基于UPLC法測(cè)定醬香型白酒原輔料中5種非揮發(fā)性有機(jī)酸

駱茂香，徐興江，劉 磊

（1.貴州省酒類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州仁懷 564500；2.茅臺(tái)學(xué)院，貴州仁懷 564500）

非揮發(fā)性有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)是醬香型白酒中重要的一類(lèi)風(fēng)味化合物，也是形成酯類(lèi)物質(zhì)的前體物質(zhì)[1]，主要由微生物利用淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)等有機(jī)物發(fā)生生化反應(yīng)而生成，對(duì)醬香型白酒有重要呈味作用，其含量對(duì)白酒質(zhì)量有直接影響[2-3]。醬香型白酒的原輔料除水以外主要為大曲和高粱，原輔料中的有機(jī)酸含量對(duì)醬香型白酒釀造過(guò)程中的微生物生長(zhǎng)有重要調(diào)控作用[4]。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，白酒中非揮發(fā)有機(jī)酸不僅是風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)生理健康同樣產(chǎn)生重要影響，可以有效對(duì)抗腸道內(nèi)的病原體。常韶娜等[5]發(fā)現(xiàn)醬香型白酒中有機(jī)酸類(lèi)化合物可以影響幽門(mén)螺桿菌的脲酶活性，通過(guò)降低毒性蛋白（CagA 和VacA）的表達(dá)，抑制幽門(mén)螺桿菌對(duì)胃上皮細(xì)胞的損傷；孫時(shí)光等[6]通過(guò)分析醬香型白酒中的風(fēng)味物質(zhì)及功效發(fā)現(xiàn)，乳酸能夠促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)胃腸道，促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，增強(qiáng)免疫力、防止細(xì)胞老化，L-蘋(píng)果酸具有治療肝肺貧血、尿毒癥、高血壓的功效。此外，研究還發(fā)現(xiàn)乳酸具有降低血糖和抑菌作用，琥珀酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、富馬酸等有機(jī)酸均有抗炎作用[7-8]。

檢測(cè)非揮發(fā)性有機(jī)酸的主要儀器方法有衍生化結(jié)合氣相色譜法(gas chromatography,GC)及氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[9]、離子色譜法（ion chromatography，IC）[10]、HPLC 法[11]及液質(zhì)聯(lián)用法（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）[12]。相較于GC以及GC-MS 法，高效/超高效液相色譜方法可以省去繁瑣的衍生化處理樣品的過(guò)程，被成熟運(yùn)用于非揮發(fā)性有機(jī)酸的測(cè)定。本研究采用高效液相色譜法建立了5 種非揮發(fā)有機(jī)酸（酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、馬來(lái)酸、富馬酸）的檢測(cè)方法，旨在快速對(duì)醬香型白酒原輔料中非揮發(fā)有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試驗(yàn)樣品：大曲和高粱樣品均來(lái)自醬香型白酒核心產(chǎn)區(qū)貴州仁懷。

試劑及耗材：酒石酸（99.9%），阿爾塔公司；蘋(píng)果酸（99.8%），阿爾塔公司；乳酸（色標(biāo)），天津精細(xì)品化工；馬來(lái)酸（99.9 %），阿爾塔公司；富馬酸（99.9%），阿爾塔公司；甲醇（色譜純），德國(guó)默克公司；磷酸（色譜純），科密歐公司；超純水（18.2 MΩ·cm）。

儀器設(shè)備：漩渦振蕩器（XH-B），江蘇天翎公司；臺(tái)式電子天平（精確度0.0001 g），賽多利公司；0.44 μm 濾頭；離心機(jī)（TD4Z-WS），湖南湘立公司；高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1200 serise，DAD 檢測(cè)器），美國(guó)安捷倫科技公司；超純水機(jī)（Milli-Q），Millipore公司；電子天平（精度0.0001 g），賽多利斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

參照趙尚碧等[13]樣品預(yù)處理方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，試樣粉碎過(guò)篩（高粱過(guò)40 目篩，大曲過(guò)20目篩），使用電子天平稱(chēng)取高粱和大曲各5.0 g 樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 水（或100%甲醇溶液、50 %甲醇溶液），振蕩器振蕩5 min 后，以3000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心30 min；吸取上清液1 mL 于5 mL容量瓶中，加水（或100%甲醇溶液、50%甲醇溶液）定容；最后經(jīng)0.44 μm微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A 相為0.1 %磷酸溶液，B 相為純甲醇溶液，0～10 min：5B，10.50～15.00 min：100B，15.10～20.00 min：5B；流速：1.00 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；檢測(cè)器：DAD檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱(chēng)取一定量的5 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，用50%甲醇水溶解定容至100 mL，配制成一定濃度的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃冷藏密封保存。5 種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配成如表1 的5 個(gè)濃度梯度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋濃度

1.2.4 含量計(jì)算公式

式中：C——所求含量，g/kg；

C測(cè)——儀器測(cè)得數(shù)據(jù)，μg/mL；

M——所取樣品質(zhì)量，g；

V——定容體積100 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

對(duì)酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、馬來(lái)酸、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

從表2 可以看出，酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、馬來(lái)酸、富馬酸5 種非揮發(fā)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)均大于0.994，滿足GB/T 27025—2019《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》、CNAS-CL01-A002-2020《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》等規(guī)范性技術(shù)文件所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99的要求。

2.2 精密度

配制了酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、馬來(lái)酸和富馬酸在高粱和大曲中兩個(gè)濃度水平的空白樣品添加溶液，分別進(jìn)樣6 次計(jì)算精密度，從表3 中可看出，5種非揮發(fā)有機(jī)酸在高粱和大曲精密度試驗(yàn)中變異系數(shù)在0.1%～4.7%之間，滿足GB/T 27025—2019《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》、CNASCL01-A002-2020《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》等規(guī)范性技術(shù)文件規(guī)定的精密度試驗(yàn)中變異系數(shù)小于7.5%的要求。

表3 酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、馬來(lái)酸和富馬酸檢測(cè)方法精密度

2.3 回收率及準(zhǔn)確度

分別在空白樣品中添加酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、馬來(lái)酸和富馬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在S1、S2、S5 三個(gè)濃度水平進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平添加3 個(gè)平行樣，從表4 中可看出，樣品化合物三個(gè)濃度水平的回收率在92.4 %～104.1 %之間，滿足GB/T 27025—2019《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》、CNAS-CL01-A002-2020《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》等規(guī)范性技術(shù)文件規(guī)定的回收率為90%～120%的要求。

表4 酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、馬來(lái)酸和富馬酸回收率及準(zhǔn)確度

2.4 實(shí)驗(yàn)樣本測(cè)定

采用高效液相色譜法檢測(cè)到醬香型白酒中原輔料（39 個(gè)高粱、32 個(gè)大曲）中5 種非揮發(fā)性有機(jī)酸的含量范圍如表5 所示。高粱中未檢測(cè)到馬來(lái)酸，酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、富馬酸的含量范圍分別在0.971～1.839 g/kg、0～0.393 g/kg、0.826～5.883 g/kg、0～0.070 g/kg 之間。大曲中酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、馬來(lái)酸、富馬酸的含量范圍分別在0～12.109 g/kg、1.884～21.526 g/kg、5.751～23.441 g/kg、0.003～0.042 g/kg、0.022～0.168 g/kg 之間。在高粱和大曲中非揮發(fā)有機(jī)酸含量最高為乳酸（23.441 g/kg），含量最低為馬來(lái)酸（0.003 g/kg）。高粱和大曲相比，大曲中各酸含量均高于高粱。

表5 高粱和大曲中5種非揮發(fā)有機(jī)酸含量范圍

3 結(jié)論

研究對(duì)樣品的前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)利用水處理樣品組儀器響應(yīng)較高，檢測(cè)效果較好；比較液質(zhì)聯(lián)用儀與高效液相色譜儀檢測(cè)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)高效液相色譜法誤差更小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為精確。研究采用高效液相色譜建立5 種非揮發(fā)性有機(jī)酸（酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、馬來(lái)酸、富馬酸）檢測(cè)方法，結(jié)果表明利用外標(biāo)法建立的5 種非揮發(fā)性有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好，其相關(guān)系數(shù)R2不低于0.994，檢出限在1.0～10.0 μg/mL 之間，加標(biāo)回收率在92.4 %～104.1 %之間，精密度在0.1 %～4.7 %之間，該方法可用于醬香型白酒原輔料中非揮發(fā)性有機(jī)酸含量的測(cè)定。