基于qPCR技術(shù)的黃東海沙海蜇時空分布特征研究?

柳怡帆, 甄 毓, 米鐵柱, 王建艷

(1. 中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室, 山東 青島 266100; 2. 中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院, 山東 青島 266100; 3. 北京自然博物館科學研究部, 北京 100050)

近年來,全球多地海域頻發(fā)水母暴發(fā)現(xiàn)象,這逐漸成為一種海洋生態(tài)災害,嚴重危及海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡和人類的生產(chǎn)生活安全[1-3]。水母暴發(fā)會損壞漁具、減少漁獲量,以致海洋捕撈活動受到嚴重影響[4]。水母暴發(fā)會通過生物間的相互作用,如捕食關(guān)系、空間競爭等改變海洋生物群落結(jié)構(gòu)[5]。如印度西南海岸科欽港口在季風后期水母暴發(fā),增加了甲殼類浮游生物、魚卵和幼魚被捕食的壓力,導致浮游食物網(wǎng)中的營養(yǎng)級聯(lián),使得浮游植物豐度達到高值[6]。水母和魚類具有相似的食性,水母數(shù)量的急劇增加會導致魚類數(shù)量大幅下降[7-8]。另外,水母大量暴發(fā)時還會堵塞海水核電站的冷卻入口,導致發(fā)電被迫中斷,嚴重時會影響近岸地區(qū)的生活和生產(chǎn)[9]。

自20世紀90年代末,在東亞海域頻繁發(fā)生沙海蜇(Nemopilemanomurai)暴發(fā)災害。2003年日本青森縣因沙海蜇暴發(fā)損失約2 000萬美元,韓國每年因沙海蜇暴發(fā)損失6 820萬至20 460萬美元[10]。沙海蜇暴發(fā)對中國漁獲量也造成了嚴重影響,2003年中國東海北部和黃海沙海蜇的年漁獲量增加了250%,與此同時年漁獲量下降了64%[11]。沙海蜇成體個體較大,直徑可達2 m,種群分布受溫度、鹽度、餌料等多種因素影響[12]。在黃東海海區(qū),沙海蜇通常于5月下旬和6月上旬出現(xiàn)在30°30′N—33°00′N,122°00′E—122°45′E的部分區(qū)域,6月擴展到31°30′N—36°00′N,在32°00′N—34°00′N范圍內(nèi)大量聚集,8月繼續(xù)向北向南擴展到30°00′N—37°00′N海域,8月末及9月幾乎遍布黃海,10月其分布區(qū)域收縮至34°00′N—37°00′N海域[13]。

已有對水母數(shù)量和分布的研究多是基于傳統(tǒng)的現(xiàn)場調(diào)查方法,通過對拖網(wǎng)中或一定面積海平面上水母體進行形態(tài)鑒定和計數(shù)完成[14-16]。傳統(tǒng)的分類方法對鑒定者的專業(yè)要求較高,且當水母大量暴發(fā)時拖網(wǎng)操作難度較大甚至會導致爆網(wǎng)。另外,這些方法多局限于水母體,對水母浮浪幼蟲、螅狀體、碟狀體等微小個體的觀測則較困難[17]。目前少有研究涉及沙海蜇早期個體(如浮浪幼蟲、螅狀體、碟狀體)的分布動態(tài),關(guān)于我國近海沙海蜇螅狀體棲息地也尚無定論。

隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展,分子生物技術(shù)逐漸應用于水母鑒定中。如王建艷等[18]利用實時熒光定量PCR技術(shù)(Quantitative real-time PCR,qPCR)對中國近海常見的海月水母(Aureliaspp.)、沙海蜇、白色霞水母(Cyaneanozakii)和海蜇(Rhopilemaesculentum)進行了種類鑒定,并將該方法應用于膠州灣海域水母的現(xiàn)場調(diào)查中。杜崇等[19]基于16S rDNA基因片段對我國海南海口和廣東茂名附近海域暴發(fā)的水母進行分子鑒定,認為肇事種分別為鞭腕水母(Acromitusflagellatus)和端棍水母(Catostylusmosaicus)。Daglio等[20]依據(jù)部分細胞色素氧化酶I(COI)的DNA序列對印度尼西亞泗水東部沿岸海域水母進行鑒定,共鑒定出7個物種,進一步完善了該海域水母的分類學研究。Gaynor等[21]利用qPCR技術(shù)研究了巴內(nèi)加特海灣早期階段的海刺水母(Chrysaoraquinquecirrha)的分布,發(fā)現(xiàn)碟狀幼體季節(jié)豐度最高值出現(xiàn)在巴內(nèi)加特灣北部,且海灣北部的東部站點浮浪幼蟲豐度高于西部站點。

為調(diào)查中國近海沙海蜇的分布和來源,本文利用qPCR技術(shù)對黃東海海域中沙海蜇mt-16S rDNA進行檢測,檢測結(jié)果與已有的沙海蜇水母體分布研究結(jié)果相比較[13],分析海水中沙海蜇的濃度與分布特征,為分析影響水母分布的因素與水母溯源研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2012年10月、2013年8月和2013年9月搭乘“北斗號”科考船在黃東海海域進行大面調(diào)查,每個站位現(xiàn)場采集10 L表層海水樣品,通過肉眼觀察后剔除其中可能的水母體組織塊,用76 μm的篩絹過濾收集浮游生物,過濾后的篩絹置于液氮罐后運回實驗室,于-80 ℃保存樣品,用于DNA提取和qPCR實驗。2013年5月分別于3—7日、11—15日、19—22日、28—31日搭乘“浙普漁23012”漁船對長江口及其鄰近海域進行采樣,每個站位現(xiàn)場采集10 L表層海水樣品,通過肉眼觀察后剔除其中可能的水母體組織塊,用200 μm的篩絹過濾收集浮游生物(因此時海水中的沙海蜇為碟狀體和水母幼體,直徑>500 μm,故選取200 μm篩絹過濾收集)。

采樣站位見圖1,其中2012年10月(9個斷面,40個站位)和2013年9月(7個斷面,22個站位)航次為黃東海大面檢測,2013年5月(5個斷面,22個站位)和2013年8月(4個斷面,16個站位)為長江口及其鄰近海域的重點檢測。另外,于2013年8月和2013年9月航次中選取部分站位利用采水器分層采集海水,分析不同深度海水中沙海蜇DNA的分布情況。

(c圖中框表示2013年8月的采樣站位。Boxes in figure c indicate the sampling stations in August, 2013.)

1.2 DNA提取

將-80 ℃保存的過濾樣品置于1.5 mL離心管中,按照DNeasy?Blood &Tissue Kit(Qiagen,Hilden,Germany)試劑盒說明書步驟提取篩絹上的DNA,獲得的DNA置于-20 ℃保存。

1.3 qPCR檢測

參照王建艷等[22]建立的沙海蜇qPCR檢測方法,檢測所采樣品中沙海蜇的mt-16S rDNA。反應體系為30 μL,包括15 μL 1×Fast Start Universal SYBR Green Master (ROX),0.9 μL正向引物NS1-F(5′-GTAGGATATAATGACCCGTTGA)(終濃度0.3 μmol/L),0.9 μL反向引物NS1-R(5′-CGAGGTGGCAAACATCAT)(終濃度0.3 μmol/L),3 μL稀釋100倍的樣品DNA以及10.2 μL ddH2O,并向體系中添加最終濃度為0.2 μg/μL的牛血清白蛋白以減少DNA樣品中其他物質(zhì)的干擾。反應在ABI7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,USA)上進行。反應程序:50 ℃ UNG酶激活2 min,95 ℃熱啟動10 min,隨后40個循環(huán),包括95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min。以定量曲線y=-3.396x+36.983(x表示質(zhì)粒拷貝數(shù)的對數(shù)(lgNplasmid),y表示Ct值)[22]計算樣品中沙海蜇mt-16S rDNA的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 黃東海表層水體中沙海蜇mt-16S rDNA的時空分布特征

為探明沙海蜇早期個體的來源,本研究在5月航次中對長江口近海海域進行了4次采樣檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),沙海蜇mt-16S rDNA最早于5月上旬在靠近近岸的M15(31°30′N,122°15′E)、M8(30°30′N,122°15′E)站位出現(xiàn)較高值(191.86 copies/L、192.60 copies/L)(見圖2a),隨后向北分布。至5月下旬,高值區(qū)出現(xiàn)在H2(33°30′N,121°15′E)、D5(32°30′N,122°30′E)、D2(32°30′N,121°45′E)站位,濃度分別為1 121.12、1 897.64和2 342.88 copies/L(見圖2d)。

圖2 2013年5月黃東海表層海水中沙海蜇mt-16S rDNA的豐度和分布

對夏秋季航次中沙海蜇mt-16S rDNA的檢測結(jié)果表明,2013年8月,16個站位中均檢測出沙海蜇mt-16S rDNA,其濃度范圍為(4.59～124.46)×104copies/L、平均值為9.80×104copies/L。其中,高值區(qū)出現(xiàn)在M斷面和PN斷面(29°30′N—31°30′N),高值站位為PN1、PN3、M+和M3,濃度分別為2.75×104、3.04×104、3.39×104和4.59×104copies/L(見圖3a)。2013年9月,24個調(diào)查站位中均檢測出沙海蜇mt-16S rDNA,其濃度范圍為(4.58～9.49)×103copies/L、平均值為6.91×103copies/L;高值區(qū)出現(xiàn)在I斷面(33°N),濃度平均值為1.91×103copies/L(見圖3b)。2012年10月,黃東海沙海蜇mt-16S rDNA在32個站位中檢出,其濃度范圍為7.90～533.67 copies/L、平均值為94.94 copies/L;高值區(qū)主要出現(xiàn)在34°N及其以北的海域的C、A、E斷面,平均濃度為172.98、201.98和224.32 copies/L;高值站位為E4、A1、C4,沙海蜇mt-16S rDNA濃度分別為4.32×102、4.66×102和5.34×102copies/L(見圖3c)。綜合3個月的調(diào)查可見,8月沙海蜇mt-16S rDNA濃度最高,9月和10月濃度值較8月依次降低一個數(shù)量級;從8月到10月沙海蜇mt-16S rDNA高值區(qū)呈由南向北移動的趨勢。

圖3 2013年8月、9月和2012年10月黃東海表層海水中沙海蜇mt-16S rDNA的豐度和分布

2.2 黃東海沙海蜇mt-16S rDNA的垂直分布特征

2013年8月PN1、PN2、P1和P2共4個站位分層次樣品中,除PN1站位沙海蜇mt-16S rDNA在表層水體中占比最高且濃度呈顯著高值(2.75×104copies/L)外,其他3個站位沙海蜇mt-16S rDNA均為底層占比高于表層占比,離岸最遠的P2站位在底層水體中沙海蜇mt-16S rDNA濃度最高,為8.44×103copies/L(見圖4)。2013年9月,16個調(diào)查站位中均檢測出沙海蜇mt-16S rDNA,其中有10個站位沙海蜇mt-16S rDNA底層占比高于表層占比。I5站沙海蜇mt-16S rDNA濃度在底層水體中出現(xiàn)顯著高值,為2.56×104copies/L(見圖5)。

圖4 2013年8月黃東海海域沙海蜇mt-16S rDNA的垂直分布

圖5 2013年9月黃東海海域沙海蜇mt-16S rDNA的垂直分布

2.3 黃東海沙海蜇mt-16S rDNA濃度與溫度、鹽度的相關(guān)關(guān)系

2013年5月,在長江口及其鄰近海域站位進行的4次采樣中,5月初溫度和鹽度平均值分別為15.62 ℃和24.60,溫度高值區(qū)和鹽度低值區(qū)均出現(xiàn)在M斷面(31°N),這與5月上旬最早檢出較高mt-16S rDNA的位置相一致(見圖6、7)。

圖6 2013年5月黃東海表層海水溫度等值線圖

圖7 2013年5月黃東海表層海水鹽度等值線圖

2013年8月,調(diào)查海區(qū)的溫度變化范圍為7.95～29.45 ℃,鹽度變化范圍為22.65～33.69,溫度高值區(qū)出現(xiàn)在I、PN、G斷面(30°N—35°N),溫度平均值分別為27.80、28.30、28.46 ℃,這與2013年8月沙海蜇mt-16S rDNA高值區(qū)位置相一致(見圖8a、圖9a)。2013年9月,調(diào)查海區(qū)的溫度變化范圍為9.24～27.95 ℃,鹽度變化范圍為25.30～33.91,溫度高值區(qū)出現(xiàn)在PN、Q斷面(30°N—31°N),溫度平均值分別為26.59、27.64 ℃,沙海蜇mt-16S rDNA較高的I斷面溫度和鹽度平均值分別為25.6 ℃和31.6,I斷面的由這4個月的調(diào)查結(jié)果可知,5月初長江口附近海域溫度高值區(qū)和鹽度低值區(qū)與5月最早檢出較高mt-16S rDNA的位置相一致,8月黃東海沙海蜇mt-16S rDNA高值區(qū)與溫度高值區(qū)位置大致相同,而10月黃東海沙海蜇mt-16S rDNA高值區(qū)與溫度低值區(qū)位置一致。

圖8 2013年8月、9月和2012年10月黃東海表層海水溫度等值線圖

圖9 2013年8月、9月和2012年10月黃東海表層海水鹽度等值線圖

溫度平均值明顯低于2013年8月(見圖8b、圖9b)。2012年10月,調(diào)查海區(qū)的溫度變化范圍為17.89～23.82 ℃,鹽度變化范圍為23.07～34.30。溫度高值區(qū)出現(xiàn)在PN斷面(30°N—31°N),溫度平均值為23.30 ℃。溫度低值區(qū)位于A、C、E斷面(34°N—37°N),溫度平均值分別為18.11、19.60、19.70 ℃。溫度低值區(qū)與2012年10月沙海蜇mt-16S rDNA高值區(qū)位置相一致(見圖8c、圖9c)。

3 討論

沙海蜇在中國黃東海海域出現(xiàn)的時間為5月到12月。5月開始在黃東海交界處出現(xiàn)少量的水母幼體,6月沙海蜇在南黃海的分布區(qū)域有所擴大,8月末到9月初,沙海蜇幾乎遍布黃海,此時其豐度和生物量達到最高值。沙海蜇水母體在秋季9月、10月達到性成熟,10月到12月沙海蜇的分布區(qū)域逐漸向北轉(zhuǎn)移,生物量逐漸減少至零[23]。因此,5月海水中沙海蜇mt-16S rDNA應來自沙海蜇的碟狀體和水母幼體,8—9月,海水中沙海蜇mt-16S rDNA主要來源為成體水母及其產(chǎn)生的精子、卵子和浮浪幼蟲。本次研究結(jié)果顯示,5月在長江口及其鄰近海域檢測到沙海蜇mt-16S rDNA,8月到10月,沙海蜇mt-16S rDNA高值區(qū)的分布區(qū)域依次為臨近長江口海域、蘇北淺灘外海海域和南黃海北部海域,高值出現(xiàn)的時間呈“先南后北”的趨勢,且8月和9月沙海蜇mt-16S rDNA濃度明顯高于10月。Sun等[13]對2012年和2013年黃東海海域沙海蜇水母體分布的研究表明,8月和9月沙海蜇水母體豐度和生物量明顯高于10月,分布上,8月沙海蜇水母體分布范圍覆蓋30°00′N—37°00′N,9月沙海蜇水母體的分布已經(jīng)開始向北收縮,32°00′N以北海域沙海蜇水母體豐度較高,10月水母體收縮至34°00′N以北的南黃海北部海域,沙海蜇水母體豐度高值區(qū)整體呈“由南向北”的趨勢。本研究中沙海蜇mt-16S rDNA高值區(qū)變化趨勢與沙海蜇水母體的分布規(guī)律相一致。

沙海蜇幼體對外界環(huán)境適應力較弱,主要生活在暖水區(qū)或冷暖水交匯區(qū)[12]。長江口近海由于臨近河口和陸地,富營養(yǎng)化導致微型生物的生物量較高,春末夏初該海域有一個快速升溫的過程,且受沖淡水的影響海水鹽度較低,這些都為沙海蜇幼體的生存和生長提供了較為有利的理化條件和餌料基礎(chǔ)[12]。Sun等[13]研究發(fā)現(xiàn),沙海蜇于5月下旬至6月上旬在31°30′N—33°00′N、122°00′E—122°45′E的小區(qū)域出現(xiàn),推測長江口近海區(qū)域可能是沙海蜇主要繁殖地之一。本次調(diào)查中,5月末和6月初沙海蜇mt-16S rDNA高值區(qū)出現(xiàn)在32°00′N—33°00′N、122°00′E—123°00′E,且在該區(qū)域觀察到較高數(shù)量沙海蜇碟狀體和幼水母,這與已有研究結(jié)果一致,從分子證據(jù)上支持長江口近海海域是沙海蜇的主要繁殖地之一的結(jié)論。沙海蜇的產(chǎn)卵期為8—9月或9—10月[23-24]。本次調(diào)查中,2012年10月在34°00′N的北部海區(qū)沙海蜇mt-16S rDNA的平均濃度為200.9 copies/L,表層海水溫度平均值為19 ℃,而南部海區(qū)沙海蜇mt-16S rDNA的平均濃度為24.3 copies/L,表層海水溫度平均值為22 ℃,北部海區(qū)比南部海區(qū)的沙海蜇mt-16S rDNA濃度高一個數(shù)量級,表層海水溫度也明顯低于南部海區(qū),這進一步證實了秋末沙海蜇趨向分布于黃海冷水團區(qū)[25]。2013年9月沙海蜇mt-16S rDNA高值區(qū)出現(xiàn)在I斷面(33°00′N),該斷面位置處于黃海南部中央水區(qū),沙海蜇mt-16S rDNA高值區(qū)與黃海冷水團區(qū)相吻合,推測該區(qū)域是沙海蜇的產(chǎn)卵區(qū)。

本次調(diào)查中黃東海海區(qū)沙海蜇mt-16S rDNA的時空分布規(guī)律與已有研究的水母體分布總體相一致,從8月到10月高值區(qū)均呈由南向北移動的趨勢,但具體到每個站位卻不一定吻合。相較于近岸站位,離岸的P2、I5站位底層海水中沙海蜇mt-16S rDNA更高。沙海蜇為雌雄異體,體外受精,受精卵經(jīng)1～1.5 d便可發(fā)育成為浮浪幼蟲[24,26],通過對海水中沙海蜇mt-16S rDNA垂直分布分析發(fā)現(xiàn),沙海蜇mt-16S rDNA在底層水體中濃度較高。腔腸動物的浮浪幼蟲可以在水體中以晝夜節(jié)律升降,在下降過程中碰到海底,搜索合適的基質(zhì),附著并變態(tài)為螅狀體[27],浮浪幼蟲可能更趨向于向有利于其附著的區(qū)域分布[28]。

通過產(chǎn)卵期沙海蜇mt-16S rDNA的數(shù)量可以推測水母浮浪幼蟲大量聚集的區(qū)域,結(jié)合該區(qū)域的理化條件進一步推測浮浪幼蟲及螅狀體的棲息區(qū)域,進而可追溯水母的生存環(huán)境、追蹤種群來源及動態(tài)。本研究通過沙海蜇mt-16S rDNA在5月最早檢出站位和秋末產(chǎn)卵期高值檢出站位推測,30°30′N—31°30′N、122°30′E—124°00′E部分區(qū)域可能具備有利于沙海蜇浮浪幼蟲附著的基質(zhì)或理化條件,是我國沙海蜇的潛在棲息地。

4 結(jié)語

本研究應用qPCR技術(shù)對2012年10月、2013年5月、2013年8月和2013年9月黃東海海區(qū)中沙海蜇進行定量檢測,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)4個調(diào)查月份均檢測到沙海蜇mt-16S rDNA,其中2013年8月的濃度最高,2013年9月、2012年10月依次降低一個數(shù)量級;(2)沙海蜇mt-16S rDNA最早于5月上旬在長江口近岸海域出現(xiàn)較高檢出值(隨后向北分布),秋末檢出高值區(qū)主要位于34°N以北的黃海海域;(3)相較于近岸站位,長江口離岸站位底層海水中沙海蜇mt-16S rDNA更高。本研究克服了傳統(tǒng)采樣和形態(tài)學鑒別方法的局限,實現(xiàn)了對環(huán)境中沙海蜇DNA的快速定量研究,進一步分析了黃東海沙海蜇DNA的時空分布特征,可為追溯沙海蜇的起源、聚集和棲息地研究提供參考。

致謝：誠摯感謝中國科學院海洋研究所張芳研究員提供的現(xiàn)場網(wǎng)采沙海蜇豐度數(shù)據(jù),天津大學魏皓教授提供的現(xiàn)場站位的溫度、鹽度以及深度數(shù)據(jù)。