哺乳動物體外成熟卵母細胞的線粒體調控機制研究進展

孫立晨，許曉玲，白佳樺，秦玉圣，劉彥，郭凱軍

(1. 北京農學院動物科學技術學院，北京 102206；2. 北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 100097)

卵母細胞體外成熟(invitromaturation，IVM)是指將生發泡(germinal vesicle，GV)期卵母細胞從竇卵泡腔中取出并在適當的培養體系中培養，使其在體外發育成熟到第二次減數分裂中期(MⅡ)并獲得體外受精能力的技術。該技術作為人工輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)以及家畜胚胎工程的重要組成部分，在人類不孕不育和畜牧業領域，特別是家畜種質資源保存、良種擴繁等方面具有較大的應用前景。然而，卵母細胞體外成熟過程是非生理性的，由于沒有經歷體內排卵前的生長發育過程，缺少胞質成熟事件及物質支持卵母細胞完全發育，此條件下產生的胚胎及胎兒發育潛力較低[1]。在卵母細胞成熟發育過程中，線粒體的數量、形態、分布發生顯著變化。因此，線粒體指標常常被認為是衡量卵母細胞胞質成熟的標志之一。為此，本文介紹了卵母細胞成熟機制、體內外成熟差異、線粒體在卵母細胞成熟過程中的調控作用，以及外源線粒體調節劑在卵母細胞體外成熟體系中的應用情況和效果，以期為進一步完善卵母細胞IVM技術體系，提高體外胚胎生產效率提供幫助。

1 卵母細胞減數分裂成熟機制

哺乳動物卵母細胞的成熟進程需經歷兩次減數分裂過程的精細調節[2]。胚胎期的卵原細胞經歷增殖期、生長期、成熟期后停滯在第1次減數分裂前期的雙線期[3]。停滯主要是由于卵泡液內存在減數分裂抑制物質，目的是為了完成細胞質成熟、RNA轉錄、蛋白質合成及細胞質微管重組等過程[4]。排卵前促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)高峰觸發減數分裂的恢復，進而引起生發泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)，卵母細胞紡錘體結構變化，染色體聚集重排，排出第一極體，并停滯在第二次減數分裂中期，此時卵母細胞的核和質均已成熟，卵母細胞做好受精準備[5]。

卵母細胞成熟進程主要是由卵內環腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)水平來有效調控的[6]。腺苷酸環化酶(adenylate cyclase，AC)通過催化卵丘顆粒細胞產生的ATP維持cAMP水平，并經過縫隙連接通道(gap junction channel，GJC)傳遞到卵母細胞內維持減數分裂靜止[7]。也有研究表明，G 蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)在卵母細胞內激活AC，直接通過自身級聯反應催化ATP磷酸化產生cAMP[8]。此外，壁層顆粒細胞和卵丘顆粒細胞產生的C型鈉肽(C-type natriuretic peptide，CNP)特異性結合鳥苷酸環化酶(guanylyl cyclase，GC)偶聯受體-利鈉肽受體2(natriure-tic peptide receptor 2，NPR2)，激活GC促進高水平環鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)合成，繼而抑制磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)的水解活性，維持胞內cAMP水平[9-10]。高濃度cAMP激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)引起細胞周期蛋白依賴性激酶磷酸化，導致細胞周期蛋白B(cyclin B)無法合成，無法與游離的催化亞基P34cdc2結合后形成有活性的成熟促進因子(maturation promoting factor，MPF)，從而引起卵母細胞在第一次減數分裂前期的雙線期阻滯。這種依賴于高濃度cAMP的PKA通路通過調控MPF活性，維持卵母細胞核處于靜止狀態，使得細胞核與細胞質盡可能同步成熟，從而達到調控卵母細胞成熟進程的目的。

2 卵母細胞體內外減數分裂成熟發育差異

細胞核和細胞質的成熟過程是相輔相成的，胞質的成熟發育程度決定后期胚胎的發育能力。體內卵母細胞發育過程中，受到cAMP及一些蛋白質合成、降解、磷酸化和去磷酸化等因素調節，核成熟被抑制，為核質同步成熟提供平衡，從而促使核質成熟同步化。但是在體外成熟過程中，未成熟的GV期卵母細胞一旦脫離體內卵泡液的抑制環境后，就會迅速恢復減數分裂，發生GVBD，排出第一極體。同時，縫隙連接蛋白合成被抑制使GJC受阻，cAMP無法大量進入卵母細胞，導致核成熟過早發生[11-12]。此時細胞質中并未完成細胞器的數量積累和重新分布，處于GV期的狀態。GJC阻礙也會使營養物質無法及時供應到細胞質內，未充分準備好母源物質的儲備利用等，即細胞質不成熟[13]。通常體外成熟卵母細胞的發育能力低于體內成熟的卵母細胞[14]，正是由于核質成熟不同步造成的[15]。

細胞質成熟涉及胞漿內一系列細胞器及各種蛋白的變化。在誘導損傷的卵母細胞中，線粒體可以通過提供更多能量來恢復卵母細胞正常狀態[16]，其數量及動態分布變化與卵母細胞成熟、受精和早期胚胎發育密切相關[17]。隨著卵母細胞的成熟進程，線粒體由初始合成區域遷移至皮質區，后期分布于胞質中央區域，同時線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷貝數也增多。在線粒體動態系統中，線粒體融合蛋白這種高度保守的跨膜GTP酶作為線粒體動力學(線粒體融合、分布，信號傳導等)的關鍵影響因素對能量的產生至關重要[18]。而體外成熟的卵母細胞和體內成熟的卵母細胞之間的主要差異是線粒體功能和ATP產生的效率，導致卵丘-卵母細胞復合體(cumulus oocyte complex，COCs)耗氧量和卵母細胞氧化代謝較低，體外受精后囊胚率低[19]。

3 卵母細胞減數分裂成熟中線粒體功能及調節機制

作為主要直接能量來源的線粒體在卵母細胞中數量豐富，其在卵母細胞成熟過程中呈動態分布。GV期線粒體主要分布于生發泡周圍，分裂前線粒體聚集在紡錘體周圍，分裂時幾乎都留在卵母細胞內，極少隨極體排出[20]。而MⅡ期卵母細胞中的線粒體周圍有高電子密度的基質[21]。兩次減數分裂后，線粒體又分散于細胞質中為后續發育提供能量。同時，線粒體在卵母細胞成熟的每個階段都在進行復制，雙鏈環狀的mtDNA在絕大多數哺乳動物卵母細胞成熟時數量能達到105個拷貝數，且此過程選擇正確的mtDNA保持了遺傳的同質性和線粒體的完整性[22]。有研究表明，mtDNA含量對受精結果至關重要，是評估卵母細胞質量的重要標志[23]。

線粒體功能復雜，通過參與調控氧化還原穩態、鈣信號傳遞、細胞周期、胞質內蛋白質穩態等多種信號通路轉導的生物學過程，支持染色體分離、受精及胚胎發育[24]。在整個卵母細胞發育和成熟過程中，能量需求遞增，在排卵時達到峰值，線粒體發生活躍的氧化磷酸化，產生ATP，為后續受精及胚胎發育做準備[25]。同時，也會產生一定量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，影響卵母細胞成熟。正常條件下，少量的ROS會被線粒體中的抗氧化酶清除，以維持氧化還原穩態。但當線粒體數量減少機能下降時，氧化產生的ROS無法及時清除，積累過多會損傷卵母細胞的發育。線粒體作為雙膜細胞器，這種特殊結構在發揮功能上起到重要作用[26]。外膜可選擇性滲透小分子，且存在與編碼線粒體蛋白有關的轉位酶位點。而具有嵴結構的線粒體內膜幾乎不滲透，目的為維持跨膜梯度，嵴外側有電子傳遞鏈的蛋白復合體定位點。線粒體膜內質子通過質子泵泵出造成膜內外電位差，即形成線粒體跨膜電位，線粒體跨膜電位作為產生ATP的基礎，可預測卵母細胞早期凋亡程度。線粒體功能、分布及結構在卵母細胞發育過程中的顯著變化可以作為衡量卵母細胞胞質成熟的指標，有利于在IVM中挑選出更優質的卵母細胞來激活后期受精及胚胎發育更大潛力。

4 外源線粒體調節劑在卵母細胞體外成熟體系中的應用

體外成熟的卵母細胞雖然發育潛力低于體內來源，但是由于其可為胚胎體外生產以及人工輔助生殖提供更多的豐富卵源，因此需要不斷完善體外培養體系，從而提高該技術的有效性。線粒體結構和功能與卵母細胞成熟質量密切相關，是影響受精及胚胎發育的重要因素。所以，通過添加外源線粒體調節劑來優化體外培養體系具有重要意義。

4.1 肉堿

肉堿，是一種類氨基酸，屬于季銨陽離子復合物，主要作為載體將脂肪酸轉運進入細胞線粒體，最終進行β-氧化過程釋放能量[27]。同時，作為一種線粒體調節劑，在卵母細胞體外培養中添加肉堿可以抵消能量和氧化還原失衡[28]。左旋肉堿(L-carnitine，LC)調節脂質代謝和葡萄糖代謝，提高呼吸鏈酶活性，防止氧化應激，抑制細胞凋亡[29]。在培養基中添加2.5 mmol/L的LC可以增加體外成熟水牛卵母細胞的直徑和線粒體活性，增強細胞骨架和細胞質重組，增加卵母細胞來源的生長因子9(growth differentiation factor 9，GDF9)和骨形態發生蛋白15(bonemorpho-geneticprotein 15，BMP15)的分泌，進而促進卵母細胞-顆粒細胞復合體(oocyte-granulosa cell complexes，OGCs)中竇樣結構形成，抑制卵母細胞退化，支持水牛卵母細胞體外生長[30]。同樣在犬卵母細胞IVM期間補充0.6 mg/mL LC可以改善核成熟、受精率以及體外受精和著床前胚胎發育[31]。LC在輔助生殖技術中可以保護細胞免受氧化損傷引起的細胞凋亡，提高線粒體活性和減數分裂能力，具有改善卵母細胞質量和卵巢功能障礙的潛力[32]。

4.2 輔酶Q10

輔酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)是細胞線粒體電子傳遞鏈中的脂溶性電子載體，參與ATP的合成。研究表明CoQ10供應不足會使線粒體功能受損，導致卵母細胞質量降低[33]。在牛卵母細胞體外培養時，添加40 μmol/L CoQ10能顯著提高線粒體質量，維持高ATP水平，減少卵母細胞凋亡，使卵母細胞更接近體內正常的發育軌跡[34]。在綿羊卵母細胞體外培養時，添加30 μmol/L CoQ10可促進線粒體的正常分布，平衡能量代謝，降低ROS產生和卵母細胞染色體錯位，提高綿羊體外胚胎的產量[35]。CoQ10還可以抑制沉默信息調節因子2相關酶類4(silent mating type information regulation 2 homolog-4，SIRT4)的過表達來減輕衰老引起的線粒體功能障礙，清除ROS積累[36]。在豬卵母細胞培養體系中，添加100 μmol/L CoQ10的還原形式泛醇-10，可以達到促進線粒體更新的效果，從而延緩卵母細胞的衰老[37]。

4.3 C型利尿鈉肽

C型利尿鈉肽(CNP)作為減數分裂抑制劑，不僅可以優化卵母細胞核和質成熟的同步化程度，也對線粒體分布及功能產生影響。在牛卵母細胞IVM中，添加100 nmol/L CNP可顯著優化線粒體分布模式，提高線粒體含量、膜電位，降低ROS含量[38]。另外，在牛卵母細胞體外培養中，添加200 nmol/L CNP預處理6 h后再進行28 h IVM處理，卵母細胞ROS水平顯著降低，mtDNA拷貝數和線粒體膜電位顯著增加，從而促進牛卵母細胞胞質成熟[39]。此外，添加濃度為200 nmol/L CNP處理體外成熟的綿羊COCs后，線粒體更多地聚集在核和胞漿周圍，形成明顯團塊，可以為卵母細胞成熟過程提供大量能量[40]。CNP可能通過誘導與線粒體發育和抗氧化相關的mRNA轉錄物和增加蛋白質的相對豐度來提高卵母細胞質量。

4.4 酚類化合物

酚類化合物在自然界中數量眾多，從植物提取出的天然酚類化合物具有顯著的抗氧化作用，結構內的羥基能夠直接清除ROS，或者通過抑制促氧化基因表達，改善細胞氧化應激損傷[41-43]。白藜蘆醇是從葡萄、花生、虎杖、桑椹等植物中提取的一種天然抗氧化劑，通過增加線粒體數量及增強線粒體功能，促進顆粒細胞與卵母細胞之間的能量代謝改善卵母細胞發育環境[44]。在IVM培養基中添加0.5 μmol/L的白藜蘆醇能夠提高細胞內谷胱甘肽水平，促進綿羊卵母細胞的胞質成熟，從而支持后期胚胎高質量發育[45]。川陳皮素是一種具有廣泛生物學活性的多甲氧基黃酮類物質，在牛卵母細胞培養中添加25 μmol/L和50 μmol/L可以使線粒體表現出更高的活性，抵消IVM期間ROS過量產生的影響，改善卵母細胞核和質的成熟，以及隨后的牛胚胎發育質量[46]。原花青素存在于許多植物的果實、葉子和種子中，研究表明添加100 μmol/L的原花青素B1(procyanidin B1，PB1)處理豬卵母細胞，能夠降低活性氧生成以及細胞凋亡水平，增加線粒體膜電位水平和谷胱甘肽(glutataione，GSH)水平[47]。

4.5 褪黑素

褪黑素(melatonin，MT)屬于吲哚雜環類化合物，是由哺乳動物腦松果體分泌的胺類激素之一，是一種抗氧化劑。10-9mol/L MT處理的豬COCs中脂肪酸β-氧化和線粒體生物發生相關的基因表達顯著上調，脂肪酸、線粒體和ATP含量增加，為卵母細胞成熟和胚胎發育提供能量來源[48]。另有研究表明，高濃度MT(高于500 nmol/L)通過促進線粒體生物發生，消除毒素誘導的線粒體功能障礙，優化豬早期胚胎發育過程[49]。還有研究表明，添加MT后顯示卵母細胞線粒體膜電位顯著升高，細胞內ROS和Ca2+水平顯著降低，這也顯示了MT通過保護線粒體功能，促進未成熟卵母細胞健康發育[50]。

5 小結

綜上所述，常規獲得的未成熟卵母細胞經體外培養發育成熟，具備受精和后期胚胎發育能力，但是易造成胚胎質量及發育潛能降低。通過外源添加線粒體調節劑，優化卵母細胞IVM培養體系，能夠促進未成熟卵母細胞的核質同步化成熟，從而建立高效的胚胎體外生產體系，為人工輔助生殖以及良種快速快繁奠定技術支持。