藥物輔助犯罪案件血液中右美托咪定的檢測分析

翟文婭，武麗娜，陽碩，沈保華，施妍

1.司法鑒定科學研究院 上海市法醫學重點實驗室 司法部司法鑒定重點實驗室 上海市司法鑒定專業技術服務平臺，上海 200063；2.西安交通大學法醫學院，陜西 西安 710061

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是一種高選擇性的α2腎上腺素受體激動劑[1-4]，具有顯著的鎮靜、鎮痛和抗焦慮作用。右美托咪定主要與中樞、外周和自主神經系統中G-蛋白偶聯的α2腎上腺素能受體相結合，尤其對α2A 和α2C 受體的親和力較高，并在全身各個器官以及血管中發揮作用[5]。與同樣作用于α2腎上腺素受體的可樂定相比，右美托咪定的鎮靜效果更強，且對患者的呼吸抑制更小[6]，從而被廣泛應用于臨床麻醉中。

近年來，利用臨床治療藥物來實施犯罪的案件日益增多，右美托咪定作為臨床上常用的一種藥物，與其他具有麻醉成分的藥物同時使用時可增強麻醉的特定效果，起到很好的協同作用，且該藥物不受管制，容易獲得，放入水或飲料中不易被察覺，因而常被用于藥物輔助犯罪（drug facilitated crimes，DFC），如麻醉搶劫、強奸、殺人等犯罪行為，因此亟需建立一種簡便快速的方法用于檢測血液中的右美托咪定，為其攝入提供客觀證據。目前已有的文獻[7-8]報道主要是對血漿中的右美托咪定進行檢測分析，分析方法包括GC-MS[9-10]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[11-12]、液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[13-15]。據報道[16]，采用超高效液相色譜-串聯質譜法（ultra performance liquid chromatography -tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）對血液中的右美托咪定進行檢測，其檢出限（limit of detection，LOD）可低至0.1 ng/mL，但樣品前處理采用的是固相萃取，較為復雜。因此，本研究旨在建立一種簡單的HPLC-MS/MS 方法用于分析血液中的右美托咪定，為相關案件中右美托咪定的檢驗提供有效的技術手段。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

API 4000 三重四極桿質譜（美國AB SCIEX 公司）聯合LC-20AD 液相色譜儀（日本島津公司），Milli-Q Advantage A10 超純水處理系統（美國Millipore 公司），JP-010T 超聲波清洗儀（深圳市潔盟清洗設備有限公司），XW-80A 渦旋混合器（上海醫大儀器有限公司），MiniSpin?迷你離心機（德國Eppendorf公司）。

右美托咪定標準品（中國食品藥品檢定研究院），氘代內標（internal standard，IS）地西泮-D5（美國Cerilliant 公司），乙腈、甲醇（美國Sigma-Aldrichgongs 公司），98%甲酸（優級純，美國Honeywell Fluka 公司），乙酸銨（色譜純，美國Honeywell Fluka 公司），去離子水由Milli-Q Advantage A10 超純水處理系統制備，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Allure PFP Propyl液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μm；美國Restek 公司），預柱為ZORBAX Extend-C18 保護柱（2.1 mm×12.5mm，5 μm，美國Agilent 公司），流動相為V（乙腈）∶V（20 mmol/L 乙酸銨、0.1%甲酸和5%乙腈）=70∶30；恒流洗脫9 min，流速0.25 mL/min，室溫，進樣量5 μL。

1.2.2 質譜條件

采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）、正離子模式進行離子化，多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式檢測；離子噴霧電壓5 500 V，碰撞氣7 lbf/in2（48.26 kPa），氣簾氣30 lbf/in2（206.84 kPa），霧化氣40 lbf/in2（275.79 kPa），輔助氣50 lbf/in2（344.74 kPa）；離子源溫度500 ℃。化合物參數見表1，選用兩對前級離子/產物離子對進行定性分析，其中一對離子對用于定量。

表1 右美托咪定和IS 的MRM 參數和保留時間Tab.1 MRM parameters and retention time of dexmedetomidine and IS

1.3 溶液配制

稱取右美托咪定對照品適量，用甲醇配制成1 mg/mL 的對照品溶液，隨后用甲醇逐級稀釋成質量濃度為100、20、5、1、0.1 μg/mL 的工作液。

取地西泮-D5標準品適量，加甲醇配制成1 mg/mL的對照品溶液，再用乙腈逐級稀釋成終質量濃度為40 ng/mL 的工作液。

1.4 血液樣品

經過肝素抗凝的空白血液來自健康志愿者，右美托咪定陽性血液樣本來自藥物輔助犯罪實際案例受害者。本研究已通過司法鑒定科學研究院倫理委員會審查，所有血液樣本的采集均有書面知情同意書。

1.5 樣品處理

取血液0.1 mL 置于2 mL 離心管中，加入0.9 mL含內標的乙腈溶液，超聲10 min，渦旋1 min，以離心半徑2 cm，12 000 r/min，離心3 min。取上清液過0.22 μm有機相微孔濾膜，進行LC-MS/MS 分析。

1.6 方法學驗證

根據國際方法驗證指南[17-18]進行驗證，考察該方法的選擇性、線性、LOD、定量限（limit of quantitation，LOQ）、準確度、精密度、基質效應、提取回收率和穩定性。

1.6.1 選擇性

通過分析來自10 個不同來源的空白血評估選擇性，考察全血中內源性物質以及IS 對目標物的分析是否存在干擾。

1.6.2 線性、LOD、LOQ

取空白血1 mL，加入右美托咪定對照品工作液，配制成0.2、0.5、2、10、50、200、800、1 000 ng/mL 全血樣品，按照1.5 節樣品處理方法進行處理和分析。以目標物與內標之間的峰面積比與目標物濃度構建校正曲線，用加權（權重系數W右美托咪定=1/x2，x表示濃度）最小二乘法進行回歸得到線性方程。LOD 為信噪比至少為3（S/N≥3）的濃度，LOQ 為信噪比至少為10（S/N≥10）、精密度（以相對標準偏差計，relative standard deviation，RSD）小于20%且準確度在參照值的80%～120%的濃度。

1.6.3 準確度和精密度

取空白血1 mL，加入右美托咪定對照品工作液，配制成0.5、2、50、800 ng/mL 全血樣品。從各個質量濃度點取100 μL 全血樣品，每個濃度6 份樣品，按照1.5 節樣品處理方法進行處理和分析，計算日內精密度和準確度，并連續4 d 重復實驗，計算日間精密度和準確度。

1.6.4 基質效應和提取回收率

在低（2 ng/mL）和高（800 ng/mL）兩個質量濃度制備3 組樣品，分別為提取前添加樣品（峰面積設為SA）、提取后添加樣品（峰面積設為SB）、對照品溶液（峰面積設為SC），重復6 次，基質效應=SB/SC×100%，提取回收率=SA/SB×100%。

1.6.5 穩定性

將提取處理后的高低兩個濃度點樣品在4 ℃的液相色譜儀自動進樣器中放置24 h 以評估處理后樣品的穩定性，每個濃度點做6 個重復樣品，并與當天新制備的質量控制樣品進行比較。

2 結果

2.1 儀器條件選擇

根據右美托咪定的化學結構特點，離子化方式采用正離子模式。對于質譜條件，在正離子模式下獲得最佳的前體離子和產物離子后，在MRM 模式下對右美托咪定和IS 的去簇電壓進行優化，然后對產物離子的碰撞能量進行優化，兩對離子對進行定性，響應強度大的離子對為定量離子對，質譜條件優化結果見表1。

2.2 方法學驗證

2.2.1 選擇性

分析10 份空白血液樣品后，血樣中的內源性物質未干擾右美托咪定的測定。

2.2.2 線性、LOD、LOQ

血液中右美托咪定在0.5～1 000 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好，線性方程為y=0.023 07x+0.000 22，相關系數（r）>0.99。LOD為0.2 ng/mL，LOQ為0.5 ng/mL，血液中LOQ 質量濃度添加樣品中右美托咪定和IS 的提取離子流色譜圖如圖1 所示。

圖1 右美托咪定和IS在LOQ濃度下的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of dexmedetomidine and IS at LOQ concentration

2.2.3 準確度和精密度

從表2 可見，右美托咪定的日內精密度和日間精密度分別為1.98%～4.48%、3.60%～9.34%，準確度為90.34%～112.67%，表明該方法精密度和準確度良好。

表2 右美托咪定精密度和準確度Tab.2 Precision and accuracy of dexmedetomidine（%）

2.2.4 基質效應和提取回收率

結果（表3）顯示，血液中右美托咪定在低和高兩個質量濃度點時的基質效應不明顯，均值為93.48%～101.11%。提取回收率為50.05%～91.08%。

表3 右美托咪定提取回收率、基質效應和穩定性Tab.3 Extraction recovery，matrix effect and stability of dexmedetomidine （%）

2.2.5 穩定性

結果（表3）顯示，提取處理后的右美托咪定樣品在4 ℃的自動進樣器中放置24 h 后穩定性良好。

2.3 案例應用

案例1：某市公安局接到2 名女性張某、劉某報警稱，段某（男）以邀請其到家吃飯為由，勸說張某、劉某喝“水”，一段時間后渾身無力，段某趁機圖謀不軌欲對其進行猥褻。警方在段某家中發現碗內殘留的無色液體，并提取了張某、劉某當天的血液和案件發生后第三天的血液和尿液。根據本研究建立的方法，對剩余的無色液體進行檢測，發現含有右美托咪定成分。對張某、劉某報案當天的血液進行檢測，同樣含有右美托咪定成分，質量濃度分別為5.1、4.6 ng/mL，色譜圖見圖2。對張某、劉某案發后第三天的血液和尿液進行檢測，未檢出右美托咪定成分。

圖2 案例1 血樣中右美托咪定的色譜圖Fig.2 Chromatograms of dexmedetomidine in the blood samples of case 1

案例2：某市公安局接到秦某（女）報警稱，其在KTV 吃了胡某（男）給的口香糖后出現意識模糊，隨后遭到胡某性侵。警方收繳了胡某所攜帶的口香糖、藍色藥片、外包裝為棕褐色安瓿瓶內的無色液體以及外包裝為標有“床前明月光”字樣玻璃瓶內的無色液體。采用本研究方法對口香糖、藍色藥片和2 種無色液體成分進行檢測，發現口香糖和外包裝為標有“床前明月光”字樣玻璃瓶的無色液體中均含有右美托咪定成分。參照本實驗室已有方法[19]進行檢測，發現藍色藥片中含有三唑侖成分，外包裝為棕褐色安瓿瓶的無色液體中含有亞達唑散成分。

3 討論

3.1 前處理條件選擇

血液樣品常采用的處理方法主要包括液液萃取、固相萃取和蛋白質沉淀法，液液萃取和固相萃取均具有樣品富集與凈化的功能，因此可在一定程度上提高檢測靈敏度，如王瑞花等[16]采取固相萃取的方法對血液中的右美托咪定進行檢測，LOD 低至0.1 ng/mL，但液液萃取和固相萃取操作復雜、費時，成本也較高。而蛋白質沉淀法操作簡單，無需特殊裝置便可進行。因此本研究采用簡單快速的蛋白質沉淀法對0.1 mL血液樣品進行處理，LOD 為0.2 ng/mL，與王瑞花等[16]報道的LOD 相近，LOQ 為0.5 ng/mL，可滿足法醫學鑒定實踐和臨床檢測的要求。

3.2 案例回顧

近年來，右美托咪定因其優良的輔助麻醉效果而在臨床實踐中應用廣泛，但也常常被不法分子作為作案的輔助工具。正如本研究中案例1 所示，由于右美托咪定本身無色無味，因此被放入水或飲料中也不易被察覺。此外，右美托咪定被用于非法目的時一般不會單獨使用，常常結合其他具有鎮靜、催眠或麻醉效果的藥物同時使用，如本文案例2 中的三唑侖以及其他文獻所報道的東莨菪堿[16]，這些物質與右美托咪定合用時具有較好的協同作用，而案例2 中的亞達唑散是一種選擇性高的α2受體阻斷藥，可以很好地阻斷右美托咪定的α2腎上腺素受體激動劑作用，有時會被犯罪分子隨身攜帶作為“解藥”，因此在檢測右美托咪定的同時需要注意排查是否伴有其他物質的可能性。

本研究建立了HPLC-MS/MS 法檢測血液中的右美托咪定，該方法前處理簡單，選擇性好，靈敏度較高，適用于藥物輔助犯罪案件的分析檢測。