雙相培養在肺結核診斷中的價值

劉 君 陳麗艷 涂 凡 芮小紅 張瑩瑩

（1.江南大學附屬無錫市第五人民醫院檢驗科，江蘇 無錫 214000；2.無錫市河埒街道社區衛生服務中心檢驗科，江蘇 無錫 214000）

結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的慢性感染性疾病，是單一傳染病致死的首要原因[1]。我國的結核病負擔居世界第3位，其中肺結核是最常見的結核病類型。結核病的準確和及時診斷對于患者管理和疾病控制至關重要。目前，結核病診斷主要通過培養法（金標準）、世界衛生組織推薦的Xpert MTB/RIF和T細胞斑點試驗（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）等。然而，上述技術雖然有較高的敏感性，但存在耗時長、成本高等不足。因此，簡便、快速且低成本的診斷技術是我國結核病防控的關鍵。本研究擬分析雙相培養技術在結核病，尤其是肺結核診斷中的價值，為臨床診治提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年7—12月江南大學附屬無錫市第五人民醫院臨床確診肺結核患者175例，其中男121例、女54例，年齡（56.7±19.7）歲。肺結核診斷依據我國衛生行業標準WS 288—2017《中國肺結核診斷》。入組流程見圖1。本研究經無錫市第五人民醫院倫理委員會審核通過（2021-021-1）。

圖1 研究對象入組流程圖

1.2 儀器和試劑

ST-16型細胞離心機和HERAcell 150i CO2培養箱購自美國Thermo Fisher Scientific有限公司；Xpert MTB/RIF試劑盒購自賽沛（上海）公司；2% N-乙酰半胱氨酸-NaOH溶液和0.5% NaOH溶液由實驗室自配；T-SPOT試劑購自上海復星醫學診斷公司；抗酸染色液、中性羅氏培養基購自珠海BASO公司；復蘇促進因子（resuscitationpromoting factor，Rpf）培養液由上海市公共衛生臨床中心結核病感染免疫課題組惠贈。

1.3 方法

1.3.1 濃縮集菌抗酸染色鏡檢[2]

囑患者留取清晨起床漱口后從肺深部咳出的痰液1～2 mL，挑取膿樣、干酪樣部分，加入適量0.5% NaOH溶液，振蕩混勻，于100 ℃沸水中加熱30 min；取出后1 662×g離心15 min，棄上清，取沉淀物涂片，烘干后行抗酸染色鏡檢。結果判讀：油鏡下見紅色桿狀或分枝狀抗酸桿菌，可報告陽性；如連續觀察300個不同視野未發現抗酸桿菌，則報告陰性。

1.3.2 樣本前處理

挑取約5 mL痰樣本至50 mL離心管中，加等量2% N-乙酰半胱氨酸-NaOH溶液，旋渦振蕩20 s，室溫靜置15 min，加無菌磷酸鹽緩沖液（pH值6.8）至50 mL，886×g離心，15 min，棄上清，添加1～3 mL磷酸鹽緩沖液（pH值6.8）以中和至pH值6.8。

1.3.3 雙相培養[3]

痰樣本進行前處理后，在中性羅氏培養基中加入1 mL Rpf培養液，制備成雙相培養基，將處理后的0.5 mL痰樣本加入雙相培養管中，置于搖床上24 h，使含有樣本的培養液均勻涂布在固體培養基斜面上，斜面朝上放入37 ℃恒溫培養箱內培養。接種后每日觀察固體培養基表面菌落生長情況和液體培養基渾濁情況。結果判讀：液相成分中觀察到培養液渾濁或顆粒樣菌團懸浮，震蕩后無明顯變化，經涂片證實后，可記錄為陽性結果；觀察固體培養基上的菌落生長形態，鑒別非結核分枝桿菌（nontuberculousMycobacterium，NTM）；8周后仍無細菌生長，記錄為陰性結果。

1.3.4 Xpert MTB/RIF檢測

將痰液收集在防漏收集容器中，將樣本處理試劑（2∶1）加入樣本中，蓋上蓋子，用力震蕩10～20次，室溫靜置10 min，再次震蕩10～20次使樣本充分液化，靜置5 min；使用專用無菌移液管吸取2 mL液化后的樣本到檢測匣加樣孔中，關閉檢測匣蓋子，上機檢測。檢測結果由儀器自動判讀。

1.3.5 T-SPOT檢測

用肝素抗凝管采集患者空腹新鮮靜脈血5 mL，加入Ficoll分離液分離單個核細胞，用細胞培養液配置成25萬細胞/mL的標準溶液。在檢測孔中加入50 μL CFP-10、ESAT-6抗原蛋白混合溶液，陰性孔加入50 μL細胞培養液，陽性對照孔加入50 μL植物血凝素，然后每孔加入100 μL配置好的細胞標準溶液，混勻后置于CO2培養箱中，37 ℃培養過夜，第2天用磷酸鹽緩沖液洗脫3遍，加入生物標記的抗γ干擾素抗體50 μL，4 ℃孵育2 h，磷酸鹽緩沖液洗脫干凈后，行酶聯顯色，顯微鏡下記錄斑點數。

1.4 統計學分析

采用Graphpad 7.0軟件進行統計分析。計數資料以例/率表示，比較采用Fisher精確概率法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雙相培養、T-SPOT、Xpert MTB/RIF、濃縮集菌抗酸染色鏡檢陽性檢出率比較

雙相培養陽性檢出率（57.7%）顯著低于T-SPOT（71.3%）（P<0.05）；稍高于濃縮集菌抗酸染色（41.7%）和Xpert MTB/RIF（53.6%），但差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 4種方法陽性檢出率比較

2.2 抗酸涂片陰性時，雙相培養、T-SPOT、Xpert MTB/RIF陽性檢出率比較

175份臨床確診患者樣本中，抗酸染色陰性102例，將其中61例樣本行雙相培養、T-SPOT、Xpert MTB/RIF檢測，結果顯示，雙相培養檢出率（35.0%）顯著低于T-SPOT（65.6%）（P<0.001）；與Xpert MTB/RIF檢出率（32.7%）比較，差異無統計學意義（P=0.99）。見圖2、表2。

表2 抗酸涂片陰性樣本3種方法陽性檢出率比較

圖2 抗酸涂片陰性樣本3種方法陽性結果分布

2.3 抗酸染色和雙相培養聯合檢測與T-SPOT和Xpert MTB/RIF陽性率比較

抗酸染色和雙相培養技術聯合陽性檢出率為62.3%（109例），稍高于Xpert MTB/RIF陽性檢出率（53.6%），略低于T-SPOT陽性檢出率（71.3%），但差異均無統計學意義（P值分別為0.129、0.117）。

2.4 雙相培養鑒別MTB和NTM感染比較

MTB和NTM在雙相培養基中同時培養20 d的菌落形態見圖3，MTB菌落在瓊脂上呈現干燥菜花樣典型的顆粒，NTM菌落不典型，較濕潤、形態細小光滑，與普通細菌類似，而T-SPOT和Xpert MTB/RIF由于方法學的原因只能診斷MTB感染，無法診斷NTM感染。

圖3 雙相培養基MTB和NTM菌落形態

3 討論

我國是結核病高負擔國家之一，活動性肺結核及時準確的診斷仍是臨床工作中最大的挑戰。雖然抗酸染色、MTB培養、Xpert MTB/RIF和T-SPOT等技術可以用于診斷結核病[4-7]，但均存在局限。痰液直接涂片抗酸染色法是目前應用最廣泛的實驗室檢測技術，雖然該技術快速、經濟，但敏感性不高，而且顯微鏡鏡檢無法區分MTB和NTM；細菌培養是診斷結核病的金標準，也可以分析菌株耐藥性，但耗時長；T-SPOT基于暴露于MTB特異性抗原的淋巴細胞分泌的γ-干擾素，已被用于診斷MTB感染[8-9]，且結果不受接種卡介苗和NTM感染的影響，在臨床實踐中用來代替結核菌素皮膚試驗（tuberculin skin test，TST），但無法區分活動性結核病和潛伏性結核病[9-11]。Gene Xpert/RIF可同時檢測MTB和利福平耐藥相關突變基因，在人類免疫缺陷病毒感染等免疫抑制患者中循環閾值顯著增加[12]。有研究發現，免疫抑制患者Xpert MTB/RIF敏感性和陰性預測值都較低[13]。

有研究證實了結核病患者痰樣本存在非復制MTB[14]。非復制MTB在固體培養基上無法生長，這可能是MTB培養通常需要6～8周，甚至陰性的原因[15-16]。Rpf是細菌蛋白質家族，由MTB產生，可刺激分枝桿菌生長[17-18]，具有與溶菌酶相關的酶活性，可水解細菌細胞壁，能夠使非復制MTB復蘇。有研究發現，Rpf能水解MTB休眠菌的細胞壁肽聚糖，從而使MTB從休眠狀態轉變為活躍復制狀態，且能在體外促進MTB休眠菌復蘇[19-20]。痰中的非復制MTB被Rpf復蘇，可以提高MTB培養的陽性率，縮短報陽時間[13]。有研究發現，在Rpf的刺激下，MTB菌落數是普通培養獲得的菌落數的至少4倍[21]。本研究基于Rpf可以刺激痰樣本中非復制MTB的生長原理，在中性瓊脂培養基斜面上添加含有Rpf的液體培養基，制成雙相培養基，結果顯示，175例肺結核患者痰樣本雙相培養的陽性檢出率為57.7%，明顯高于濃縮集菌抗酸染色的陽性檢出率（41.7%，P<0.05），略高于Xpert MTB/RIF5的陽性率（53.6%，P=0.503），但低于T-SPOT的陽性率（71.3%，P<0.05）。本研究結果顯示，在抗酸染色陰性的樣本中，雙相培養陽性檢出率為35.0%，低于T-SPOT（65.6%，P=0.001）；與Xpert MTB/RIF的陽性率（32.7%）相當（P=0.99）。這些數據進一步證實了在抗酸染色陰性活動性肺結核患者中，雙相培養與Xpert MTB/RIF有著等效甚至略微的優勢。我國結核病治療任務和患者經濟負擔都較重，相對于治療成本較高的Xpert MTB/RIF和T-SPOT，雙相培養的成本只有其1/10，大大減輕了患者經濟負擔。而且，雙相培養方法與抗酸染色一樣，操作簡便，不需要特殊儀器，為我國結核病篩查第一哨點的基層醫院開展MTB檢測提供了可能。本研究中，雙相培養和抗酸染色聯合檢測的陽性檢出率高達62.3%，超過了國家疾病預防控制中心關于結核病患者病原生物學陽性檢出不低于50%的要求，且高于Xpert MTB/RIF陽性檢出率53.6%，僅比T-SPOT的陽性檢出率（71.3%）略低。同時，還能通過固相培養基中菌落的經典形態初步鑒別NTM，規避了Xpert MTB/RIF和T-SPOT無法檢測NTM的不足。

結核病快速分子檢測的優勢在于其敏感性高、特異性強、檢測時間短[22]。但Xpert MTB/RIF的缺點是僅能鑒定MTB，無法鑒別NTM；僅能檢測RIF耐藥與否，無法判斷其他抗結核藥物的敏感性；而且成本較高，我國大部分基層醫療機構尚無條件開展應用。

綜上所述，本研究通過雙相培養技術與抗酸染色聯合應用，實現了在有限的醫療硬件平臺達到與GeneXpert/RIF等效的檢測效果，給肺結核的早期診斷提供了新的思路。