“靈芝+白星花金龜幼蟲”聯合轉化蘋果修剪枝條研究

趙威,趙傳岳,周婷,孔昊,張樂杰,王麗*

“靈芝+白星花金龜幼蟲”聯合轉化蘋果修剪枝條研究

趙威1,趙傳岳1,周婷2,孔昊1,張樂杰1,王麗1*

1. 山東農業大學植物保護學院,山東省農業微生物重點實驗室, 山東 泰安 271018 2. 招遠市農技推廣中心, 山東 招遠 265400

本實驗探究了不同靈芝菌株和白星花金龜幼蟲對以蘋果枝條為主的農林廢棄物的聯合轉化能力，首先分別測定了不同靈芝菌株在以蘋果枝條為主要栽培基質中的菌絲生長速度、生物學效率以及子實體和菌糠中的活性成分，之后測定了白星花金龜幼蟲對不同靈芝菌株所產生菌糠的轉化效率，最后以1 kg培養料（干重）為基準，菌糠轉化效率按蟲料比1:4飼喂5 d后統計，評價了不同靈芝菌株與白星花金龜幼蟲的聯合轉化效果。結果得出：除6號和9號外，其余7個靈芝菌株和白星花金龜幼蟲聯合轉化后，剩余干物質量（剩余菌糠量）均小于50.0%，為19.0%～33.4%（190.04 g～334.27 g），生產靈芝61.87 g～126.50 g，蟲體增重6.33 g～82.76g，產生蟲砂43.94 g～426.54 g；其中5號靈芝菌株和白星花金龜幼蟲聯合轉化1 kg培養料后剩余的干物質量最少，僅剩余190.04 g，生產靈芝106.90 g，蟲體增重65.53 g，產生蟲砂394.19 g。本研究表明，通過靈芝和白星花金龜幼蟲聯合轉化可以實現蘋果枝條的生態高值化利用，為林果枝條廢棄物的資源化利用提供一定的理論依據。

靈芝; 白星花金龜幼蟲; 蘋果修剪枝條; 生物轉化

山東省是中國北方重要的果樹大省，果樹種質資源豐富，栽培歷史悠久。其中，蘋果是山東省特色水果，栽培面積30.47萬hm2，在我國排名第三[1]。蘋果樹作為一種落葉喬木，栽植五年以后即可進入豐產期，4～11年樹齡的蘋果樹平均可產4297 kg/hm2左右的修剪枝條[2]，8～15年樹齡的蘋果樹可產7500 kg/hm2左右的老樹及修剪枝條。目前這部分資源并未得到有效利用，造成了嚴重的資源浪費和環境污染。靈芝（spp.）是木腐型真菌，隸屬擔子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，以腐解木材中的木質纖維素作為生長發育的營養基礎，可利用棉籽殼、玉米芯、木糖醇渣、果木枝條等各種農林廢棄物進行栽培[3]。靈芝作為一種重要的食藥用真菌，其子實體中含有豐富的多糖、三萜、生物堿、甾醇等生物活性成分，具有提高人體免疫力、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、護肝、安神等多種保健功效[4-6]。

白星花金龜（Lewis）為昆蟲綱、鞘翅目、金龜甲總科、花金龜科、星花金龜屬的昆蟲，其幼蟲為腐食性，在自然界中以取食腐爛的秸稈、雜草及畜禽糞便等為生，可以將農業有機廢棄物轉化為有機質含量高的顆粒狀蟲砂，具重要的應用和開發前景[7-8]。早期對白星花金龜的研究主要集中在生物學特性、發生規律及害蟲防治方面。近年來隨著農業有機廢棄物資源數量的不斷增加和人們對生態環境保護的重視，白星花金龜作為一種寶貴的環保昆蟲資源也被用于各種有機廢棄物的生物轉化中。研究發現，白星花金龜幼蟲對農作物秸稈、菌糠和畜禽糞便等有機廢棄物均有較強的轉化能力[9,10]。

基于此，本論文立足山東省主要的果樹修剪枝條——蘋果枝條，探究靈芝和白星花金龜幼蟲對其聯合轉化能力，首先測定了不同靈芝菌株在以蘋果枝條為主要栽培基質中的菌絲生長速度、生物學效率以及子實體和菌糠中的活性成分，之后測定了白星花金龜幼蟲對不同靈芝菌株所產生菌糠的轉化效率，最后計算了不同靈芝菌株和白星花金龜幼蟲對蘋果枝條的聯合轉化能力。本研究旨在為果木枝條廢棄物資源和靈芝菌糠的生態高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株和原料來源

9個靈芝菌株GL-01～GL-09，分別編號為1～9，現保藏于山東農業大學菌物實驗室；蘋果木屑來源于山東果園修剪枝條，棉籽殼、麥麩等購于當地市場。

1.2 培養基質配方

配方為：蘋果枝條木屑67%、棉籽殼20%、麥麩10%、蔗糖1%、石膏1%、生石灰1%。將木屑和棉籽殼提前預濕，之后與麥麩、蔗糖和石灰粉充分混合均勻，調整培養料的含水量至60%左右。裝袋后121 ℃高壓滅菌2 h，冷卻后接種并置于25±1℃發菌室恒溫避光培養。

1.3 靈芝菌絲生長速度和生物學效率測定

從接種后第5 d菌絲封面開始，每隔3 d劃線記錄栽培袋中菌絲延伸的距離，直至菌絲長滿栽培袋，計算菌絲在菌袋中的日平均生長速度[11]，每個菌株5個重復；子實體采收階段，當靈芝芝蓋邊緣白色或黃色生長圈消失轉為棕褐色，菌蓋開始革質化，菌管層出紅褐色孢子時，進行靈芝子實體的采收，采收后測定子實體鮮重，每個菌株15個重復。生物學效率（%）=（子實體鮮重/培養料干重）×100[12]。

1.4 靈芝子實體和菌糠中活性成分測定

將采收的靈芝子實體和菌糠置于60 ℃烘箱中烘干至恒重，之后分別粉碎，過40目篩網后用于多糖、三萜和黃酮活性成分的測定。靈芝多糖采用熱水浸提法進行提取[13]，采用蒽酮-硫酸比色法進行測定[14]；靈芝三萜采用香草醛-冰醋酸法測定；靈芝黃酮的測定采用SN-T 4592-2016中的方法。

1.5 白星花金龜幼蟲轉化靈芝菌糠研究

靈芝采收后，產生的菌糠粉碎過10目篩網，調節并控制含水量為55%，每組放置50頭大小一致的白星花金龜三齡幼蟲，按蟲料比1:4加入靈芝菌糠，之后置于人工智能氣候箱（T=25±1 ℃、RH=75%±5%）中飼養，5 d后測定各處理組的菌糠取食量、蟲體增重和蟲砂產生量以及死亡蟲數，并計算取食率、利用率和死亡率，每個處理重復3次[15]。

取食率(%)=(添加飼料干重－剩余飼料干重)/添加飼料干重×100

轉化率(%)=增加的體重/（取食量-排糞量）×100

利用率(%)=增加體重/取食量×100

死亡率(%)=死亡蟲數/供試蟲數×100

1.6 靈芝菌糠及蟲砂的種子發芽指數（Germination index，GI）測定

參考文獻中Wei PP等[16]的方法并稍作調整，具體如下：將烘干的菌糠及蟲砂樣品粉碎過100目篩，稱取5 g與蒸餾水按1:10（m/v）的比例混合，160 r/min、30 ℃震蕩24 h，之后4 ℃、12000 r/min離心10 min，過濾收集上清液用于GI的測定。將兩層濾紙置于9 cm培養皿內，均勻點播20粒油菜種子，加5 mL浸提液置于25 ℃恒溫箱中暗光培養3 d，蒸餾水作為對照組，每個處理重復三次，按下面公式計算各處理的GI值：GI（%）=（處理組種子發芽的平均數量×種子平均根長）/（對照組種子發芽的平均數量×種子平均根長）×100。

1.7 總評歸一化處理

采用Hassan方法對于三個靈芝和白星花金龜幼蟲對蘋果枝條聯合轉化效果指標（子實體產量、蟲體增重量、蟲砂產生量）進行總評用歸一化處理[17]。指標取值均越大越好，計算公式為d=（Y－min）/（max－min），min為指標中最小值，max為指標中最大值?？傇u歸一值OD=（1+2+3+…d）/(為指標數)。

1.8 數據處理

調查數據采用SPSS 16.0進行分析，采用單因素（one-way ANOVA）和Duncan法進行方差分析和多重比較（=0.05），應用Microsoft Excel 2013記錄、整理數據和繪制表格。

2 結果與分析

2.1 9個靈芝菌株的菌絲生長速度和生物學效率測定

9個靈芝菌株在以蘋果枝條木屑為主的基質中菌絲生長速度和生物學效率如表1所示。9個菌株的日均生長速度在7.89 mm/d～11.41 mm/d之間，其中3號菌株的菌絲生長速度最快，其次為8號菌株，這兩個菌株的生長速度顯著快于其他菌株（=28.605，＜0.05），6號菌株的生長速度最慢。9個菌株的生物學效率在17.6%～31.3%之間，其中8號菌株的生物學效率最高，與5號和9號菌株之間無顯著差異，顯著高于其他菌株，3號菌株的生物學效率最低（=12.912，＜0.05）。

表1 9個靈芝菌株的菌絲生長速度和生物學效率

注:數據為平均值 ± 標準誤，同列數據后附不同小寫字母者表示差異顯著 (＜0. 05) 。

Note: Mean ± SE in the same row followed by different letters indicate significant differences (＜0. 05) .

2.2 9個靈芝菌株的子實體和菌糠中活性成分測定

分別測定了9個靈芝菌株的子實體和產生的菌糠中三萜、黃酮和多糖活性成分，結果如圖1所示。9個靈芝菌株子實體中的三萜、黃酮、多糖含量均存在顯著性差異（=20.345，＜0.05；=106.28，＜0.05；=683.325，＜0.05）：三萜含量在1.6%～2.5%之間，其中3號靈芝子實體含量最高，與1號和8號菌株無顯著性差異，顯著高于其他菌株，2號的三萜含量最低；從黃酮含量來看，3號靈芝子實體的黃酮含量最高，為0.5%，與7號菌株無顯著差異，顯著高于其他菌株；多糖含量在1.3%～2.4%之間，其中4號靈芝子實體的含量最高，5號含量最低。

9個靈芝菌株產生的菌糠中三萜含量無顯著性差異（=2.151，=0.085）；黃酮含量存在顯著性差異（=35.552，＜0.05），其中8號靈芝菌糠的黃酮含量最高，為0.3%，與6號和7號菌株間無顯著性差異，顯著高于其他菌株，2號菌株的黃酮含量最低，為0.1%；9個靈芝菌株采后菌糠中的多糖含量在2.4%～4.0%之間，其中3號靈芝菌糠中的含量最高，顯著高于其他菌株（=7793，＜0.05），9號靈芝菌糠中的含量最低。

圖 1 9個靈芝菌株子實體和菌糠中活性營養成分測定

2.3 白星花金龜幼蟲對靈芝菌糠的生物轉化研究

用白星花金龜三齡幼蟲分別對9個靈芝菌株產生的菌糠進行生物轉化，5 d后測定單個蟲體增重量、菌糠取食量和蟲砂產生量，結果見圖2。白星花金龜幼蟲取食2號、3號、4號和5號靈芝菌糠組的單蟲增重量分別為0.0770 g、0.0847 g、0.0757 g和0.0773 g，顯著高于6號、7號、8號和9號靈芝菌糠組，其中單蟲增重量最大的為3號菌糠組，為0.0847 g，蟲體增重量最小的為9號菌糠組，僅為0.0013 g；單個蟲體的菌糠取食量在0.1410 g～0.6230 g之間，其中對5號靈芝菌糠的取食量最多，與3號菌糠組無顯著差異，顯著高于其他靈芝菌糠組，對9號菌糠組的取食量最少；單個蟲體的蟲砂砂產生量在0.0497 g～0.4980 g之間，其中取食5號菌糠組產生的蟲砂砂最多，顯著高于1號、6號、8號和9號菌糠組，取食9號菌糠組產生的蟲砂量最少。

圖 2 白星花金龜幼蟲對9個靈芝菌糠的生物轉化測定

進一步計算了白星花金龜幼蟲對不同靈芝菌糠的取食率、轉化率、利用率和死亡率，結果見表3。白星花金龜幼蟲對不同靈芝菌糠的取食率在17.5%～77.9%之間，其中對5號菌糠的取食率最高，與3號菌糠差異不顯著，均顯著高于其他菌糠（=86.591，＜0.05），對9號菌糠的取食率最低；幼蟲對不同靈芝菌糠的轉化率在1.4%～106.5%之間，其中2號菌糠的轉化率最高，與1號、3號、4號、5號和7號菌糠無顯著差異（=15.767，＜0.05），9號菌糠的轉化率最低；從幼蟲對不同靈芝菌糠的利用率來看，1號～5號菌糠之間無顯著性差異，在12.4%～15.7%之間，其中利用率最高的2號菌株，可達15.7%，顯著高于6號～9號菌糠（=12.771，＜0.05），利用率最低的為9號菌糠；從不同靈芝菌糠中蟲體的死亡率來看，9號菌糠的死亡率最高，為10.7%，顯著高于2號、3號、5號和7號菌糠（=3.866，＜0.05）。

表 2 白星花金龜幼蟲對不同靈芝菌糠的取食率、轉化率和利用率

注:數據為平均值 ± 標準誤，同列數據后附不同小寫字母者表示差異顯著 (＜0.05)。

Note: Mean ± SE in the same row followed by different letters indicate significant differences (＜0.05).

2.4 靈芝與白星花金龜幼蟲對蘋果枝條的聯合轉化效果的測定

9個靈芝菌株在以蘋果枝條為主要栽培基質中進行栽培，獲得靈芝子實體，產生的靈芝菌糠再用白星花金龜幼蟲進行轉化，蟲料比為1:4飼喂5 d后測定其轉化效果。最終以1 kg栽培基質（干重）為基準，通過計算靈芝子實體產量、白星花金龜幼蟲增重量和蟲砂產量，評價了不同靈芝菌株與白星花金龜幼蟲對以蘋果枝條為主的廢棄物的聯合轉化效果，結果見表3。

由表3可知，1 kg蘋果枝條栽培基質經不同靈芝菌株轉化后子實體產量和菌糠產生量表現出顯著性差異（＜0.05），子實體產量為61.87 g～126.50 g，菌糠產生量為678.17 g～808.03 g，蘋果枝條培養料的干物質降解率為19.2%～32.2%，干物質剩余量為67.8%～80.8%。產生的菌糠進一步經過白星花金龜幼蟲轉化得出，取食不同靈芝菌糠的幼蟲蟲體增重量、蟲砂產生量和菌糠剩余量均表現出顯著性差異（＜0.05），蟲體增重量為1.15 g～82.76 g，蟲砂產生量為43.94 g～426.54 g，菌糠剩余量為190.04 g～623.45 g。

為綜合考慮靈芝與白星花金龜幼蟲對蘋果枝條的聯合轉化效果，采用Hassan方法對靈芝子實體產量、蟲體增重量和蟲砂產生量等3個指標進行總評歸一化處理，總評歸一值（OD）越大，表明靈芝與白星花金龜幼蟲對蘋果木枝條的聯合轉化效果越好，結果見表4。由表4可知，5號靈芝菌株和白星花金龜幼蟲對蘋果枝條的聯合轉化效果最好，OD值為0.8004，1 kg基于蘋果枝條為主的栽培料可產生106.90 g靈芝子實體，菌糠經白星花金龜幼蟲轉化后蟲體增重65.53 g，產生蟲砂394.19 g；9號靈芝菌株和白星花金龜幼蟲對蘋果枝條的聯合轉化效果最差，OD值為0.1981，1 kg基于蘋果枝條為主的栽培料可產生100.27 g靈芝子實體，菌糠經白星花金龜幼蟲轉化后蟲體增重1.15 g，產生蟲砂43.94 g。

表 3 靈芝與白星花金龜幼蟲對基于蘋果枝條的栽培基質的聯合轉化效果（以1 kg栽培基質干重為基準計算）

注:數據為平均值 ± 標準誤，同列數據后附不同小寫字母者表示差異顯著 (＜0.05)。

Note: Mean ± SE in the same row followed by different letters indicate significant differences (＜0.05).

表4 靈芝與白星花金龜幼蟲對基于蘋果枝條的栽培基質的聯合轉化效果OD值

2.5 白星花金龜幼蟲取食不同靈芝菌糠產生的蟲砂的GI測定

GI測定是評價堆肥物料腐熟程度的方法，可以綜合反映堆肥的植物毒性。當GI大于50.0%時堆肥基本腐熟，對植物基本無毒性；當GI大于80.0%時堆肥已經完全腐熟，對植物沒有毒性。本實驗測定了白星花金龜幼蟲取食不同靈芝菌糠產生的蟲砂的GI，以評價其腐熟程度，結果見圖3。由圖中可以看出，本實驗中所有取食靈芝菌糠所產生的蟲砂的GI均大于50.0%，表明均已達到基本腐熟，除了2號和3號外，其余7組蟲砂的GI均大于80.0%，達到完全腐熟。1號、4號、5號、7號、8號和9號蟲砂的GI大于100.0%，其中8號蟲砂的GI最高，可達112.0%。

圖 3 白星花金龜幼蟲取食不同靈芝菌糠產生的蟲砂的GI值

3 討論

林果枝條廢棄物是一種重要的生物質資源，但目前并未得到有效利用，這些廢棄物大多被隨意堆放或焚燒，導致資源浪費和環境污染[18]。近年來，隨著國家對生態環境保護和廢棄物資源利用的關注度提高，對林果枝條廢棄物的資源化利用進行相關研究的重要性日益凸顯[19]。盡管已有相關研究關注林果枝條廢棄物的利用，如制作生物質炭、有機肥料，篩選高效降解菌或作為食用菌栽培基質等方面[20-22]，但這些處理方式仍存在成本高或者二次污染等問題。因此，尋找更有效、經濟成本低且不產生二次污染的林果枝條廢棄物利用方式仍然是當前研究的重要方向。

本研究選用腐生型食藥用菌——靈芝和腐食性昆蟲——白星花金龜幼蟲聯合轉化基于蘋果枝條的廢棄物，將枝條廢棄物最終轉化為靈芝、白星花金龜幼蟲和蟲砂等高附加值產品，且不產生二次污染，進一步通過測定靈芝產量、白星花金龜幼蟲增重量、蟲砂產量及其GI值和菌糠剩余量等指標探究了它們的聯合轉化效果，為果木枝條廢棄物資源和靈芝菌糠的生態高值化利用提供理論依據。

本研究中，9個靈芝菌株在以蘋果枝條為主要栽培基質的培養料中的生物學效率為17.6%～31.3%，培養料的干物質降解率為19.2%～32.2%，干物質剩余量（產生菌糠量）為67.8%～80.8%；除3號和7號菌株外，其余7個菌株的轉化效率均達到25.0%以上。進一步采用白星花金龜幼蟲對9個靈芝菌株的菌糠進行生物轉化，蟲料比為1:4飼喂5 d后測定其轉化效果，結果發現白星花金龜幼蟲對不同靈芝菌糠的取食率在17.5%～77.9%，除6號和9號菌糠組外，對其余7種菌糠的取食率均高于50.0%。以1 kg培養料（干重）為基準，評價了不同靈芝菌株與白星花金龜幼蟲對以蘋果枝條為主的廢棄物的聯合轉化效果，除6號和9號外，其余7個靈芝菌株和白星花金龜幼蟲聯合轉化后，剩余干物質量（剩余菌糠量）均小于50.0%，剩余19.0%～33.4%（190.04 g～334.27 g），生產靈芝61.87 g～126.50 g，蟲體增重 6.33 g～82.76g，產生蟲砂43.94 g～426.54 g，其中5號靈芝菌株和白星花金龜幼蟲對蘋果枝條的聯合轉化效果最好，1 kg蘋果枝條栽培料可產生106.90 g靈芝子實體，白星花金龜幼蟲蟲體增重65.53 g，產生蟲砂394.19 g。經測定發現基于蘋果枝條為主要基質栽培的靈芝子實體和菌糠中均含有豐富的三萜、多糖和黃酮等活性成分，產生蟲砂的GI值均大于50.0%，以上結果表明通過靈芝和白星花金龜幼蟲聯合轉化可以實現蘋果枝條的生態高值化利用。

張廣杰等[23]研究發現，白星花金龜幼蟲對發酵不同時間的玉米秸稈、小麥秸稈、花生殼和衛生紙等4種物料轉化時除物料種類外，不同發酵時間對白星花金龜幼蟲的轉化效率也具有較大影響，并推測發酵不同時期的物料中木質素、纖維素和半纖維素等木質纖維素的降解程度是主要影響因素。本研究中，白星花金龜幼蟲對不同靈芝菌糠的轉化效率具有顯著差異，其中對6號和9號菌糠組的取食率較低，僅為27.7%和17.5%，而6號和9號靈芝菌株的生物學效率分別為27.1%和29.4%，顯著高于1號、2號、3號和7號菌株，不同靈芝菌株的生物學效率一定程度上可以反應出其對基質中木質纖維素的降解程度，由此推測，白星花金龜幼蟲的取食效率除了受木質纖維素的降解程度影響外，還受其他因素影響，如本研究中不同靈芝菌糠中的活性成分不同等，具體還有待于下一步深入研究。

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Combined Transformation of Apple Pruning Branches byspp. andLarvae

ZHAO Wei1, ZHAO Chuan-yue1, ZHOU Ting2, KONG Hao1, ZHANG Le-jie1, WANG Li1*

1.271018,2.265400,

We investigated the substrate combined transformation efficiency mainly based on apple branch sawdust byspp. andlarvae (PBL). Firstly, the mycelium growth rate, biological efficiency and active components in the fruiting body and spent mushroom substrate (SMS) of differentstrains were measured respectively. Then, the conversion efficiency of the PBL to differentSMS was measured. Finally, the combined transformation efficiency was calculated by using 1 kg of substrate (dry weight) as a baseline, PBL-SMS ratio is 1:4 and feeding for 5 days. The results showed that, except No. 6 and No. 9 strains, the residual dry matter weight of the other 7strains was less than 50.0% after combined transformation with PBL, ranging from 19.0% to 33.4% (190.04 g to 334.27 g), the yield ofwas 61.87 g to 126.50 g, the PBL gained weight was 6.33 g～82.76 g and the insect sand gained weight was 43.94 g～426.54 g. Among them, the combined conversion efficiency of No.5strain and the PBL was the highest, the residual dry matter weight was only 190.04 g, and 106.90 g of, 65.53 g of the PBL gained weight and 394.19 g of insect sand was produced. This study shows that the ecological high-value utilization of apple branches can be achieved through the joint transformation ofand PBL, which provides a theoretical basis for the resource utilization of forest and fruit branch waste.

spp.;larvae (PBL); apple pruning branches; biotransformation

S433.5

A

1000-2324(2023)05-0710-08

10.3969/j.issn.1000-2324.2023.05.010

2023-07-18

2023-11-14

自治區重點研發計劃項目(2022B02046);山東省現代農業產業技術體系食用菌創新團隊建設項目(SDAIT-07-06)

趙威(1999-),男,碩士研究生,主要研究方向:食藥用菌資源利用. E-mail:1932834267@qq.com

Author for correspondence. E-mail:haoyou0102@163.com