毛發(fā)分析前沿——頭發(fā)微樣技術研究進展

沈 敏，嚴 慧，徐多麒，紀佼佼

（司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺司法部司法鑒定重點實驗室，上海200063）

探尋具有科學屬性、豐富信息和高證據(jù)價值的生物基質(zhì)是法醫(yī)毒物學領域的重要研究方向之一。毒（藥）物在毛干中的保留屬性賦予毛發(fā)基質(zhì)具有目標物穩(wěn)定、檢出時限長、可反映長程攝毒（藥）史的特征，奠定了毛發(fā)分析在法醫(yī)毒物學以及臨床毒物學、興奮劑檢測等領域的重要證據(jù)地位和應用價值[1-3]。 2016 年，ARMITAGE 等[4]在《科學》（Science）期刊上充分肯定了頭發(fā)的證據(jù)價值和研究價值，認為“盡管頭發(fā)的應用曾經(jīng)存在爭議，但現(xiàn)代精細分析技術將賦予頭發(fā)在法醫(yī)學領域的新作用，通過頭發(fā)可以推斷犯罪嫌疑人或受害者的個體特征甚至行為信息”。 同期，基于單根頭發(fā)微樣技術的研究逐漸呈現(xiàn)[5-10]，其對于精準表征毒（藥）物在毛干中的空間分布特征，精準定位毛干中毒（藥）物的濃度高峰位置，提升頭發(fā)分析對于攝毒時間和攝毒模式判斷的準確性，具有重要的理論意義和應用價值。

1 頭發(fā)微樣技術及其證據(jù)意義

1.1 頭發(fā)分析及其影響因素

頭發(fā)分析的應用領域及證據(jù)價值隨著學界研究的深入而不斷得到拓展和提升。 在司法實踐中，頭發(fā)分析除主要應用于攝毒鑒定、攝毒（藥）史判斷等案（事）件的處置外，也為藥物輔助犯罪（drug-facilitated crime，DFC）如性侵犯、麻醉搶劫和詐騙等案件的偵破提供案發(fā)時段是否攝毒（藥）的證據(jù)。 顯然，上述頭發(fā)分析證據(jù)對于攝毒模式（長期攝毒、單次攝毒）的判斷基于時間要素，即是否在某特定時段攝入過毒（藥）物，或是否在某一時間周期內(nèi)多次濫用毒品？ 然而，目前傳統(tǒng)的頭發(fā)束發(fā)分段分析對于攝毒時間和攝毒模式的估計仍處于較大的誤差水平[7-9]。 如公安部制定的《涉毒人員毛發(fā)樣本檢驗規(guī)范》（公禁毒〔2018〕938 號，以下簡稱《規(guī)范》）所述，“發(fā)根端3 厘米以內(nèi)的頭發(fā)樣本檢測結果為陽性的，表明被檢測人員在頭發(fā)樣本提取之日前6 個月以內(nèi)攝入過毒品”。 可見，《規(guī)范》為確保現(xiàn)行頭發(fā)分析結果證據(jù)的可應用性且不至于形成誤判，將近3 個月生長的頭發(fā)（頭發(fā)生長速度理論值約為1cm/月）所提供的時間信息擴展了近1 倍，或者說攝毒時間的分辨率達數(shù)月的誤差水平。 顯而易見，頭發(fā)束發(fā)分析對于攝毒模式和攝毒時間的估計尚存在精細度不夠、準確性不足的缺陷，其應用范圍和證明能力因而受到制約。

毒（藥）物在毛干中的保留位置是其攝入時間推斷的基礎。通常認為毒（藥）物經(jīng)血液循環(huán)主動或被動地擴散至毛乳頭細胞，在形成毛髓質(zhì)、毛皮質(zhì)的過程中與其結合并保留于毛干中，隨著頭發(fā)的生長由發(fā)根向發(fā)梢有規(guī)律的位移。縱觀頭發(fā)束發(fā)分析的原理和實踐，可以認為導致時間分辨誤差問題的關鍵是：頭發(fā)束發(fā)分析方法的原理、技術以及所提供的結果信息均是相對間接、綜合和粗略的。 即對由多根頭發(fā)組成的束發(fā)片段進行分析，根據(jù)毒物在一束毛干上的疊加濃度高峰位置來提供時間信息的方法，不能準確、精細和真實地顯示毒物在單根毛干上的分布情況。

頭發(fā)束發(fā)分段分析會受到以下因素的影響（圖1）：（1）生長周期。 頭發(fā)的生長呈現(xiàn)出周期性，分為生長期、退行期和休止期。 通常頭部毛發(fā)大約有80%處于生長期，20%處于退行期或休止期。 由于所采的束發(fā)中頭發(fā)處于不同的生長周期，處于生長期的頭發(fā)中毒（藥）物隨毛干生長由發(fā)根向發(fā)梢位移，而處于休止期的頭發(fā)中毒（藥）物仍停留于毛干的原位或滯后位移， 故束發(fā)的片段分析所提供的是非一致的疊加信息。 （2）結合機制。 理論上認為毒（藥）物進入毛干存在多種渠道，既有通過血液循環(huán)進入毛乳頭細胞，在毛干形成過程中與其結合的主渠道，也存在從汗液、皮脂腺等分泌進入毛干或外部污染附著于毛干的次渠道。 而束發(fā)所導致的非一致疊加同樣不能有效識別、排除次渠道的干擾信息。（3）采樣誤差。頭部表面有一定的弧度，貼頭皮剪取一束頭發(fā)的采樣方式可能存在所采發(fā)束中各毛干根部與頭皮間距離不一致的誤差。 （4）分段長度。 以厘米為單位的毛發(fā)片段分析不能有效捕捉和分辨毛干中毒（藥）物的濃度高峰位置。 上述因素均可能導致頭發(fā)中毒（藥）物濃度高峰分布存在一定的擴散，由此與攝毒時間的對應上存在較大偏差或較為模糊。 由此可見，現(xiàn)行頭發(fā)束發(fā)分段分析僅能提供藥物的暴露信息，而在攝毒模式以及攝毒時間的評估方面證明能力有限。

圖1 頭發(fā)束發(fā)分段分析干擾因素示意圖

1.2 頭發(fā)微樣技術及其信息特點

基于司法鑒定實踐中的科學證據(jù)需求以及傳統(tǒng)頭發(fā)束發(fā)分析中存在的缺陷，早在2011年學者們[5，11-12]就開始探索使用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption ionization-mass spectrometry，MALDI-MS）研究單根頭發(fā)中甲基苯丙胺、可卡因、氯胺酮等在頭發(fā)中的分布情況。 然而由于該技術平臺的靈敏度、分辨率尚不能完全滿足單根頭發(fā)中痕量外源性物質(zhì)的檢測要求，故突破性進展緩慢。2016 年，KUWAYAMA 等[6]提出采用單根頭發(fā)的微樣技術，即建立以0.4 mm（約等于頭發(fā)日生長長度）為單位的單根頭發(fā)微分段分析技術，從相對微觀角度精準考察單根毛干中外源性毒（藥）物的濃度高峰位置，以期獲得更高的時間分辨率。 此后，以單根頭發(fā)毫米或亞毫米分段（頭發(fā)段重量為微克級）的微樣技術又被稱為頭發(fā)微分段分析（micro-segmantal analysis，MSA），其研究團隊和研究報道也逐漸增多[13-21]。頭發(fā)微分段分析可以較為精準地反映單根頭發(fā)中外源性物質(zhì)的分布情況，并為研究毒（藥）物進入頭發(fā)的機制提供特有的信息。但由于所采集的研究對象（單根頭發(fā)）可能涉及某些不確定因素的影響（如頭發(fā)處于非正常生長期等），故大部分學者認為，MSA 分析至少應同步采集、分析5~10 根頭發(fā)。

MSA 通常采用頭發(fā)全發(fā)（帶毛囊）樣品。單根頭發(fā)以毫米或亞毫米的間隔分段，然后對每段頭發(fā)微樣分別進行處理、分析，以此獲得毒（藥）物在單根頭發(fā)中的濃度分布信息。 其中，對單根頭發(fā)進行精準微分段是實現(xiàn)對亞毫米長度頭發(fā)中痕量毒（藥）物定量分析的前提。 頭發(fā)微分段過程包括頭發(fā)樣本固定、長度測定、頭發(fā)切割等環(huán)節(jié)，主要有手動切割法[18-19]以及改良的組織切片機切割法[5，6，13]。 手動切割法通常采用精度為0.4 mm 的定制膠帶對單根頭發(fā)進行測量與固定，并在臺式放大鏡下用手術刀片完成對單根頭發(fā)的切割（圖2）。 用精度為0.01 mm 的電子微分尺對所切割頭發(fā)段進行測量驗證，結果表明，頭發(fā)段長度為（0.4±0.02）mm（n=50）時，誤差在可接受的范圍內(nèi)[18]。 設備切割法則多采用經(jīng)改良的組織切片機以0.4mm 間隔切割頭發(fā)，其長度為（0.403±0.00419）mm（平均值±標準偏差，n=15）[9]。 盡管兩者的操作方法不同，但均取得了較為理想的精度。

圖2 單根頭發(fā)0.4 mm 分段切割法

2 頭發(fā)微樣技術的應用研究

用涉及法醫(yī)毒物學的多個數(shù)據(jù)庫進行“microsegmantal analysisi，MSA”相關研究的搜索，目前研究報道主要集中于日本警察科學研究所團隊、中國司法鑒定科學研究院團隊、日本大阪市警察總部法科學實驗室團隊，以及德國慕尼黑法醫(yī)毒理學中心團隊。 研究內(nèi)容涉及頭發(fā)MSA 方法學研究、 攝毒攝藥時間評估研究、毒（藥）物在單根頭發(fā)中的分布研究、毒（藥）物進入頭發(fā)機制研究、毛根中毒（藥）物動力學研究等。

2.1 頭發(fā)MSA 方法學研究

檢測方法的高靈敏度是實現(xiàn)毛發(fā)微樣技術研究的必要條件。 隨著液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術的發(fā)展，為基于頭發(fā)MSA 的應用研究提供了可能。 目前，文獻報道的頭發(fā)MSA 方法包括建立基于LC-MS/MS 技術平臺單一或多種目標物的分析方法，涉及的目標物有苯海拉明、氯苯那敏、去甲基氯苯那敏、非索非那定、雙氫可待因、麻黃堿、甲基麻黃堿、依匹斯汀、利多卡因、唑吡坦、甲氧基苯胺、艾司唑侖、西替利嗪、氯雷他定、咪達唑侖等[6-7，9，13，18，20-21]，所建方法主要用于所涉目標物的攝毒時間、毛發(fā)結合機制等應用研究，故通常以靈敏度為優(yōu)先考慮因素，檢出限為pg/mg 或fg/mm 水平。 由于MSA 方法中單根頭發(fā)片段質(zhì)量較小，因此研究者大多選擇以“濃度/長度”或“濃度/段”作為量值單位。

頭發(fā)MSA 方法學研究還涉及一定目標物范圍的篩選分析。 德國WIEDFELD 團隊[19]建立了基于LC-MS/MS 技術分析單根頭發(fā)2 mm 片段中156 種毒（藥）物的方法，該方法檢測的156 種目標物中，有140 種（約90%）目標物的定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）≤1.25 pg/段，40 種（約26%）目標物的LLOQ≤0.125 pg/段。 并且，除氯甲噻唑在低質(zhì)量控制水平下精密度較差（24.7%）外，其他所有目標物測定的精密度均滿足要求。 將該方法應用于15 例單次給藥案例，對藥后1 個月至2 個月采集的毛發(fā)（每例采集10 根頭發(fā)）進行分析，結果表明，90%的目標物的LLOQ≤1.25 pg/段，準確度較好。 在上述案例中可以檢測到多種物質(zhì)，然而苯二氮類藥物的檢測仍然具有挑戰(zhàn)性。 筆者所在研究團隊[22]建立了基于單根頭發(fā)0.4 mm 片段中42 種精神活性物質(zhì)的LC-MS/MS 分析方法。 單根頭發(fā)微分段中42 種精神活性物質(zhì)在各自線性范圍內(nèi)線性關系良好（相關系數(shù)r>0.99），檢出限為0.2~10 pg/mg，定量限為0.5~20 pg/mg，日內(nèi)、日間精密度為1.5%~12.7%，日內(nèi)、日間準確度為86.5%~109.2%，提取回收率為68.1%~98.2%，基質(zhì)效應為71.3%~111.7%。將該方法應用于志愿者單次服用唑吡坦28 d 后采集的頭發(fā)樣本的0.4 mm 分段分析，5 根頭發(fā)中唑吡坦的陽性區(qū)域位于S28~S40（近根端1.08~1.60 cm），濃度范圍為0.62~20.5 pg/mm，結果顯示，頭發(fā)MSA技術可應用于藥物輔助犯罪案件的調(diào)查。

對于頭發(fā)MSA 技術，人們關注的焦點是方法的靈敏度和檢出能力。 筆者認為，基于MSA 技術的單一或多目標物的頭發(fā)分析在檢出能力方面具有雙重性，一方面由于頭發(fā)樣品的微量導致檢出限值升高，檢出能力下降；另一方面由于更為精細的微分段可以減少陽性頭發(fā)片段中空白頭發(fā)基質(zhì)對目標物的稀釋作用，并降低頭發(fā)引起的基質(zhì)效應，從而提高檢出能力。 隨著色譜-質(zhì)譜分析技術的發(fā)展，頭發(fā)MSA 的優(yōu)勢將更為突顯。 對于頭發(fā)MSA 的篩選分析，方法優(yōu)化總是基于分析靈敏度、目標物數(shù)量、時間分辨率（片段長度）三個因素間的平衡，而方法應用則要關注檢出限值較高、頭發(fā)中含量較低的目標物的可檢出性。

2.2 攝毒攝藥時間評估研究

頭發(fā)MSA 的最大優(yōu)勢特點是通過精細的微分段精準識別外源性物質(zhì)在單根毛干中的峰值位置，從而有可能在日水平上評估攝毒攝藥時間及模式，為各類案（事）件的偵破、處置提供重要線索和依據(jù)。 如涉藥相關的非正常死亡案件中估計死者的死亡時間，藥物濫用相關案件中明確濫用者的濫用方式，藥物輔助犯罪案件中提供受害人的攝藥時間信息，以及通過毛干中毒（藥）物的分布特征區(qū)分單次攝藥的受害者和多次反復攝毒的濫用者等，進而為案件提供支持證據(jù)。

KUWAYAMA 等[9]設計了一種可測量被分析頭發(fā)實際生長速度的攝藥模型。 為準確估計目標藥物的攝入天數(shù)，受試者先服用苯海拉明（目標藥物），然后以一定的時間間隔服用兩次氯苯那敏（時間標記物）。 根據(jù)頭發(fā)中兩次時間標記物的濃度高峰所在位置及相應的攝藥時間來計算頭發(fā)的生長速度， 再根據(jù)目標藥物與時間標記物峰值之間的距離和頭發(fā)的生長速度來計算目標藥物的攝入時間。 通過對甲基麻黃堿、撲爾敏、依匹斯汀、雙氫可待因和非索非那丁5 種時間標志物進行比較研究并評估該模型的準確性[8]，認為合適的時間標記物可使攝藥時間估計誤差減小至2 d 以內(nèi)，但當時間標記物與目標藥物分布類型不同時，攝藥時間推斷可產(chǎn)生約為10 d 的誤差。

本研究團隊以藥物輔助犯罪案件中經(jīng)常涉及的艾司唑侖為目標物，構建了兩種基于頭發(fā)MSA技術的攝藥時間推斷模型[20]。其中：時間標志物推斷模型采用志愿者以一定的時間間隔兩次攝藥后采集頭發(fā)，按照頭發(fā)生長速度和毛干目標藥物峰值間距離計算攝藥時間（圖3）；時間間隔推斷模型采用志愿者攝藥后以一定的時間間隔兩次采集頭發(fā)，根據(jù)兩次取樣時間間隔（ΔT）與兩次采集頭發(fā)樣品中形成的目標藥物高峰位置移動距離（ΔS）計算個體頭發(fā)生長速度，然后按照圖4 中所示公式計算攝藥時間。 本研究團隊對所建立的兩種推斷模型從方法準確度及適用性方面進行比較分析，采用時間標志物推斷模型進行時間推斷的誤差平均為4.3 d，采用時間間隔推斷模型進行時間推斷的誤差平均為7.4 d。筆者認為，該兩種攝藥時間推斷模型的差異在于時間標志物模型所用的是所測頭發(fā)的實際生長速度，而時間間隔模型估計的頭發(fā)生長速度并非所測頭發(fā)的實際生長速度，這可能是該兩種時間推斷模型誤差存在差異的主要原因。

圖3 時間標志物推斷模型

圖4 時間間隔推斷模型

頭發(fā)MSA 也用于估計死亡日期。 某非正常死亡尸體經(jīng)背景調(diào)查死者生前曾有使用利多卡因的醫(yī)療記錄，使用時間為發(fā)現(xiàn)尸體前57 d。 KUWAYAMA等[13]以利多卡因作為自然的內(nèi)部時間標志物，根據(jù)利多卡因的使用時間以及單根毛干中利多卡因的濃度峰值位置估計死亡日期。 研究者認為，與傳統(tǒng)的法醫(yī)病理學尸體檢查不同，頭發(fā)MSA 有可能將死亡時間范圍縮小至死亡日期。 本研究團隊探索聯(lián)合使用基于LC-MS/MS 的MSA 技術和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像（matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry imaging， MALDI-MSI）技術，以提高攝藥時間估計的分辨率。 然而，受MALDI-MSI 分辨率的限制，想要獲得更高、更精確的時間分辨率仍較為困難。 此外，頭發(fā)中毒（藥）物可隨著頭發(fā)的生長而擴散和重新分布[23]，由此也影響了攝入時間估計的時間分辨率。 正如POETZSCH等[24]的研究也表明，無論采用何種方法，頭發(fā)分析的時間分辨率都是數(shù)天的范圍，而不能精確到確定的某一天。

筆者認為，基于頭發(fā)MSA 估計攝毒攝藥時間仍處于研究階段，實踐中往往會存在一定的誤差，尤其應關注以下因素的影響：（1）頭發(fā)采集應采用拔取方式，全發(fā)（毛根和毛干）的長度測量和MSA有利于精準估計攝藥時間。 （2）根據(jù)頭發(fā)的生長周期，采集選中靜止期和休止期的頭發(fā)將存在一定的概率，故MSA 必須獨立分析至少5 根或更多根頭發(fā)來保證結果的可重復性。 （3）即使在相同的頭部區(qū)域收集的頭發(fā)其生長速度可能也存在差異，對此時間估計模型應盡可能獲取所測單根頭發(fā)的實際生長速度。 此外，用內(nèi)部時間標記測算，研究團隊所得志愿者的頭發(fā)生長速度約為0.49~0.51 mm/d，KUWAYAMA 等[9]報道研究對象的頭發(fā)生長速度平均值為（0.45±0.05）mm/d，即約1.4 cm/月。 隨著頭發(fā)分析研究的深化，有必要對頭發(fā)分析的基本理論假設（1 cm/月）或相關規(guī)定作出修正。

2.3 毒（藥）物在單根毛發(fā)中的分布研究

單根頭發(fā)MSA 可以較高分辨率描述毒（藥）物在單根頭發(fā)中的分布特征，包括從發(fā)根至毒（藥）物濃度峰值的距離和毒（藥）物陽性區(qū)域的峰形，以及在頭部不同區(qū)域、不同頭發(fā)間分布的一致性，提供常規(guī)束發(fā)分段分析不能提供的精細信息。

2.3.1 不同區(qū)域頭發(fā)中毒（藥）物的分布研究

外源性毒（藥）物在頭部不同區(qū)域頭發(fā)中的分布是否存在差異，是否對攝藥模式和攝藥時間估計的準確性產(chǎn)生影響，是毛發(fā)分析領域需要關注的問題。 本研究團隊通過對人體頭部不同區(qū)域（枕部、左顳部、右顳部和頂部）的單根頭發(fā)進行分析，以考察外源性毒（藥）物在不同區(qū)域內(nèi)頭發(fā)的分布情況以及同一區(qū)域內(nèi)不同單根頭發(fā)間分布的一致性。 三名志愿者單次攝取唑吡坦28 d 后分別在每一個體頭部的四個部位采集5 根頭發(fā)，結果顯示，在枕部和右顳部采集的15 根頭發(fā)均檢出唑吡坦，而左顳部和頂部分別有兩根和一根頭發(fā)呈陰性結果。 對同一部位采集的頭發(fā)濃度及峰濃度位置的相對標準偏差計算結果顯示，枕部采集的頭發(fā)偏差值較小，其濃度峰值位置以及峰形分布一致性較好。圖5 顯示某志愿者攝藥后唑吡坦在頭部四個區(qū)域頭發(fā)中的分布情況。 研究結果表明，枕部頭發(fā)生長速度變異性較小且處于生長期的頭發(fā)數(shù)量較多，更適合作為頭發(fā)的采樣部位。 盡管國際毛發(fā)分析協(xié)會已將枕部作為頭發(fā)分析推薦的采樣部位[25]，然而基于束發(fā)分析的數(shù)據(jù)其支撐能力尚有不足，而通過單根頭發(fā)的微分段分析可以更好地反映外源性毒（藥）物在不同部位頭發(fā)間分布的一致性。

圖5 唑吡坦在頭部不同區(qū)域頭發(fā)中的分布情況

2.3.2 頭發(fā)中毒（藥）物的進入和保留機制研究

人體攝入毒（藥）物后短時間內(nèi)在單根頭發(fā)中的濃度-時間分布是揭示毒（藥）物進入頭發(fā)機制的關鍵[21]。 幾乎所有的MSA 研究團隊[6，9，20-21，25]在考察單次攝藥后目標物在毛干中的分布時都觀察到了目標物濃度的雙峰現(xiàn)象（圖6，S1、S2分別表示濃度高峰和濃度次高峰）。筆者研究團隊的XU 等[20]考察了4 名志愿者單劑量攝入艾司唑侖12h、36 h、60 h、13 d、28 d 后目標物在單根毛干上的分布情況。研究發(fā)現(xiàn)，攝藥后12~60 h 內(nèi)，在單根頭發(fā)上呈現(xiàn)兩個艾司唑侖濃度峰。其中，高峰位于毛根部的0~0.8 mm，次高峰位于毛根和毛干的交界處（1.6~2.8 mm），兩個濃度峰值存在明顯的差異。 攝藥后13 d，頭發(fā)中艾司唑侖濃度高峰區(qū)帶從發(fā)根端向發(fā)梢端移動，分布于根部9.6~12.8 mm 內(nèi)，且在根部4 mm 頭發(fā)段內(nèi)未檢出艾司唑侖，表明藥物陽性區(qū)帶已由毛根移至毛干。 同時，目標物艾司唑侖的濃度雙峰現(xiàn)象也被邊界不清晰且寬度約為10 mm 的陽性區(qū)帶所取代。本研究團隊的另一項唑吡坦單劑量攝藥模型獲得了類似的毛干目標物分布結果。

圖6 單次攝藥后目標物在單根毛發(fā)中的分布

本研究團隊認為目標物濃度的雙峰現(xiàn)象揭示了毒（藥）物進入頭發(fā)的途徑。 入體的毒（藥）物可通過兩種途徑進入頭發(fā)：一是通過血液循環(huán)進入毛囊后被毛基質(zhì)細胞吸收，在頭發(fā)毛干分布圖上表現(xiàn)為近根端的濃度高峰；二是通過汗腺和皮脂腺分泌浸潤至真皮區(qū)域的毛干，在頭發(fā)毛干分布圖上表現(xiàn)為遠根端的濃度小峰。 雙峰在毛干中的距離與發(fā)根端到頭皮的距離一致，而兩者的濃度值則反映了這兩種途徑對于毛干中目標物的貢獻度。 然而，KUWAYAMA 等[7]的另一項研究顛覆了血液循環(huán)是所有毒（藥）物進入毛干主要途徑的普遍認知。 該研究者用微分段法研究了同時攝入的7 種藥物在單根頭發(fā)中的分布，觀察到7 種藥物的濃度-毛干分布特征呈現(xiàn)兩種類型，其中依匹斯汀、非索非那定、氯苯那敏、去甲基氯苯那敏和雙氫可待因在單根毛干上呈現(xiàn)一大一小的雙峰分布，而甲基麻黃堿和麻黃堿在毛干上僅呈現(xiàn)一個主峰，且位于偏遠端與真皮層進入途徑相匹配的位置。這一發(fā)現(xiàn)表明，毒（藥）物進入頭發(fā)的機制和途徑可能取決于其結構和性質(zhì)， 親脂性化合物主要通過血液循環(huán)進入毛根， 而極性化合物則可能主要通過汗腺/皮脂腺途徑而非血液途徑。 目前，毒（藥）物在毛干上的分布特征與其化學性質(zhì)之間的關系尚未完全闡明，很難確定特定目標物進入頭發(fā)的主要途徑。 未來需要積累更多的毒（藥）物的分布特征數(shù)據(jù)，從而闡明毒（藥）物進入頭發(fā)的一般機制和規(guī)律。

KAMATA等[26]為了研究藥物進入頭發(fā)的機制，以甲氧那明為目標物，將志愿者的單根頭發(fā)毛軸縱向切片，用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-tandem mass spectrometry，MALDI-TOF-MS/MS）進行成像，以驗證單根頭發(fā)微分段的LC-MS/MS分布分析結果。 成像結果顯示，藥物攝入后首先大量集中于毛囊，僅有少量進入頭發(fā)基質(zhì)，形成2~3 mm的獨特藥物帶，同時觀察到部分藥物進入到真皮上部的角質(zhì)化毛干中，形成另一個約2mm的藥物帶，兩個藥物帶均隨著頭發(fā)的生長向發(fā)梢端移動。 MALDITOF-MS/MS的結果發(fā)現(xiàn)與LC-MS/MS分析結果一致。

上述所有研究結果提供了入體的毒（藥）物進入頭發(fā)存在兩個途徑、兩個微區(qū)域的直接和直觀的證據(jù)。 然而這兩種途徑會導致毛干中目標物的陽性帶重疊，從而影響攝藥時間判斷的分辨率。 在評估頭發(fā)分析結果時應考慮到這些因素。

2.3.3 頭發(fā)中毒（藥）物的來源判斷研究

頭發(fā)分析結果評判時需要關注的一個重要問題是所檢陽性結果系藥物攝入還是外部污染?對此通常采用頭發(fā)的去污染處理和分析目標物的特征代謝物加以鑒別。 然而在某些條件下，目標物的體內(nèi)代謝產(chǎn)物與體外分解物相同時，如可卡因可以轉化為苯甲酰愛康寧、海洛因可能轉化為嗎啡等，或當使用劑量較低致頭發(fā)樣品中缺乏可測量的代謝物時，往往難以判斷目標物的來源。 頭發(fā)MSA 技術雖然僅能給出毛干縱向目標物的分布而無法給出毛干徑向的目標物分布信息，但KUWAYAMA 等[27]認為，根據(jù)頭發(fā)MSA 所得的目標物濃度峰分布特征，可判斷頭發(fā)是否存在陽性目標物的外源性污染。

與MSA 技術不同，MALDI-MSI 技術可給出目標物在單根頭發(fā)中空間分布的可視化信息，有可能進一步區(qū)分陽性目標物系藥物攝入還是外部污染。本研究團隊研究了采用MALDI-MSI技術判斷頭發(fā)中陽性目標物來源的可行性。 以DFSA案件唑吡坦陽性頭發(fā)和唑吡坦溶液浸泡的頭發(fā)為研究對象， 單根頭發(fā)分別經(jīng)縱向切割后用優(yōu)化建立的MALDI-MSI方法進行原位成像分析。 圖7顯示了唑吡坦陽性頭發(fā)和唑吡坦浸泡頭發(fā)樣本中唑吡坦（m/z 308.17578，[M+H]+）的MS圖像和MS與光學重疊圖像，結果表明，唑吡坦陽性頭發(fā)中目標物分布于毛干內(nèi)部的髓質(zhì)和皮質(zhì)層，而唑吡坦溶液浸泡頭發(fā)中目標物則主要分布于毛干表皮層，兩者存在顯著差異，該結果經(jīng)多根頭發(fā)驗證，一致性良好。通過進一步考察唑吡坦浸泡頭發(fā)經(jīng)常規(guī)去污清洗后目標物的分布情況， 發(fā)現(xiàn)目標藥物量雖有所減少但仍存在于毛干兩側。STOUT等[28]曾以小鼠為模型進行結合機制研究，發(fā)現(xiàn)熒光素和羅丹明在毛發(fā)中的沉積與外部污染明顯不同。 與浸泡毛發(fā)時觀察到的藥物與角質(zhì)層結合相比，體內(nèi)沉積主要發(fā)生在髓質(zhì)和皮質(zhì)層。 上述研究表明，MALDIMSI技術可反映毛發(fā)中毒（藥）物的空間分布，為區(qū)分毒（藥）物攝入和外部污染，也為探究毒（藥）物在毛發(fā)中的進入與結合機制提供可視化的支持。

圖7 唑吡坦陽性頭發(fā)和唑吡坦浸泡頭發(fā)樣本中（m/z 308.17578，[M+H]+）MS 圖像和MS 與光學重疊圖像

2.3.4 毛根中毒（藥）物的動力學研究

既往的分布研究多集中于頭發(fā)的毛干部位，而對于毒（藥）物進入毛干的源部位（毛根）則少有觸及。 本研究團隊曾以豚鼠為實驗模型，同步進行毛根與血液的毒物動力學研究，建立毛根、毛干和血液中毒物分布的關聯(lián)[29-31]。在前期研究基礎上，該團隊進一步利用MSA 技術考察4 名單次攝藥（艾司唑侖1 mg）志愿者單根頭發(fā)根部5 mm 頭發(fā)段內(nèi)艾司唑侖的分布及其動力學模式。 研究結果顯示，攝藥30 min 后在毛根中檢出艾司唑侖，毛根中的艾司唑侖在1.92~4.8h（平均4h，n=24）區(qū)間內(nèi)達到濃度高峰（Tmax）（圖8）。艾司唑侖在受試者毛根和血液中的濃度-時間曲線相似，表明外源性物質(zhì)在毛根中的濃度與血液中的濃度具有關聯(lián)性。這與普遍認為的外源性物質(zhì)經(jīng)過血液循環(huán)進入頭發(fā)的認知相一致。

圖8 單次攝藥后4 名受試者毛根中艾司唑侖濃度-時間分布曲線（n=6）

本團隊研究結果同時顯示，攝入艾司唑侖后毛根中藥物半衰期平均為3.6 d（n=24）且在毛根中的檢測時限可達14 d。GUSTAVSON 等[32]對17 例健康男性受試者進行的艾司唑侖血液藥代動力學研究發(fā)現(xiàn)，單劑量（1 mg）攝入艾司唑侖后，血液中的艾司唑侖平均半衰期為14 h。 劉岳等[33]對24 名中國健康受試者進行的藥代動力學研究發(fā)現(xiàn)，單劑量（1 mg）攝入艾司唑侖后血液中艾司唑侖的平均半衰期為21~23 h。 顯然，毛根中艾司唑侖的代謝半衰期以及檢出時限明顯長于血液。 筆者認為，通過不斷對毛根蘊含的潛在信息的挖掘，毛根有可能作為血液的補充檢材用于提供急性中毒的信息，尤其在血液缺失（如腐敗等）或毒物消除（如延緩死亡）的情形下，毛根可提供有價值的即時毒物暴露信息。

KUWAYAMA 等[34]為評估溺水尸體頭發(fā)中測量藥物分布的可能性，使用MSA 技術研究各種水溶液條件下頭發(fā)樣品中藥物的穩(wěn)定性。 結果在不含二價離子（Ca2+和Mg2+）的溶液中，隨著鹽濃度和浸泡時間的增加，頭發(fā)中的藥物含量減少了約5%；而在含有二價離子的溶液中，藥物含量的降低可忽略不計，即二價離子阻止了頭發(fā)中藥物的損失。 由于天然河流和海水中含有二價離子，故其認為利用MSA研究藥物分布也可應用于溺死尸體的毛發(fā)。

3 頭發(fā)微樣技術的局限性和應用前景

頭發(fā)MSA 的方法策略和技術發(fā)展極大地拓展了毛發(fā)分析的證據(jù)能力和應用價值。 在理論層面，通過精細表征毒（藥）物在毛干中的分布特征，以新的視角探析毛發(fā)中毒（藥）物的進入和保留機制。 在實踐層面，通過精準定位毛干中毒（藥）物的濃度高峰位，保障毛發(fā)分析對于攝毒時間和攝毒模式判斷的可靠性和精準性，從而提升毛發(fā)分析的證據(jù)地位和應用價值。然而，頭發(fā)MSA 作為一種新技術，仍存在適用范圍受限、方法局限性以及技術改進等問題。

頭發(fā)微分段的機械化和自動化。 目前無論是采用機器切割法還是手動切割法，頭發(fā)的毫米或亞毫米的分割以及后續(xù)轉移至提取管的操作仍是一個復雜、繁瑣、費時的過程。KUWAYAMA 等[35]曾嘗試用電動微操作器收取0.4mm 頭發(fā)片段并將其轉移到提取管，然而卻比手動操作花費了更多的時間。 此外，進一步提高頭發(fā)分割的空間分辨率仍值得繼續(xù)探索。盡管頭發(fā)的縱向更細微的分段價值不大，但徑向分割或三維分割有助于研究外源性物質(zhì)的進入和結合機制，提供外源性物質(zhì)是通過血循環(huán)或是通過汗液和皮脂腺滲透進入毛發(fā)基質(zhì)之間差異的更詳細信息。

謹慎解釋MSA 分析結果。由于每根頭發(fā)基質(zhì)細胞的活性不同、所處生長階段不同，故無論不同個體還是同一個體同一頭部區(qū)域的單根頭發(fā)間的毒藥物分布特征都可能存在一定的差異。 若兩根頭發(fā)間毒藥物的分布模式顯著不同，則可能該兩根頭發(fā)處于生長周期的不同階段，故MSA 法必須通過獨立分析兩根或兩根以上的頭發(fā)獲得相似的分布結果才能進行確認。由于兩根頭發(fā)分析結果的匹配概率較低，大部分研究者認同MSA 法應收集5 根頭發(fā)。 其次，要評估單根頭發(fā)毒藥物分布特征可能受到頭發(fā)長期暴露以及洗滌、陽光、染發(fā)、燙發(fā)等自然和非自然因素的影響，謹慎解釋長發(fā)發(fā)梢端毒物分布、峰值濃度下降以及可能出現(xiàn)的假陰性。再者，不同種族的頭發(fā)顏色和粗細存在顯著差異，而頭發(fā)中的黑色素對毒藥物的進入和結合有很大影響。MIYAGUCHI 等[36]研究了日本人群黑色頭發(fā)和白色頭發(fā)中唑吡坦?jié)舛鹊牟町悾Y果日本人群黑發(fā)與中國人群黑發(fā)的唑吡坦?jié)舛认嗨疲h高于白色頭發(fā)中的濃度。

MSA 方法的局限性。 值得注意的是，目前所有MSA 法研究的對象僅限于黑色頭發(fā)人群，其在白色頭發(fā)人群的適用性、可行性尚需要評估。 同理由于MSA 法的頭發(fā)樣本微量，需要關注難以進入和結合于毛發(fā)基質(zhì)的中性、酸性藥物的可檢出性。 此外，目前研究結果表明，在攝藥時間估計方面采用內(nèi)部時間標志物的精度更高，但在實踐中涉案者再次攝藥的可操作性存在一定難度。

如同所有的技術方法，MSA技術存在其特有的優(yōu)勢和局限。 但筆者認為隨著MSA和MALDI-MS技術平臺的發(fā)展，聯(lián)合使用兩者可能會更好地解決攝毒模式和攝毒時間判斷，以及闡明毒藥物進入機制的難題。