液相色譜- 串聯質譜法檢測保健食品中6 種人參皂苷含量的方法研究

黃 南，項睿潔，蘇 敏，陳曉雅，王 輝，楊天明，徐聰玲，孟 奇，陸梅陽

（浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 311500）

0 引言

日常檢測中，保健食品中人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 等6 種化合物的含量較高[1]，檢測頻率較高，目前人參皂苷的測定方法通常只針對某些特定的人參皂苷化合物，以高效液相色譜為主[2]，保健食品成分復雜，未凈化對檢測結果影響較大，分離時間過長[3]。擬采用高效液相色譜串聯質譜技術，以期實現6 種人參皂苷主要成分的快速分離和準確定量。

1 方法簡述

1.1 儀器與試劑

AB 3500 液相色譜串聯三重四極桿質譜儀，配電噴霧（ESI） 離子源。

DV215CD 型電子分析天平，感量為0.000 01 g；CP1502 型電子天平，感量為0.01 g；渦旋混合器：IKA VORTEX GENI；DH5B 型臺式離心機；HSCZY400 型氮吹儀；乙腈（CH3CN）：色譜級；甲醇（CH3OH）：色譜純；甲酸（HCOOH）：色譜純；乙酸銨（CH3COONH4）：分析純；人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 等6 種標準品，均購自壇墨質檢科技股份有限公司（純度≥99.0%）。

1.2 標準溶液配制

1.2.1 標準儲備液

精密稱取上述6 種標準品適量，甲醇溶解，配置成質量濃度1 000 μg/mL 的標準儲備液，于-20 ℃條件下避光保存。12 個月內有效。

1.2.2 混合標準中間液

分別量取人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 標準儲備液各0.500 mL 于50.00 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，配置成質量濃度10 μg/mL混合標準中間溶液。

1.2.3 混合工作液

吸取混合標準工作液適量用30%甲醇水配置成5.00～500 ng/mL 不同質量濃度的系列混合標準工作溶液，臨用新配。

1.3 試驗條件

1.3.1 提取

（1） 固態試樣。稱取膠囊內容物/研磨成粉的片劑0.5 g（精確至0.01 g），于50 mL 塑料離心管中，加入2/5 體積超純水，渦旋30 s 混勻，超聲提取20 min，以轉速4 000 r/min 離心2 min，將上述上清液移取至50 mL 容量瓶中，殘渣用15 mL 超純水二次提取，合并提取液置容量瓶中，超純水定容到刻度線，混至均勻，等待下一步操作（凈化）。

（2） 液態試樣。稱取2 g（精確至0.01 g） 試樣，于50 mL 塑料離心管中，加入3/5 體積超純水，30 s渦旋混勻，置于超聲儀中提取15～20 min，超純水定容到刻度線，混至均勻，等待下一步操作（凈化）。

1.3.2 凈化

取活化好的固相萃取柱，準確移取2.0 mL 樣品提取液上柱，20 mL 水分2 次淋洗去除水溶性雜質，待液體流干后，以70%的乙醇水溶液20 mL 進行洗脫，收集全部洗脫液，最終30%甲醇- 水定容至25.00 mL，混勻后過0.22 μm 混合濾膜，上機待測。如果樣品中人參皂苷質量濃度超出線性范圍，可稀釋至線性范圍內再次進樣。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Aglient C18柱（2.0 mm×100 mm，1.9 μm）；流速0.25 mL/min；溫度40 ℃；進樣量2 μL；流動相：A：0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨溶液B：CH3CN。

液相色譜梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

1.3.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI-）。

負模式：電離模式ESI；檢測方式為多反應離子監測（MRM）；氣簾氣壓力（CUR） 為10.0 psi；碰撞氣（CAD） 為medium；離子化電壓（IS） 為-5 000.0 V；霧化溫度（TEM） 為500.0 ℃；霧化氣（GS1） 為50.0 psi；輔助氣（GS2） 為50.0 psi；入口電壓（EP） 為-10.0 V；出口電壓（CXP） 為-10.0 V。

6 種化合物定性、定量離子和質譜分析參數參考值見表2。

表2 6 種化合物定性、定量離子和質譜分析參數參考值

2 結果與分析

2.1 提取和凈化條件的優化

選擇提取液的重要參考是人參皂苷的溶解性，一般提取人參皂苷的提取液有水飽和的正丁醇溶液、50%甲醇水、無水乙醇和超純水等[4]。選取一個標示6 種人參皂苷均有的保健食品，在其余條件不變的情況下用上述4 種提取液分別進行提取，每種提取液進行3 組平行試驗，取其平均值對比4 種經典提取液的提取效率。試驗結果表明，4 種不同提取液對6 種人參皂苷的提取效率差距較小。考慮到經濟實用及操作方便的情況，最終選擇超純水作為提取溶劑。

不同提取溶液提取率比較見圖1。

圖1 不同提取溶液提取率比較

保健食品天然成分較多，化合物種類相對復雜，選取合適的凈化方式，可以有效地減少無關組分對目標化合物的干擾，延長色譜柱的使用壽命。因此，前處理的關鍵步驟之一為對提取液進行有效的凈化與富集。SPE 提取凈化方法中，常用的固相萃取柱有C18及HLB 固相萃取柱[5]。試驗樣品選取保健品中較為常見的膠囊（內容物為粉末） 作為研究對象，考查同一樣品、單一變量（固相萃取方式） 的凈化效果，以樣品的回收率與基質效應（ME）作為指征，其中ME 以基質標準曲線各質量濃度點的響應值與混合標準工作液中相應濃度點的響應值計算，ME 值越接近100%，說明基質效應越低。比較C18、HLB、Alumina-N/XAD-2 3 種不同固相萃取柱的凈化效果。

不同SPE 凈化效果比較見圖2，不同SPE 對回收率的影響見圖3。

圖2 不同SPE 凈化效果比較

圖3 不同SPE 對回收率的影響

由圖2 可知，C18和HLB 柱凈化后6 種目標物的基質效應遠高于Alumina-N/XAD-2 型大孔吸附樹脂復合固相萃取柱，這2 種固相萃取柱的回收率與Alumina-N/XAD-2 型大孔吸附樹脂復合固相萃取柱相比并沒有明顯的優勢（見圖3）。故該試驗采用的凈化柱為Alumina-N/XAD-2 型大孔吸附樹脂復合固相萃取柱。

2.2 色譜條件的優化

6 種人參皂苷的分子結構相類似，其中人參皂苷Rc 與Rb2 互為同分異構體，分子結構相同，存在的區別只在空間結構上，在色譜柱上的保留時間非常的接近，色譜分離時，各物質色譜峰分離度≥1.2 定量更加準確[6]。該研究采用Aglient C18柱（2.0 mm×100 mm，1.9 μm），流速0.25 mL/min，對梯度洗脫條件進行優化，使人參皂苷Rb2 和Rc 實現了完全分離，其余4 種目標物也較好地得到了分離。試驗同時考查了同等條件下甲醇- 水和乙腈- 水體系流動相對6 種目標物質的分離效果。結果表明，甲醇-水體系流動相在洗脫能力方面不及乙腈- 水體系，且在乙腈- 水體系下目標物擁有更加對稱的峰形。優化質譜參數的同時，發現乙腈- 水流動相中加入甲酸可以有效提高皂苷物質的響應信號，加入適量的乙酸銨，不僅增強了流動相的洗脫能力，同時目標物的峰形得到了有效改善。試驗優化了甲酸、乙酸銨的添加量，最終確定濃度為5 mmol/L 的0.1%甲酸- 乙酸銨溶液- 乙睛流動相作為最終流動相，其他試驗條件不變，該流動相下目標物洗脫的更完全，同時信號強度在一定程度上也得到了增強。

2.3 質譜參數的優化

質譜條件的優化用直接接二通方式進行，用0.25 mL/min 的流速將人參皂苷6 種化合物的標準溶液注入電噴霧離子源，根據總離子流響應值和分子離子峰響應值的強度確定最佳質譜參數，主要優化參數為DP 與CE，該試驗首先對目標物進行Q1 掃描，得到母離子質量數，優化DP，保證母離子的傳輸效率；對母離子碰撞后，進行Q3 掃描，得到子離子質譜圖[7]，優化碰撞能，然后在MRM 模式下使用優化好的DP 和CE 進行測試，再進一步優化毛細管電壓，霧化器壓力，干燥器溫度和流速等質譜參數使離子化效率達到最佳。

6 種人參皂苷化合物多反應監測（MRM） 模式下色譜圖見圖4。

圖4 6 種人參皂苷化合物多反應監測（MRM） 模式下色譜圖

2.4 線性關系與定量限

將空白基質標準工作液由低到高濃度進樣，在該試驗所確定的儀器條件下對6 種人參皂苷進行測定，目標物濃度為橫坐標，目標物峰面積為縱坐標繪制標準曲線得到線性方程。通過向陰性樣品中添加目標物來考查方法的檢出限。

6 種人參皂苷的線性方程與線性關系見表3。

表3 6 種人參皂苷的線性方程與線性關系

2.5 方法精密度和回收率驗證

按上述試驗方法操作，選擇不含該試驗所測的6 種人參皂苷的固體保健品分別進行3 個質量濃度6 次平行的加標回收試驗，選擇10，20，40 mg/kg 3 個質量濃度進行添加回收試驗，方法平均回收率在81.4%～105.6%，表明該方法準確度較高。相對標準偏差為1.1%～7.8%，說明該方法精密度較好。

6 種人參皂苷的加標回收和重現性（n=6） 見表4。

2.6 穩定性試驗

試驗分別考查了6 種人參皂苷在提取后，在樣品瓶中放置不同時間（2，6，12，24，48 h） 的穩定性。通過檢測，6 種人參皂苷含量的RSD＜7.50%，說明該試驗條件下樣品穩定性良好，可以滿足日常測定的要求。

2.7 市售樣品的測定

對市售9 批保健食品采用1.2 的前處理方法進行分析比對，其中原材料標識含有人參、三七等五加科植物成分的有4 批，未標識含有的有5 批，分別按照該試驗確定的最終條件進行處理與檢測，結果表明，標識含有五加科植物配料的4 批保健食品均檢出人參皂苷成分，6 種人參皂苷含量占0.40%～1.37%，與樣品標簽所標總皂苷含量基本一致；而剩余5 批未標識含有五加科植物成分的樣品6 種人參皂苷均為未檢出。

保健食品樣品中6 種人生皂苷成分的測定結果見表5。

表5 保健食品樣品中6 種人生皂苷成分的測定結果

3 結論

建立高效液相色譜- 液質聯用法測定保健食品中6 種人參皂苷的檢測方法。優化了前處理提取、凈化、色譜和質譜條件，與其他干擾物有良好的分離。該方法簡單、靈敏度高、專屬性強，具有良好的線性和精密度和回收率。