽脅迫下,2個(gè)基因(MaPAL1和MaPAL7)表現(xiàn)出上調(diào),沒有基因呈現(xiàn)出下調(diào);在Foc4侵染下,2個(gè)基因(MaPAL2和MaPAL8)表現(xiàn)出下調(diào),沒有基因呈現(xiàn)出上調(diào)。在這些響應(yīng)的MaPAL家族基因中,MaPAL1和MaPAL7基因在3種非生物脅迫下都表現(xiàn)出上調(diào),MaPAL4基因在低溫和滲透脅迫下都表現(xiàn)出上調(diào),表明這3個(gè)MaPAL基因在粉蕉的非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮了作用。在低溫和滲透脅迫下,粉蕉中的MaPAL基因相比巴西蕉明顯受到更顯著的誘導(dǎo)[19],表明此時(shí)MaPAL基因在粉蕉中受誘導(dǎo)的程度更高。

Foc4:香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種。

3 討論

香蕉是一種重要的熱帶和亞熱帶水果和糧食作物,在全球130多個(gè)國(guó)家都有栽培[20-24]。與其他作物相比,香蕉的研究進(jìn)展較慢[25]。次生代謝物在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生物/非生物脅迫的響應(yīng)中起著重要作用[26]。而PAL是苯丙烷代謝途徑的限速酶,也影響著木質(zhì)素、類黃酮、花青素等多種重要次級(jí)代謝物的合成[2-3]。本研究從香蕉基因組中鑒定出8個(gè)PAL基因,根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系將香蕉MaPAL家族基因分為兩大類。MaPAL基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域也證明了這些基因?qū)儆赑AL家族基因。MaPAL家族基因編碼的氨基酸序列中都含有Motif5,Motif5中包含高度保守的亞甲基咪唑酮結(jié)構(gòu)(Ala-Gly-Ser,MIO)。在遺傳進(jìn)化關(guān)系上,MaPAL6基因被單獨(dú)分為一個(gè)亞類,這個(gè)結(jié)果也和其他研究結(jié)果[27]相一致。蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)的分析也驗(yàn)證了香蕉MaPAL家族基因的鑒定和分組。在擬南芥和水稻中的PAL基因數(shù)量分別是4個(gè)和9個(gè)[28],在香蕉中的數(shù)量是8個(gè),這表明PAL蛋白屬于小基因家族基因編碼的蛋白質(zhì)。

香蕉果實(shí)的品質(zhì)很大程度上取決于它的發(fā)育和成熟過程[13]。次級(jí)代謝物的生產(chǎn)和含量對(duì)果實(shí)的成熟和品質(zhì)具有重要影響,PAL對(duì)花青素和類黃酮等物質(zhì)的生物合成起著關(guān)鍵作用,PAL在蘋果和葡萄中都和果實(shí)的發(fā)育密切相關(guān)[8]。在本研究中,不同MaPAL基因在不同的果實(shí)發(fā)育階段表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式,如MaPAL3和MaPAL4基因只在果實(shí)發(fā)育早期表現(xiàn)出高表達(dá),而MaPAL4基因則在果實(shí)發(fā)育的所有階段都呈現(xiàn)出高表達(dá),表明這些基因在果實(shí)發(fā)育和成熟過程中可能起著重要作用。在巴西蕉中,MaPAL4基因也在果實(shí)發(fā)育的所有階段都呈現(xiàn)出高表達(dá),但幾乎所有MaPAL基因(除MaPAL1外)在花后0～20 d都表現(xiàn)出高表達(dá)[19],這表明不同香蕉品種中的MaPAL基因在果實(shí)發(fā)育階段可能具有不同的功能。

香蕉對(duì)枯萎病菌、鹽、干旱或寒冷等脅迫因素敏感,容易造成產(chǎn)量的減少和果實(shí)品質(zhì)的降低[14-15]。類黃酮和花青素等物質(zhì)能夠清除活性氧,提高植物的抗氧化能力,而PAL基因和類黃酮和花青素等物質(zhì)的合成相關(guān)。因此植物在遭受逆境威脅時(shí),PAL基因的表達(dá)往往發(fā)生變化。如黃瓜和番茄中的PAL基因在非生物逆境脅迫時(shí)被誘導(dǎo),表達(dá)水平提高[29-30]。本研究也發(fā)現(xiàn)MaPAL基因表達(dá)受到非生物脅迫誘導(dǎo)或抑制,其中MaPAL1和MaPAL72個(gè)基因在低溫、滲透、鹽脅迫中都被顯著誘導(dǎo),表明MaPAL基因可能在香蕉對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)中起著重要的作用。但不同香蕉品種中的PAL基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)可能存在差異。例如,楊會(huì)曉等[19]發(fā)現(xiàn)巴西蕉中PAL基因的表達(dá)也會(huì)受到非生物逆境脅迫的誘導(dǎo)。比較了粉蕉和巴西蕉中受非生物脅迫誘導(dǎo)的PAL基因情況后發(fā)現(xiàn),兩個(gè)品種中受到顯著誘導(dǎo)的PAL基因數(shù)目基本相同,然而在粉蕉中,受到低溫和滲透脅迫誘導(dǎo)的PAL基因的表達(dá)水平要高于巴西蕉。有研究結(jié)果表明,粉蕉在非生物逆境脅迫下的耐受性比巴西蕉更強(qiáng)[25]。這些結(jié)果表明粉蕉中的PAL基因顯著受非生物逆境脅迫誘導(dǎo)可能與其較強(qiáng)的非生物脅迫抗性有關(guān)。香蕉的抗病性也是一個(gè)非常重要的農(nóng)藝性狀,特別是香蕉枯萎病嚴(yán)重影響著香蕉的產(chǎn)量和品質(zhì)。在擬南芥中,pal突變體表現(xiàn)出對(duì)香蕉枯萎病易感[31]。粉蕉作為重要的香蕉品種也易受到枯萎病的影響[16]。在本研究中,MaPAL2和MaPAL8基因的表達(dá)顯著受到Foc4侵染的抑制,表明這2個(gè)基因可能參與了響應(yīng)Foc4侵染過程。有研究結(jié)果表明,酚類物質(zhì)參與了植物對(duì)病菌侵染的抵抗過程,可以通過抑制PAL基因的表達(dá)來減少次生代謝物的產(chǎn)生,提高植物抵抗病菌侵染的能力[32],這也說明MaPAL基因可能在香蕉抗枯萎病中也發(fā)揮著作用。

4 結(jié)論

本研究從香蕉基因組中鑒定到8個(gè)PAL基因,并對(duì)它們的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析。表達(dá)分析結(jié)果顯示,MaPAL基因參與香蕉的發(fā)育、成熟和對(duì)生物/非生物脅迫的響應(yīng)。本研究結(jié)果表明,MaPAL4基因在所有果實(shí)發(fā)育和成熟階段都表現(xiàn)出高表達(dá)。MaPAL1和MaPAL7基因可能對(duì)非生物脅迫響應(yīng),MaPAL2和MaPAL8基因在Foc4侵染時(shí)表達(dá)被明顯抑制,可能響應(yīng)Foc4病菌的侵染。和巴西蕉相比,MaPAL基因在粉蕉中被低溫和滲透脅迫誘導(dǎo)的水平更高。