HS-SPME結合GC-MS技術對不同地區甜酒曲揮發性風味化合物的研究分析

向 玲，屠婷瑤，賈俊杰，王紅梅，牛曼思，馬 龍，李 令，2，楊舒淋，葉青青，沈才洪，王松濤*

（1.瀘州品創科技有限公司/國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州 646000；2.四川農業大學，四川成都 610000；3.國家市場監管重點實驗室（白酒監管技術），四川成都 611731)

米酒是一種以優質稻米為主要原料，配合甜酒曲和水釀造而成的中國傳統低度發酵酒，不僅具有酸甜清香的獨特口感，還具有抗癌、抗炎和抗氧化等食療功效[1-3]。甜酒曲是米酒釀造的糖化、發酵和生香劑[4]，不同來源的甜酒曲具有不同的發酵特性，對米酒的釀造和品質有著顯著的影響，甚至決定米酒的類型，因而有“曲為酒骨”之稱[5-6]。現在的甜酒曲以米粉、麩皮為主要原料，加中入草藥、米糠等制成[7]。甜酒曲中存在霉菌、酵母和細菌等數十個種屬的微生物，其中優勢霉菌主要是根霉、曲霉和毛霉屬微生物[8-9]。甜酒曲生產過程中涉及多種微生物及酶的變化，產生豐富的微生物代謝產物和大曲降解物，這些物質直接或間接地形成了酒的風味化合物[10-12]。因此，不同甜酒曲發酵的米酒風味會存在差異。

近年來，曲藥中揮發性風味物質的研究成為發酵酒領域的一個研究熱點，酒曲風味對米酒風味有著較大影響[13-14]。仲楨玉等[15]研究發現5 種不同酒曲發酵葛根酒中的揮發性風味物質差異較大；母應春等[16]對比兩種酒曲發酵的米酒品質，發現兩種酒曲發酵米酒主要風味成分組成種類基本相同，但成分相對含量差異大；蔡敏等[17]對孝感酒曲、安琪酒曲和宜昌土家酒曲發酵酒進行感官評定，發現不同酒曲、不同酒曲用量發酵的米酒風味特征不同。酒曲的原料、制備工藝和地理環境等多種因素決定了酒曲的品質，HS-SPME 法已廣泛應用于揮發性風味物質的研究[18-21]。目前，關于甜酒曲風味的報道較少，；本試驗采用HS-SPME 法結合氣相色譜/質譜聯用（GC-MS）對全國東、中、西部共38個地區甜酒曲風味進行研究，對比其風味化合物種類和含量的差異，為米酒生產和風味評價提供理論基礎與思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：試驗所采用原料詳細信息見表1。

表1 38個甜酒曲樣品信息

試劑：2-辛醇、氯化鈉均為分析純。

儀器設備：氣相色譜-質譜聯用儀(島津GCMS-QP2020NXnci SYSTEN)，萃取頭（SAAB-57328U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS），頂空進樣瓶（20 mL），智達公司，質譜庫NIST2.0L，DB-WAX 60×0.25×0.25 色譜柱，99.999%的氦氣。

1.2 試驗方法

1.2.1 曲藥樣品預處理

粉碎采集得到的整塊甜酒曲，過40 目篩，采用四分法混合均勻后，取0.5 g曲藥樣品放入20 mL頂空瓶中，再加入5 mL飽和NaCl溶液，蓋上瓶蓋。

1.2.2 頂空固相微萃取條件

萃取頭老化：首次使用萃取頭時，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭在氣相色譜進樣口270 ℃老化1 h。

萃取條件：裝有樣品的頂空瓶，在60 ℃搖床內平衡5 min，用50/30 μm DVB/ CAR/PDMS 萃取頭萃取40 min，然后將萃取頭置于GC 進樣口中，250 ℃下解析5 min后進行GC-MS分析。

1.2.3 GC-MS分析

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；He 作為載氣，流速控制為0.8 mL/min；采取程序升溫：起始溫度40 ℃，保持1 min，以2.5 ℃/min 升至75 ℃，再以3 ℃/min 升至162 ℃，再以6 ℃/min 升至230 ℃/min，保持5 min；進樣口溫度為250 ℃；不分流進樣（分流比為-1）。

質譜條件：選擇電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度為250 ℃，檢測器電壓為相對調諧結果0.1 kV，掃描速度為1666，采集方式為SCAN，質量掃描范圍m/z 35～500 amu。

1.2.4 定性與半定量分析

定性：采用NIST20 譜庫檢索（化合物匹配度大于80）。

半定量：以2-辛醇作為內標（加入樣品的終質量濃度為0.1644 g/L），化合物質量濃度為內標物質量濃度、化合物與內標物峰面積比的乘積。

2 結果與分析

2.1 38 個甜酒曲樣品中揮發性風味成分的類別分析

采用SPME-GC-MS 分析38 個甜酒曲樣品主要揮發性風味化合物，共定性定量出210 種物質，分別有醇類物質、酯類物質、酸類物質、醛類物質、酮類物質、烷類物質、烯類物質、醚類物質和其他類物質。其中，醇類物質65 種，最豐富，占比為30.95%；酮類36 種，占比17.14%；醛類26 種，占比為12.38 %；烷類27 種，占比為12.86 %；烯炔類20種，占比9.52 %；酯類14 種，占比6.67 %，；類8 種，占比3.81%；醚類6 種，占比2.86%；其他類8 種，占比3.81%，如圖1所示。

圖1 曲藥樣品中揮發性風味成分的類別餅狀圖

2.2 不同種類風味化合物數量和含量分析

表2 列出了38 種甜酒曲不同風味化合物的數量和含量，結合圖2a 和圖2b 可直觀看出，不同甜酒曲揮發性風味化合物種類、含量差異大。38種甜酒曲中風味化合物均為醇類物質種類最多，酯類物質、烯炔類物質和醚類物質較少，其中，ZJ-C 化合物種類最豐富，為66 種。醇類化合物主要通過氨基酸代謝、乳糖代謝、酮類降解等微生物代謝過程產生，主要呈現醇香、水果香和甜香，是酒中醇甜和助香物質的主要來源[22-23]。酯類化合物的合成與溫度、含氧量以及底物含量水平有關，控制這些因素有助于風味化合物的合成[24]。從種類上看，HB-C醇類化合物種類最多，為28種，ZJ-C酮類化合物種類最多，為15 種，JS-D 醛類化合物種類最多，為14種，不同甜酒曲的酸類和烷類物質數量差異不大。從含量上看，38 個甜酒曲中JS-A 醇類物質含量最高，JX-B 酸類物質含量最高，JS-D 醛類物質含量最高，ZJ-C 酮類物質含量最高。38 個甜酒曲的醇類化合物含量介于1.87～42.00 μg/g，酮類化合物含量介于0.12～10.43 μg/g，醛類化合物含量介于0～10.68 μg/g，酯類化合物含量介于0～0.83 μg/g，酸類化合物含量介于0～13.77 μg/g，烷類化合物含量介于1.16～4.07 μg/g，烯炔類化合物含量介于0～1.53 μg/g，醚類化合物含量介于0～0.33 μg/g。從區域劃分看，江蘇地區甜酒曲醇類含量普遍較高，江西和湖南地區甜酒曲酯類和醇類含量低于大部分其他地區。

圖2 38種甜酒曲風味化合物分析圖

2.3 各類揮發性風味化合物含量與地區關系

根據210 種揮發性風味化合物與38 種甜酒曲的聚類結果，多種風味化合物只出現在一種或幾種曲藥中，沒有明顯的化合物和地區聚類規律，說明不同地區甜酒曲風味化合物種類和含量差異大。38種甜酒曲的共有風味化合物只有4個，分別為1-己醇，3-甲基-1-丁醇，1-辛烯-3-醇，正十二烷。東部地區檢測了來自江西、浙江、安徽和江蘇的14個曲藥樣品，共定性定量出136 個風味化合物，其中9個共有化合物，分別為正十二烷，2,4-二叔丁基苯酚，苯乙醇，1-戊醇，1-己醇，1-辛醇，1-庚醇，1-辛烯-3-醇，3-甲基-1-丁醇。中部地區檢測了來自湖北、湖南和河南的14 個曲藥樣品，共定性定量出140 個風味化合物，其中16 個共有化合物，分別為1-己醇，1-辛烯-3-醇，1-辛醇，1-壬醇，2,4-二叔丁基苯酚，2-乙基-1-己醇，苯乙醇，2-甲基-1-丁醇，3-甲基-1-丁醇，2-辛酮，己醛，辛醛，壬醛，苯甲醛，正十二烷，正十三烷。西部地區檢測了來自四川、廣西和陜西的10 個曲藥樣品，共定性定量出132 個風味化合物，其中11 個共有化合物，分別為1-戊醇，1-己醇，1-辛烯-3-醇，2-辛酮，己醛，辛醛，壬醛，(E)-2-辛醛，苯甲醛，正十二烷，正十三烷。酒曲風味差異可能是由于曲藥原料、發酵工藝和產地等造成的。為了探究甜酒曲風味化合物與產地的關系，本文對東部地區甜酒曲、中部地區甜酒曲和西部地區甜酒曲進行進一步數據分析。

2.4 不同地區曲藥標記性風味化合物分析

在食品的香氣特征研究中，主成分分析法（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）被用于揭示變量間的關系[25-26]，本研究利用SIM-CA 14.0 軟件對東部、中部和西部甜酒曲風味化合物的含量進行PCA 和PLS-DA 分析。對東部地區甜酒曲136 個風味化合物進行PCA 分析，結果如圖3a 所示，前兩個主成分累計貢獻率為42.10%，可以看出東部14個地區樣品位置相近，說明風味物質相近，難以區分。進一步進行PLS-DA統計分析，結果顯示，江西和浙江的樣品（除ZJ-A)主要集中在第一象限，安徽的樣品主要集中在第二象限，江蘇的樣品除JS-D 均集中在第四象限，存在明顯分區。此外，基于預測值的可變重要性(variable importance in projection values,VIP)，確定了4種重要標記化合物（＞1.5），VIP 值越大，變量在不同產地間差異越顯著[27]，2-乙基-1-己醇VIP 最高(9.68)，其他重要標記化合物為1-壬醇、苯乙醇、1-辛烯-3-醇，VIP介于1.68～2.06。

中部地區甜酒曲140 個風味化合物PCA 結果顯示（圖4a），前兩個主成分累計貢獻率為29.80%，湖北省樣品分布比較散，湖南省樣品集中在第一象限，河南省樣品在第四象限。PLS-DA 結果顯示（圖4b），湖南省樣品集中在第二象限，河北省樣品集中在第四象限，河南省樣品未落在同一95 %置信區域(Hotelling T2 test)內，不同樣本在PLS-DA得分圖上明顯分開，模型解釋變異數(R2Y)和預測能力(Q2Y)分別為1 和0.999，說明模型優秀。重要標記化合物（＞1.5）有9 個，其中，2-乙基-1-己醇VIP 最高(7.69)，其他重要標記化合物苯乙醇、2,4-二叔丁基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚、喇叭醇、正十二烷、正十三烷、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、苯甲醇，VIP介于1.53～3.92。

圖4 中部地區甜酒曲成分PCA和PLS-DA分析

西部地區甜酒曲132 個風味化合物PCA 結果顯示（圖5a），前兩個成分累計貢獻率為40.20 %，四川內江樣品與廣西地區樣品位置相近，說明風味化合物相似。PLS-DA 結果顯示（圖5b），不同省份樣品出現明顯分區，陜西省樣品在第一象限，廣西省樣品集中在第二、三象限，四川省樣品在第四象限。模型解釋變異數(R2Y)和預測能力(Q2Y)分別為0.914 和0.792，重要標記化合物（＞1.5）有17個，其中，2-乙基-1-己醇VIP 最高(4.32)，其他重要標記化合物為苯乙醇、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚，4-己基-2,5-二氫-2,6-二氧-3-呋喃酸、己醛、（E）-肉桂醛、1-己醇、1-壬醇、1-辛醇、2,4-二叔丁基苯酚、[R-(R*，R*)]-2,3-丁二醇、（E)-1-己醇、正十三烷、己酸乙酯、2,3-丁二醇，VIP 介于1.50～3.61。2-乙基-1-己醇和苯乙醇，在東部、中部和西部地區甜酒曲中均為重要的標記化合物，說明其對酒曲的風味影響較大。苯乙醇通過艾利希途徑代謝調節產生，呈現花香、甜香和玫瑰香，多個研究表明苯乙醇是大曲中的重要風味化合物[28-30]。

圖5 西部地區甜酒曲成分PCA和PLS-DA分析

3 結論

酒曲風味是影響米酒風味的一個重要因素，本研究對38 個不同地區甜酒曲藥樣品的揮發性風味化合物進行了檢測和分析，共鑒定出210 種揮發性化合物，包括醇類物質65 種、酯類物質14 種、酸類物質8 種、醛類物質26 種、酮類物質36 種、烷類物質27 種、烯類物質20 種、醚類物質6 種和其他類物質8 種。不同地區曲藥揮發性風味物質種類和含量差異大，原因可能是不同地區曲藥原料、生產工藝和環境等不同。38 種曲藥的共性揮發性成分只有4 種，分別為1-己醇、3-甲基-1-丁醇、1-辛烯-3-醇、正十二烷。江蘇地區米曲醇類含量普遍較高，江西和湖南地區米曲酯類和醇類含量低于大部分其他地區。2-乙基-1-己醇和苯乙醇在東部、中部和西部地區曲藥中均為重要的標記化合物，其中2-乙基-1-己醇VIP 值最高，說明其可能是造成不同地區曲藥風味差異的重要物質。通過本研究可以為不同地區米酒揮發性風味化合物差異提供理論依據，為米酒品質的提升提供理論支撐。