菌落濃度對肉桂酸鉀及苯甲酸鈉抑菌效果影響的分析

余春平，馬齊兵

（武漢能邁科實業有限公司，湖北 武漢 430000）

食品防腐劑是一類可防止食品在貯存、流通過程中受到微生物增殖而引起變質的化合物，大部分防腐劑僅具有抑制微生物生長的作用，無殺菌作用，因此食品中初始菌落總數的高低可能會影響防腐劑的抑制作用。

肉桂酸又名桂皮酸、3 - 苯丙烯酸，是中藥肉桂的有效活性成分。肉桂酸具有良好的抑菌、抗腫瘤、消炎等活性，被廣泛應用于食品、醫藥等行業中。肉桂酸幾乎不溶于水，實際應用時常使用鉀鹽，即肉桂酸鉀[1]。

采用天然抑菌劑和防腐劑對食品進行防腐保鮮是食品加工過程中的常用手段，食品預處理也是重要的環節。苯甲酸鈉和山梨酸鉀因價格低廉且具有廣譜的抑菌效果，食品行業將其作為首選防腐劑[2]，以大腸桿菌為指示菌，以天然抑菌物質肉桂酸鉀、傳統防腐劑苯甲酸鈉為例，就初始菌落濃度對抑菌效果的影響進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

大腸桿菌（CMCC（B） 44103）；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、平板計數瓊脂培養基，奧博星生物提供；75%乙醇、95%乙醇，武漢興和達商貿有限公司提供；氫氧化鈉、氯化鈉，天力化學試劑公司提供；苯甲酸鈉，萬邦化工公司提供；肉桂酸鉀，武漢能邁科實業有限公司提供。

BBS-DDC 型超凈工作臺，歐萊博科學儀器公司產品；DGL-35B 型高壓蒸汽滅菌鍋、FA1004 型電子天平，力辰儀器公司產品；DHP-360 型恒溫培養箱，永光明醫療儀器公司產品；SZ-93 型自動雙重純水蒸餾器，亞榮生化儀器公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化培養

以大腸桿菌為試驗指示菌，按許春芳等人[1]大腸桿菌活化培養的方法制備工作菌種。

1.2.2 培養基的制備

營養肉湯培養基（NB）、營養瓊脂培養基（NA）、生理鹽水、平板計數瓊脂培養基（PCA） 制備方法參考GB/T 39101—2020。

1.2.3 不同濃度菌懸液的制備

（1） 無菌操作下取適量工作菌種溶解于100 mL NB 中，混合均勻，得大腸桿菌菌懸液。

（2） 預先按照GB 4789.2 中的操作方法進行大腸桿菌的菌落計數，于波長600 nm 處測定各濃度菌懸液的吸光度，根據對應的菌落計數值與吸光度建立相關性。根據相關性，將菌懸液調整至一定吸光度。

（3） 將上述菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至10-1，10-2，10-3，制備成不同濃度菌懸液1（5×106CFU/mL），2（5×107CFU/mL），3（5×108CFU/mL）、4（5×109CFU/mL） 備用。

1.2.4 防腐劑溶液的配制

用生理鹽水配制80 g/kg 苯甲酸鈉、肉桂酸鉀溶液；將2 組防腐劑用生理鹽水逐級稀釋至40 g/kg，10 g/kg。于121 ℃下高溫滅菌15 min，備用。

1.2.5 檢測平板制備

將滅菌后的NA 培養基冷卻至45～50 ℃，放置到50 ℃水浴鍋中備用，使用前表面噴上酒精，移入超凈臺；將制備的不同濃度菌懸液（按照1%添加量） 加入到NA 中制備成工作NA，緩慢地搖勻避免產生氣泡，用滅菌的容器量取20 mL 工作NA 緩慢倒入滅菌平皿，輕輕搖動使之鋪平，不能產生氣泡，待冷卻凝固后備用。

1.2.6 測定

用打孔器在工作平板上等距離打3 個孔（6 mm），量取樣品20 μL，緩慢加入到孔中，每個樣品做2 個平行。將平板移入4～6 ℃冰箱擴散2 h，取出平板放置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h 或至抑菌圈清晰，測量抑菌圈的直徑，取平均值[3-4]。

2 結果與分析

2.1 肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌效果

在菌懸液濃度為3（5×108CFU/mL） 的培養基中，分別統計不同濃度下肉桂酸鉀、苯甲酸鈉抑菌圈直徑。

肉桂酸鉀、苯甲酸鈉抑菌圈見圖1，不同含量肉桂酸鉀、苯甲酸鈉對大腸桿菌抑菌作用見圖2。

圖1 肉桂酸鉀、苯甲酸鈉抑菌圈

圖2 不同含量肉桂酸鉀、苯甲酸鈉對大腸桿菌抑菌作用

由圖1 可知，在該菌懸液含量下，除10 g/kg 的肉桂酸鉀和苯甲酸鈉無抑菌圈，其余2 個含量均有抑菌圈，且肉桂酸鉀抑菌圈直徑在2 種含量下均大于苯甲酸鈉，因此推測在相同菌落數條件下，同等含量的肉桂酸鉀抑菌性大于苯甲酸鈉。

因10 g/kg 時無抑菌圈，80 g/kg 時太高，選擇40 g/kg 作為固定濃度（濃度4%），檢測不同濃度菌落數對肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌性影響。

2.2 不同濃度菌懸液對肉桂酸鉀、苯甲酸鈉的抑菌性影響

繪制不同濃度大腸桿菌下4%濃度肉桂酸鉀和苯甲酸鈉的抑菌圈大小折線圖。

不同菌落濃度下肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌效果見圖3。

圖3 不同菌落濃度下肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌效果

由圖3 可知，隨著菌落濃度的增加，肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌圈直徑均減小，抑菌能力下降，且在菌落濃度為4（5×109CFU/mL） 時，抑菌圈消失抑菌效果較弱，證明肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌性和菌落初始數具有相關性，且初始菌落數越高其抑菌性越低。在菌落濃度低于4（5×109CFU/mL） 時，肉桂酸鉀的抑菌性均強于苯甲酸鈉，推測肉桂酸鉀對初始菌落數的耐受性更強。

2.3 不同菌懸液濃度對肉桂酸鉀、苯甲酸鈉復配物抑菌效果的影響

防腐劑在實際應用中會根據食品性質進行復配，以求達到更好的防腐效果。復配后的防腐劑具有綜合防腐性好、價格低廉等優點。研究驗證了肉桂酸鉀與苯甲酸鈉復配對不同濃度菌懸液抑菌效果的影響。根據國家食品安全法規定，肉桂酸鉀屬于食品用香料，除GB 2760 規定不能使用食品香料目錄中的食品，其他食品均可按照需求適量添加，因此肉桂酸鉀與苯甲酸鈉進行復配，可按照需求制定肉桂酸鉀的量[5]。

將肉桂酸鉀與苯甲酸鈉按照1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，3∶1 的比例進行復配，得到5 組復配物。按照上述抑菌圈測定方法，測定在不同濃度大腸桿菌菌懸液濃度下4%濃度的5 組復配物的抑菌圈大小。

不同濃度菌懸液下5 組復配物的抑菌效果見表1，不同濃度菌懸液下5 組復配物的抑菌效果柱形圖見圖4。

表1 不同濃度菌懸液下5 組復配物的抑菌效果/CFU·mL-1

圖4 不同濃度菌懸液下5 組復配物的抑菌效果柱形圖

由表1 和圖4 可知，5 組復配物在不同菌落濃度下，其抑菌效果均呈現下降趨勢，且在濃度為4（5×109CFU/mL） 時均無抑菌圈。在濃度為1（5×106CFU/mL） 時，復配比例為2∶1 時抑菌效果最佳；當濃度為2（5×107CFU/mL） 時，復配比例為3∶1 時其抑菌效果最佳。從試驗數據推斷，雖復配比例和抑菌效果不呈正比例關系，但肉桂酸鉀在復配時其添加比例超過50%時，在不同濃度菌液下的抑菌性更高。

3 結論

通過檢測肉桂酸鉀及苯甲酸鈉對不同菌落濃度大腸桿菌的抑菌率，確定了菌落濃度對肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌性影響具有相關性：隨著菌落濃度升高，肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌性相對減弱；另外，當防腐劑濃度一致時，肉桂酸鉀對大腸桿菌的抑菌性優于苯甲酸鈉。研究為肉桂酸鉀的抑菌性能提供了試驗依據，并驗證了菌落濃度越高，對防腐劑抑菌效果的影響越大，防腐效果變差。為肉桂酸鉀和防腐劑應用在食品中提供了數據參考，給“控制初始菌落數是食品防腐保鮮工藝中的重要因素”提供了依據。在實際應用中，肉桂酸鉀可配合苯甲酸鈉進行使用，其復配比例按照肉桂酸鉀含量大于50%進行復配，其抑菌效果更好。