9種重樓屬植物葉中甾體皂苷成分差異的研究

李龍星　李海峰　王成軍

【摘要】目的：探討9種重樓屬植物葉中甾體皂苷有效成分和主成分的差異。方法：采用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)定性分析9種重樓屬植物葉中甾體皂苷有效成分和主成分的差異及相關(guān)性。結(jié)果：金線重樓、南重樓、七葉一枝花葉中均檢測(cè)到重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷 Ⅲ（薯蕷皂苷）、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷 Ⅶ、 重樓皂苷 H、纖細(xì)薯蕷皂苷8種甾體皂苷有效成分，黑籽重樓、多葉重樓、滇重樓（闊瓣）葉中檢測(cè)到7種甾體皂苷有效成分，滇重樓、毛重樓葉中檢測(cè)到6種甾體皂苷有效成分，長(zhǎng)柱重樓葉中檢測(cè)到4種甾體皂苷有效成分，其中重樓皂苷Ⅰ、纖細(xì)薯蕷皂苷是重樓屬植物葉中的主要存在形式；根據(jù)重樓屬植物葉正離子模式下液質(zhì)數(shù)據(jù)的主成分分析（PCA）模型可將長(zhǎng)柱重樓、金線重樓、滇重樓、多葉重樓、南重樓、七葉一枝花聚為一類，其主要成分無(wú)顯著差異。結(jié)論：金線重樓、南重樓 、七葉一枝花葉中8種主要甾體皂苷有效成分和化學(xué)成分種類無(wú)顯著差異。

【關(guān)鍵詞】重樓屬；葉；液質(zhì)聯(lián)用；甾體皂苷

【中圖分類號(hào)】R284.1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2023）19-0012-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.19.zgmzmjyyzz202319004

Research on the Differences of the Active Ingredients of Steroid Saponins in the Leaves of Paris L.LI Longxing1， 3LI Haifeng1， 3WANG Chengjun1*

1. Yunnan Key Laboratory of Screening and Research on Anti-pathogenic Plant Resources from

West Yunnan （Cultivation）， Dali 671000，China；2. College of Pharmacy，Dali University，Dali 671000，China；

3. Analysis and Testing Center，Dali University，Dali 671000，ChinaAbstract：Objective To investigate the differences and correlation of the active ingredients of steroid saponins and principal component in the leaves of Paris L.. Methods The differences and correlation of the active ingredients of steroid saponins and principal component in the leaves of Paris L.were qualitative analysis by LC-MS. Results Detect the active ingredients of Polyphyllin Ⅰ，Polyphyllin Ⅱ，Polyphyllin Ⅲ（Dioscin）， Polyphyllin Ⅴ，Polyphyllin Ⅵ，Polyphyllin Ⅶ，Polyphyllin H and Gracillinin the leaves of P.delavayi，P. vietnamensis and var. chinensis，thereare sevenactive ingredientsin the leaves of P. thibetica，P. polyphylla and var. yunnanensis-1and six active ingredients in the leaves of P. mairei and var. yunnanensis，but only four active ingredients in the leaves of P. forrestii，PolyphyllinⅠand Gracillin was the main form of steroid saponins in the leaves of Paris L.;P. delavayi，P. vietnamensis，P. forrestii，P. polyphylla，var. chinensis and var. yunnanensis can be classified into one categories according to the PCA model of the data of LC-MS under the positive ion mode of Paris L.. Conclusion There is little differences of active ingredients of steroid saponins and chemical composition in the leaves of P. delavayi，P. vietnamensis and var. chinensis.

Keywords：Paris L.; Leaf; Liquid Chromatography-Mass Spectrometry; Steroid Saponins

重樓屬（Paris L.）為百合科（Linnaeus）草本植物，全世界有 24 種，我國(guó)有 19 種，主要分布于云南、廣西、四川等地，其中七葉一枝花Paris polyphylla Sm.var chinensis （Franch.）和滇重樓Paris polyphylla Sm.var.yunnanensis （Franch.）被歷版《中華人民共和國(guó)藥典》所收載，是重樓藥材的基源植物，重樓藥材以干燥根莖入藥［1］，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，可用于咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛等癥的治療［2-3］，是云南白藥、宮血寧膠囊、季德蛇藥等著名中成藥的主要原料，甾體皂苷類物質(zhì)是其主要有效成分［4］，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ總含量是《中國(guó)藥典》（2020 版一部）用于質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分［5］。

云南是重樓藥材的主要來(lái)源地，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期無(wú)序大量的野生采挖，致使資源日漸枯竭，野生資源瀕臨滅絕［4］。因金線重樓、南重樓、毛重樓、黑籽重樓等重樓屬植物根莖與七葉一枝花及滇重樓根莖植物學(xué)形態(tài)無(wú)顯著差異，所以在云南金線重樓、南重樓、毛重樓、黑籽重樓等重樓屬植物作為重樓藥材替代品銷售入藥現(xiàn)象極其普遍，這勢(shì)必影響到與其相關(guān)中成藥的品質(zhì)。重樓屬植物甾體皂苷類物質(zhì)是在植物葉綠體中合成，經(jīng)莖向下運(yùn)輸，主要在根莖中積累和儲(chǔ)存［1］。筆者前期研究［6-7］發(fā)現(xiàn)，黑籽重樓、長(zhǎng)柱重樓與滇重樓、滇重樓（闊瓣）、金線重樓、毛重樓、五指蓮、多葉重樓、南重樓等重樓屬植物根莖中甾體皂苷類物質(zhì)差異較大，這種差異可能與不同品種重樓屬植物甾體皂苷類物質(zhì)在植物葉綠體中生物合成差異有關(guān)，是導(dǎo)致重樓屬植物品質(zhì)差異的根本。因此，本研究擬采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（UPLC-ESI-Q-TOF-MS）對(duì)9種重樓屬植物葉中甾體皂苷類物質(zhì)進(jìn)行定性分析［8-10］，以及質(zhì)荷比（m/z）50～2000 Da之間的主成分（principal component analysis， PCA）及主要差異峰進(jìn)行分析，為9種重樓屬植物葉中甾體皂苷類物質(zhì)差異及其利用提供依據(jù)。

1材料

2020年9月，在云南大理、保山等地采集重樓屬植物樣品，植株樣品由大理大學(xué)李海峰教授鑒定，見(jiàn)表1，新鮮樣品自然干燥，備用。

對(duì)照品重樓皂苷Ⅰ（批號(hào)111590-2004022），重樓皂苷Ⅱ（批號(hào)111591-200301），重樓皂苷Ⅵ（批號(hào)111591-200301），重樓皂苷Ⅶ（批號(hào)111590-200402），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為超純水，無(wú)水乙醇等均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.19種重樓屬植物葉中甾體皂苷有效成分的測(cè)定

2.1.1色譜條件色譜柱為Dionex-C₁₈（150 mm×2.1 mm，3μm）；流動(dòng)相水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～12 min B相為45%～60%，12～25 min B相為60%～30%，25～28 min B相為30%～100%，28～30 min B相為100%，30～35 min B相為100%～45%，35～40 min B相為45%；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫30℃；流速0.2 mL·min-1；進(jìn)樣量10μL。

2.1.2質(zhì)譜條件參照筆者建立的方法［6-7］，Bruker Q-TOF-MS質(zhì)譜系統(tǒng)，離子源為電噴霧離子源，正離子模式掃描，離子源溫度是220℃，金屬毛細(xì)管電壓是4000 V，終板抵消電壓是500 V，霧化器壓力是253.8 kPa，干燥氣體是氮?dú)猓稍餃囟仁?50℃，氣體流速每鐘8 L，掃描質(zhì)量范圍m/z 50～2000 Da，碰撞氣體氬氣，掃描碰撞能量8eV，六級(jí)桿射頻電壓是70 Vpp，四級(jí)桿離子能量是8eV，質(zhì)量數(shù)用Na［NaCOOH］溶液作校正。

2.1.3混合對(duì)照品溶液的制備在十萬(wàn)分之一分析天平上分別精密稱取重樓皂苷Ⅰ1.13mg、重樓皂苷Ⅱ1.02mg、重樓皂苷Ⅵ1.16mg、重樓皂苷Ⅶ1.08mg對(duì)照品，加入到10 mL容量瓶，加甲醇溶解，稀釋至刻度定容，混合均勻，即得0.113mg·L^-1、0.102mg·L^-1、0.116mg·L^-1、0.108mg·L^-1重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合對(duì)照品溶液，4℃冷藏，備用。

2.1.49種重樓屬植物葉供試品溶液的制備分別取9種重樓屬植物葉，細(xì)粉，干燥箱中40℃干燥到恒重，過(guò)100目篩，分別在50 mL玻璃三角瓶中精密稱取9種重樓屬植物葉樣品粉末0.1000 g，分別加75%乙醇4 mL，40℃40 kHz超聲浸提20 min，過(guò)濾，收集濾液，濾渣分別用2 mL75%乙醇重復(fù)超聲浸取2次，合并3次浸提液，加入到10 mL容量瓶，冷卻到室溫，加乙醇溶液至刻度定容，混全均勻，即得9種重樓屬植物葉供試品溶液，液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)樣前用0.22μm微孔有機(jī)相濾膜過(guò)濾。

2.1.5方法專屬性分別在正離子和負(fù)離子模式下對(duì)重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合對(duì)照品溶液進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用測(cè)試，結(jié)果顯示，在正離子模式下混合對(duì)照品溶液質(zhì)譜響應(yīng)較好，負(fù)離子模式下混合對(duì)照品溶液響應(yīng)較小，所以實(shí)驗(yàn)在正離子模式下進(jìn)行定性分析，分別得到重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合對(duì)照品溶液色譜圖（A）和總離子流圖（B），結(jié)果如圖1所示，方法專屬性良好。

2.29種重樓屬植物葉中甾體皂苷有效成分分析分別取“2.1.3”重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合對(duì)照品溶液及“2.1.4”9種重樓屬植物葉供試品溶液，在“2.1.1”及“2.1.2”項(xiàng)下進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定，每個(gè)樣品進(jìn)樣10μL，分別測(cè)得重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合對(duì)照品及9種重樓屬植物葉的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，用Bruker Daltonics公司Data Analysis數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并與重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對(duì)照品溶液質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，分析并鑒定9種重樓屬植物葉中甾體皂苷類物質(zhì)。在正離子掃描模式下，用甲酸鈉質(zhì)荷比m/z90.9766進(jìn)行電噴霧離子源內(nèi)部校正，模式為HPC，搜索范圍為0.05，強(qiáng)度為1000，設(shè)置micrQ-TOF外標(biāo)法最大誤差為m/z>400（5 ppm）或m/z<400（4 mDa）。使用Chemistry對(duì)9種重樓屬植物葉中甾體皂苷類物質(zhì)進(jìn)行定性分析，用Smart Formula計(jì)算質(zhì)譜圖中所出峰分子式，Smart Formula Manually計(jì)算某一特定m/z峰的分子式，選中質(zhì)譜圖中分子離子峰，輸出相應(yīng)分子離子峰的分子式。

2.39種重樓屬植物葉中主成分PCA模型的建立將“2.2”測(cè)得的9種重樓屬植物葉中質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Bruker Daltonics公司Profil Analysis軟件，再根據(jù)9種重樓屬植物進(jìn)行單因素分組建模，建立PCA模型，分析9種重樓屬植物葉中主成分差異。質(zhì)量范圍設(shè)為50～2000 m/z，時(shí)間范圍設(shè)為0.2～40 min，時(shí)間容差設(shè)為2 min，質(zhì)量容差設(shè)1.0 m/z，強(qiáng)度歸一化，無(wú)數(shù)據(jù)前處理，無(wú)背景扣除，無(wú)干擾峰扣除。

2.49種重樓屬植物葉中甾體皂苷類物質(zhì)的測(cè)定對(duì)金線重樓、毛重樓、南重樓、黑籽重樓、長(zhǎng)柱重樓、多葉重樓、滇重樓（闊瓣）、七葉一枝花、滇重樓植物葉進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定，分析正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，正離子模式下9種重樓屬葉中主成分均有較好的響應(yīng)，所以用正離子模式下數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到9種重樓屬植物葉的色譜圖（a）和總離子流圖（b），如圖2所示。

2.59種重樓屬植物葉中主要甾體皂苷有效成分分子式分析對(duì)所測(cè)得的9種重樓屬植物葉質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并與重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對(duì)照品質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，以及結(jié)合部分碎片信息、筆者前期建立的化合物庫(kù)信息、文獻(xiàn)報(bào)道，鑒定9種重樓屬植物葉中甾體皂苷類物質(zhì)，得到9種重樓屬植物葉中分子離子峰所對(duì)應(yīng)的樣品理論分子量及誤差，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

如圖3所示，2號(hào)峰在正離子模式可見(jiàn)m/z 871.4623 ［M+H］+和m/z 893.4598 ［M+Na］+，結(jié)合出峰時(shí)間與離子碎片可推測(cè)為重樓皂苷 H（C₄₄H₇₁O₁₇，3-O-α-L-rha（1→2）［α-L-ara（1→4）］-β-D-glc）。如圖4所示，5號(hào)峰在正離子模式可見(jiàn)m/z 869.4948 ［M+H］+和m/z 891.4685 ［M+Na］+，結(jié)合出峰時(shí)間、離子碎片綜合推測(cè)為纖細(xì)薯蕷皂苷（Dioscin，C₄₅H₇₂O₁₆，3-O-α-L-ha（1→2）［α-L-rha （1→4）］-β-D-glc）。如圖5所示，6號(hào)峰在正離子模式可見(jiàn)m/z 885.4626 ［M+H］+和m/z 907.4419 ［M+Na］+，結(jié)合出峰時(shí)間、離子碎片綜合推測(cè)為纖細(xì)薯蕷皂苷（Gracillin，C₄₅H₇₂O₁₇，3-O-β-D-glc （1→3）［α-L-rha（1→2）］-β-D-glc）。如圖6所示，8號(hào)峰在正離子模式可見(jiàn)m/z 723.4260 ［M+H］+和m/z 745.4223［M+Na］+，結(jié)合出峰時(shí)間、離子碎片綜合推測(cè)為重樓皂苷Ⅴ［C₃₉H₆₂O₁₂，3-O-α-L-rha（1→2）-β-D-glc］。

2.69種重樓屬植物葉中主成分PCA分析分析9種重樓屬植物葉中正離子模式下質(zhì)譜質(zhì)數(shù)據(jù)主成分PCA及主要差異峰，PCA主成分 （圖8）及主要差異峰（圖9）結(jié)果表明，在PC第一維度，9種重樓屬植物葉中主成分能夠得到較好的分離，可大致聚為四類。其中CZCL（長(zhǎng)柱重樓）、JXCL（金線重樓）、DCL（滇重樓）、DYCL（多葉重樓）、NCL（南重樓）、YZH（七葉一枝花）分布集中，可以聚為第一類，主要化學(xué)成分無(wú)顯著差異；MCL（毛重樓）可聚為第二類，與重樓屬6種植物之間距離最近，主成分差異最小；HZCL（黑籽重樓）可聚為第三類；KBCL［滇重樓（闊瓣）］可聚為第四類，與重樓屬6種植物之間距離最遠(yuǎn)，主成分差異最大。且從分析結(jié)果可得在30.70min，450.500m/z（A）；14.70min，330.500m/z（B）；6.70min，382.500m/z（C）；15.70min，456.500m/z（D）；10.70min，496.500m/z（E）；12.70min，536.500m/z（F）；19.70min，480.500m/z（G）；1.70min；164.500m/z（H）；1.70min，381.500m/z（I）；34.70min，284.500m/z（J）；13.70min，496.500m/z（K）；16.70min，466.500m/z（L）；11.70min，496.500m/z（M）這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)為主要差異峰。

3討論

運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用方法定性分析9種重樓屬植物葉中重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ（薯蕷皂苷）、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷 H及纖細(xì)薯蕷皂苷等8種甾體皂苷，結(jié)果表明，金線重樓、南重樓、七葉一枝花葉中均檢測(cè)到8種甾體皂苷，黑籽重樓、多葉重樓、滇重樓（闊瓣）葉中檢測(cè)到7種甾體皂苷，滇重樓、毛重樓葉中檢測(cè)到6種甾體皂苷，長(zhǎng)柱重樓葉中檢測(cè)到4種甾體皂苷，重樓皂苷Ⅰ、纖細(xì)薯蕷皂苷在9 種植物葉中均檢測(cè)到。根據(jù)重樓屬9種植物葉正離子模式下液質(zhì)數(shù)據(jù)的主成分PCA模型可將滇重樓、金線重樓、長(zhǎng)柱重樓、多葉重樓、南重樓、七葉一枝花聚一類，主要化學(xué)成分無(wú)顯著差異。

雖然重樓屬植物葉中甾體皂苷類物質(zhì)均經(jīng)異戊二烯代謝途徑合成［10］，但是不同品種在不同氣候、土壤等生態(tài)因子的共同作用下可能是引起重樓屬植物葉中化學(xué)成分差異的根本，這種差異可能與不同品種重樓屬植物甾體皂苷類物質(zhì)在植物葉綠體中生物合成差異有關(guān)，是導(dǎo)致重樓屬植物品質(zhì)差異的根本。而這種差異的形成值得進(jìn)一步深入探討，為從生物合成途徑研究其它重樓屬植物替代滇重樓和七葉一枝花入藥提供依據(jù)。

另外，云南是重樓藥材的主要來(lái)源地，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期無(wú)序大量的野生采挖，致使資源日漸枯竭，野生資源瀕臨滅絕［4］。因金線重樓、南重樓、毛重樓、黑籽重樓等重樓屬植物根莖與七葉一枝花及滇重樓根莖植物學(xué)形態(tài)無(wú)顯著差異，該文研究結(jié)果顯示8種主要甾體皂苷有效成分和化學(xué)成分種類無(wú)顯著差異。用重樓莖、葉替代根莖入藥值得深入研究。

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（收稿日期：2023-01-15編輯：劉斌）