煙草青枯病發病程度與土壤環境間的響應關系

白茂軍, 高正鋒, 張力元, 范成平, 潘首慧, 董延鑫, 楊 索, 王 瑩, 陳 汶, 楊小龍, 岑 浩, 田玉琴, 昝建朋, 吳 海

(1.貴州省煙草公司安順市公司,貴州 安順 561000;2.云南農業大學,云南 昆明 650201;3.貴州中煙工業有限責任公司,貴州 貴陽 550009)

煙草是中國重要的經濟作物,由于耕地土壤養分失衡,加上中國煙草難以實現輪作與休耕,導致土傳病害頻發[1-2]。其中,青枯病是煙草主要的細菌性土傳病害之一,病原菌入侵植株后,會破壞維管束組織,從而造成煙草枯萎,因此青枯病是煙草生產上的一大毀滅性病害,造成的損失較大[2-3]。目前,種植抗性品種[4]、化學防治[5-6]、生物防治[7]、煙田輪作[8-9]等是防治煙草青枯病的主要方式,但在病害發生時,化學防治可能會導致病原菌抗藥性增強并造成環境污染,而生物防治效果不穩定,在復種指數高的煙田上只依靠農業防治措施的效果也十分有限。因此,通過探究發病程度與土壤微環境間的關系來篩選預防青枯病的原生微生物用于防治青枯病是必不可少的。有研究發現,土壤理化性質等對煙草青枯病發生的影響較大[10-12]。還有研究發現,提高土壤pH值及增加土壤有機質、鉀含量等可提高煙株對青枯病的抗性[13]。此外,植株根際中土壤微生物數量及群落結構的變化也會影響病害的發生。如樊俊等[14]研究發現,根瘤菌屬、鞘氨醇單胞菌屬細菌的操作分類單元(Operational taxonomic unit,OTU)數量是導致煙草青枯病發生的重要因素。同時,在青枯病發生過程中,健康煙株根際中土壤細菌擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)細菌的相對豐度均大于發病煙株根際中土壤相應微生物的相對豐度,而在根際土壤真菌中,發病程度較輕的煙株根際土壤真菌群落的α多樣性更高[15]。在青枯病發病過程中,致病微生物[雷爾氏菌屬(Ralstonia)細菌等]和有益微生物[芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌等]的相對豐度明顯升高[16]。然而,根際不僅是病原菌侵染的場所,也是有益微生物和病原菌相互作用的場所[17]。但是,目前通過發病程度與土壤微環境間的關系來篩選防治青枯病原生微生物的報道較少,因此本研究擬通過田間調查,收集煙草青枯病不同發病程度的根際土壤,測定根際土壤酶活性及理化性質,分析細菌、真菌的群落結構,以期探究根際土壤環境因子與發病程度間的關系,并篩選出致病微生物及關鍵土壤因子。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

土壤取樣地位于貴州省安順市紫云縣大田壩村,地理坐標106°18′19″E,25°34′40″N,海拔1 044 m。取樣區域為同一地塊且肥力均勻、地塊平整,土壤質地為沙質土,種植的煙草品種為云煙87。

試驗地的基礎理化性質:pH值5.21,有機質含量24.28 g/kg,全氮含量1.42 g/kg,堿解氮含量162.74 mg/kg,硝態氮含量19.18 mg/kg,銨態氮含量9.74 mg/kg,全磷含量0.03%,速效磷含量3.33 mg/kg,全鉀含量0.15%,速效鉀含量54.08 mg/kg。

1.2 青枯病的分級處理

參照GB/T 23222-2008《煙草病蟲害分級及調查方法》中病蟲害的分級及調查方法[18],以株為單位調查各煙株青枯病的發病等級。0級:全株無病,煙株正常生長,記為0;1級:莖部偶有褪綠斑,或在有條斑一側有少數葉片凋萎,記為1;5級:莖部黑色條斑到達頂部,或病側2/3以上葉片凋萎,記為5;7級:病株基本枯死,記為7。

1.3 樣品的采集與制備

通過系統調查并確定青枯病發病地塊后,于煙株旺長期在田間對不同青枯病發病等級的煙株根際土壤進行取樣,按照青枯病發病等級,相同病級取3株以上煙草,采用抖根法收集根系周圍0～2 mm根際土壤,充分混勻后裝袋,一部分放于-80 ℃冰箱中保存,用于提取土壤DNA,另一部分儲存在4 ℃冰箱中,用于測定土壤酶活性、土壤養分含量。

1.4 土壤理化性狀、酶活性的測定

1.5 土壤微生物的測定

用HiPure Soil DNA Kits提取土壤中的DNA;通過NanoDrop微量分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和完整性,將純化的PCR產物進行文庫構建。經過Qubit和Q-PCR驗證文庫合格后,使用NovaSeq6000對DNA文庫進行測序。測序數據通過Qiime V1.9.1去除平均質量分數低(Q<20)和長度短(<100 bp)的低質量序列,得到最終的有效數據(Effective tags)。使用Usearch軟件進行聚類,去除聚類過程中檢測到的嵌合體,獲得OTU的豐度和OTU代表序列。基于OTU的序列、豐度數據,開展物種注釋、物種組成分析、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析、相關性分析等。

1.6 數據處理

用Excel 2010進行數據處理,用SPSS 25.0進行方差分析和多重比較(Duncan’s新復極差法),顯著性水平為0.05,用R語言進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 煙株根際土壤理化性狀

由表1可以看出,不同青枯病發病程度的煙株根際土壤理化性狀存在顯著差異。青枯病發病煙株根際土壤的有機質、總氮、堿解氮、硝態氮、速效磷和速效鉀含量均高于未發病煙株根際土壤。在發病煙株根際土壤中,隨著煙株發病程度的加重(病級由1級升至7級),pH值、有機質含量、總氮含量、銨態氮含量降低,硝態氮含量升高。

表1 不同發病程度煙株根際土壤理化性狀

2.2 煙株根際土壤酶活性

病害的發生會影響根際土壤酶活性,具體表現為根際土壤中蔗糖酶、過氧化氫酶活性隨發病程度的加重呈下降趨勢。由圖1可以看出,青枯病5級煙株根際土壤的蔗糖酶活性顯著低于不發病、青枯病1級煙株根際土壤,過氧化氫酶活性以青枯病1級煙株根際土壤最高,但是各等級病害間的差異未達到顯著水平。以上結果表明,病害的嚴重程度與土壤酶活性有關,且與蔗糖酶活性間的關系較密切。

不同處理間標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 青枯病不同發病程度根際土壤微生物群落多樣性

2.3.1 微生物α多樣性變化 由表2可以看出,各處理的覆蓋度均大于97%。土壤中細菌與真菌多樣性對病害發生的響應不同。在真菌中,隨著發病程度的加重,Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和Ace指數均在青枯病1級時最高,且只有Chao1指數、Ace指數顯著高于其他病級,其余均未達到顯著差異(t-test檢驗和wilcox秩和檢驗)。在細菌中,各指數也是青枯病1級時最高,但各病級間的差異均未達到顯著水平。

表2 青枯病不同發病程度下根際土壤真菌、細菌群落α多樣性的變化

2.3.2 不同發病程度對土壤微生物β多樣性的影響 由圖2可以看出,在不同發病程度下,土壤真菌及細菌群落β多樣性有一定差異。主坐標分析(Principal co-ordinates analysis,PCoA)圖給出了基于Anosim相似性分析計算出的r值,r值越接近1,說明組間差異越大于組內差異。真菌和細菌中PCoA的結果均有顯著差異(P<0.05)。在PCo1軸上,隨發病程度的增加,真菌群落逐漸分離,但正常土壤與青枯病7級煙株根際土壤有部分重合(圖2A),表明青枯病7級煙株根際土壤真菌群落與正常土壤相似。在PCo1軸上,正常土壤細菌群落與發病土壤能顯著分開,而青枯病5級煙株根際土壤和青枯病7級煙株根際土壤未能明顯分開(圖2B),表明正常土壤與發病土壤間存在差異,青枯病5級、7級煙株根際土壤細菌群落結構較為相似。

A:不同發病程度對真菌群落β多樣性的影響;B:不同發病程度對細菌群落β多樣性的影響。D0:全株無病;D1:青枯病1級;D5:青枯病5級;D7:青枯病7級;PCo1:第一主成分;PCo2:第二主成分。

2.3.3 不同發病程度青枯病煙株根際土壤微生物屬水平的差異 發病程度對根際土壤微生物群落相對豐度有一定影響(圖3)。隨著煙株發病程度的增加,真菌群落中被孢霉菌(Mortierella)、球托霉屬(Gongronella)菌的相對豐度呈此消彼長的態勢,與正常土壤相比,發病煙株根際土壤中鐮刀菌屬(Fusarium)菌、柱孢霉菌屬(Cylindrocarpon)菌的相對豐度提高,毛霉屬(Mucor)菌相對豐度有降低趨勢。隨著煙株發病程度的加重,腸桿菌屬(Enterobacter)菌在青枯病5級、7級煙株根際土壤中的相對豐度高于正常土壤,鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)菌相對豐度在青枯病1級煙株根際土壤中較高,不動桿菌屬(Acinetobacter)菌只出現在發病煙株根際土壤中,產黃桿菌屬(Rhodanobacter)菌相對豐度隨著煙株發病程度加重而逐漸增加。

對相對豐度排名前7的細菌、真菌屬進行差異性分析(Duncan’s新復極差法),詳見表3。真菌群落中被孢霉菌(Mortierella)、球托霉屬(Gongronella)菌、毛霉屬(Mucor)菌,細菌群落中鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)菌相對豐度的變化達到顯著水平。結合指示物種分析,推測出與青枯病發病相關的差異物種,結果見圖4。

D0:全株無病;D1:青枯病1級;D5:青枯病5級;D7:青枯病7級。圖A中,Chaetothyriales:刺盾炱目;Plectosphaerellaceae:小不整球殼科;Glomerellales:小叢殼目;Cylindrocarpon:柱孢霉菌屬; Microascaceae:小囊菌科;Microascales:小子囊菌目;Staphylotrichum:圓孢霉屬;Sordariales_fam_Incertae_sedis:未中文命名;Mucor:毛霉屬;Mucoraceae:毛霉科;Umbelopsis:傘狀霉屬;Umbelopsidaceae:傘枝泡囊霉科;Umbelopsidales:傘形霉目;Umbelopsidomycetes:傘形霉綱。圖B中,Blastocatellaceae:酸桿菌科;Blastocatellales:酸桿菌目;RB41:未中文命名;Pyrinomonadaceae:未中文命名;Pyrinomonadales:未中文命名;Blastocatellia_Subgroup_4:未中文命名;Subgroup 6:未中文命名;Intrasporangiaceae:間孢囊菌科;Streptomycetaceae:鏈霉菌科;Streptomycetales:鏈霉菌目;Flavisolibacter:未中文命名;Lactococcus:乳球菌屬;Streptococcaceae:鏈球菌科;Lactobacillales:乳桿菌目;Parcubacteria:未中文命名;Allorhizobium_ Neorhizobium_Pararhizobium_Rhizobium:未中文命名;Sphingomonas:鞘氨醇單胞菌屬;Sphingomonadaceae:鞘酯單胞菌科;Sphingomonadales:鞘脂單胞菌目;Alphaproteobacteria:α-變形菌綱;Bordetella:波氏桿菌屬;Burkholderia_Caballeronia_Paraburkholderia:未中文命名;Nitrosomonadaceae:亞硝化單胞菌科;SC_I_84:未中文命名;Lysobacter:溶桿菌屬;Rokubacteriales:羅庫菌屬;NC10:未中文命名;Candidatus_Udaeobacter:未中文命名;Chthoniobacteraceae:未中文命名;Chthoniobacterales:未中文命名。

表3 不同煙草發病程度對煙株根際土壤微生物相對豐度的影響

2.3.4 不同發病程度煙株根際土壤中差異物種 為了獲得不同發病程度煙株根際土壤細菌、真菌群落的主要差異物種,用LEFse軟件進行lefse分析(LDA effect size),對OTU數據進行統計意義和生物差異分析。如圖4所示,在屬水平上,對于不同青枯病發病程度煙株根際土壤的真菌而言,傘狀霉屬(Umbelopsis)的LDA值較大,為正常土壤中的差異物種,青枯病1級煙株根際土壤中的圓孢霉屬(Staphylotrichum)為差異物種,青枯病5級煙株根際土壤中的毛霉屬(Mucor)為優勢種群,青枯病7級煙株根際土壤中的柱孢霉菌屬(Cylindrocarpon)為優勢種群。圖3A結果表明,發病煙株根際土壤中毛霉屬(Mucor)菌的相對豐度高于正常土壤,說明毛霉屬(Mucor)可能是不同青枯病發病程度煙株根際土壤真菌群落在屬水平產生差異的主要物種。

細菌中,與發病煙株根際土壤相比,Allorhizobium_Neorhizobium_pararh屬的LDA值高,為正常土壤中的差異物種,且隨發病程度的加重,溶桿菌屬(Lyesobacter)、RB41、Flarisolibacter和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)(來自青枯病1級煙株根際土壤),乳球菌屬(Lactococcus)(來自青枯病5級煙株根際土壤),波氏桿菌屬(Bordetella)(來自青枯病7級煙株根際土壤)逐漸成為特異種群。由圖3B可以看出,腸桿菌屬(Enterobacter)菌在青枯病5級、7級煙株根際土壤中的相對豐度高于正常土壤;鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)菌在青枯病1級煙株根際土壤中的相對豐度較高,而后隨著發病程度的加重逐漸下降,表明鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)可能是青枯病不同發病程度煙株根際土壤細菌群落在屬水平產生差異的主要物種。

A:屬水平真菌群落組成與土壤因子的冗余分析;B:屬水平細菌群落組成與土壤因子的冗余分析。RDA1:排序軸1;RDA2:排序軸2;D0:全株無病;D1:青枯病1級;D5:青枯病5級;D7:青枯病7級;SOM:有機質;AK:速效鉀;TN:總氮;AP:速效磷;:硝態氮;Mortierella:被孢霉屬;Gongronella:球托霉屬;Fusarium:鐮刀菌屬;Mucor:毛霉屬;Cylindrocarpon:柱孢霉菌屬;Bacillus:芽孢桿菌屬;Acinetobacter:不動桿菌屬;Sphingomonas:鞘氨醇單胞菌屬;Rhodanobacter:產黃桿菌屬;Enterobacter:腸桿菌屬。

3 討論

煙草青枯病的發生跟土壤養分供應水平、酸堿狀況、酶活性和微生物等的相關性較大[19-20]。本研究結果表明,在煙株發生青枯病的根際土壤中,隨著發病程度的加重,土壤pH值、有機質含量、總氮含量降低,硝態氮含量升高,原因可能是pH值的下降可促進土壤青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)相對豐度的提高[21],從而導致病害加重,而部分養分可通過增強煙株的抗逆性從而減少病害的發生[22]。何萬澤[23]研究發現,加入有機肥可以提高植株抗病性,當有機氮施用量占施氮量的20%～30%時,煙草的抗病性最高。趙芳等[24]研究發現,適量的氮素水平可以提高煙株的抗性,進而使其抵御病害發生,這與本研究結果類似,發病土壤的有機質、總氮含量高于健康土壤,且隨發病程度增加呈下降趨勢,RDA結果還顯示,有機質、氮是影響根際土壤微生物群落結構的關鍵因子。不同形態的氮素可以影響作物生長發育和根系形態結構,從而影響作物的抗病性[25],而硝態氮可以減少香蕉枯萎病[26]和大白菜斑點病的發生[27]。本研究結果顯示,隨著青枯病的發生,土壤中硝態氮含量逐步升高,但是RDA結果顯示,硝態氮含量對隨根際環境變化較大的微生物影響不大。本試驗結果表明,隨著青枯病發病程度的加重,蔗糖酶、過氧化氫酶活性先增后減,這與一些研究者如史普酉等[28-30]對不同作物的研究結果類似,表明這2種酶對土傳病害的相應規律具有普遍性。在煙株發病初期,酶活性出現小幅上升的原因可能是煙株為了抵抗逆境,通過改變根系分泌物等方式促使酶活性短暫升高。因此,土壤養分含量、酶活性與青枯病的發生密切相關。

土壤微生物在作物根際土壤微生態環境中發揮著重要作用,是影響植株發病的重要因素[31-32]。本研究發現,在發病土壤中,真菌群落鐮刀菌屬(Fusarium)、柱孢霉菌屬(Cylindrocarpon)的相對豐度高于正常土壤,且隨發病程度的加重,其相對豐度呈增加趨勢,毛霉屬(Mucor)、被孢霉菌(Mortierella)、球托霉屬(Gongronella)相對豐度的變化達到顯著差異,說明以上真菌可能與煙草青枯病發生有關。目前已有研究發現,鐮刀菌屬(Fusarium)、柱孢霉菌屬(Cylindrocarpon)是潛在的致病性真菌群落[31-32],鐮刀菌屬(Fusarium)真菌是一類重要的寄生性植物病原真菌,可侵染大多數植物并引起毀滅性病害[33],柱孢霉菌屬(Cylindrocarpon)是一類能引發多種植物(包括人參、三七等)根腐病的常見土壤真菌[34-35],并且在發病土壤中檢測出的柱孢霉菌屬(Cylindrocarpon)為優勢菌屬,與關鍵土壤因子pH值、全氮含量、有機質含量等呈負相關。因此推測,柱孢霉菌屬菌豐度的增加可能是造成煙株發病的原因之一,而毛霉屬(Mucor)是土壤中常見的有益真菌類群[36],在本研究中屬于發病土壤中的優勢菌群,可能是致病菌、寄主及環境的差異,導致其發揮不同作用。球托霉屬(Gongronella)、被孢菌屬(Mortierella)菌為有益菌[37-38],球托霉屬(Gongronella)、被孢菌屬(Mortierella)雖然不是特異物種,但是隨著青枯病的發生,球托霉屬(Gongronella)、被孢菌屬(Mortierella)菌的相對豐度變化差異達到顯著水平,這或許與青枯病發生有關。在細菌群落中,腸桿菌屬(Enterobacter)在青枯病5級、7級煙株根際土壤中的相對豐度高于正常土壤,鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在青枯病1級煙株根際土壤中的相對豐度較高,而后隨著發病程度的增加逐漸下降,鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)菌是土壤中的有益微生物,它的減少可能導致致病微生物增加[39]。特異性物種分析結果表明,鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)為特異物種,且與pH值、全氮含量、有機質含量、速效鉀含量呈正相關,與速效磷含量、硝態氮含量呈負相關。因此推測,土壤中鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)相對豐度的降低或許是青枯病發生的關鍵因素,具體影響機制還有待進一步探究。

4 結論

青枯病的發生降低了細菌、真菌的多樣性,微生物群落中的柱孢霉菌屬(Cylindrocarpon)的相對豐度增加,毛霉屬(Mucor)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)的相對豐度降低是影響煙草青枯病嚴重發生的關鍵菌屬。提高土壤全氮含量、有機質含量能有效降低煙草青枯病的發病程度。