基于表型組和轉錄組數據研究光對煙草早期幼苗發育的影響

曹廷茂 羅貞寶 劉奇源 張民 劉一靈 劉仁祥 李德侖 李振華

摘 ?要：為深入解析光對煙草早期幼苗發育的調控機理，以烤煙品種CV87為試材，設置12?h光周期和持續黑暗2個處理，采用表型組學研究了煙草種子培育第1～9天的形態變化，在此基礎上采用轉錄組學研究了其發育第4天基因表達網絡差異。結果表明，光下種子發芽勢和發芽率提高約30%，子葉開口長增加約2?cm，而下胚軸長度縮短約2?cm。在早期幼苗發育階段有551個基因差異表達受光誘導，其中364個表達上調，187個表達下調。551個基因中有28個在蛋白水平存在互作關系，其中包括、、等15個上調表達基因和、和等13個下調表達基因。GO富集表明，這28個DEGs主要與光合作用、光系統、植物激素響應有關。綜上所述，本研究解析了煙草早期幼苗發育過程中響應光信號的表型變化，并通過轉錄組分析挖掘到一些調控表型差異相關基因，這些結果為進一步研究光環境對煙草萌發和早期幼苗發育的影響提供了參考。

關鍵詞：種子萌發；早期幼苗發育；光信號；表型組；轉錄組；煙草

中圖分類號：S572.01???????????????????????文獻標識碼：A ?????????????????????文章編號：1007-5119（2023）05-0045-10

Study of Light-Regulated?Early Seedling Development in Tobacco through Phenomic and Transcriptomic Data?Analysis

CAO?Tingmao，?LUO?Zhenbao，?LIU?Qiyuan，?ZHANG?Min，

LIU?Yiling，?LIU?Renxiang， LI?Delun，?LI Zhenhua

（1. Bijie City Tobacco Company of Guizhou Province， Bijie， Guizhou 551700， China; 2. College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 3. College of Tobacco， Guizhou University， Key Laboratory of Tobacco Quality Research in Guizhou Province， Guiyang 550025， China; 4.Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang 550081， China）

To delve into the intricate mechanisms governing the regulation of early seedling?development in tobacco in response to light， the tobacco variety CV87 was chosen as the experimental material. Two treatments were implemented： a 12-hour light period and a continuous darkness， allowing for a comprehensive phenotypic study of morphological changes during the first nine days of tobacco seed incubation. Building upon this foundation， a transcriptomic analysis was employed specifically on the fourth day of development to investigate differential gene expression networks. The findings revealed that seed germination vigor and germination rate showed an increase of approximately 30% under light conditions. Furthermore， the elongation of cotyledon opening increased by approximately 2 cm， while the length of the hypocotyl decreased by approximately 2 cm. During the early stages of seedling development， 551 genes exhibited differential expression induced by light， with 364 genes?being?upregulated and 187 genes?being?downregulated. Among these 551 genes， 28 of them were found to interact at the protein level， including upregulated genes such as ， ， and ， as well as downregulated genes such as ， ， and . Gene Ontology （GO） enrichment analysis demonstrated that these 28 differentially expressed genes were primarily associated with photosynthesis， light systems， and plant hormone responses. In conclusion， this study elucidates the phenotypic variations during?early tobacco seedling development in response to light signals. Through transcriptomic analysis， several regulatory genes associated with the observed phenotypic differences were uncovered. These findings serve as a foundation for further research on the impact of light environment on tobacco germination and early seedling development.

?seed germination; early seedling development; light signaling; phenome; transcriptome;?tobacco

基金項目：國家自然科學基金項目（32060512、31860420）；貴州省煙草公司項目（201904）；貴州省科技廳項目{黔科合基礎ZK[2022]一般288}

作者簡介：曹廷茂（1979-），男，碩士，主要從事煙草育種及栽培技術研究。E-mail：caotingmao@sina.com。*通信作者，E-mail：zhli3@gzu.edu.cn

收稿日期：2023-01-08???????????????修回日期：2023-09-05

寡照是我國部分煙區早春季節典型的氣候特點，此時值烤煙育苗關鍵期，受該不良氣候影響，烤煙易出現出苗緩慢，苗齡長，苗羸弱，移栽后還苗期長，幼苗抗逆性弱等問題。近年來，補光設施的利用一定程度上緩解了該不良氣候的影響，但補光設施耗能耗資較大，規模化運用存在一定難度。

因此，解析光照調控煙草幼苗發育的分子機理，創制煙草抗逆種質對于未來烤煙生產具有重要意義。

植物通過光受體感受外界光質、光量和光周期調控幼苗發育。到目前為止，已在模式植物擬南芥中鑒定出13種光受體，其中，光敏色素（PHY）被認為是調控幼苗發育的主要光感受器。當種子在無光環境或土壤深處萌發后，幼苗的胚軸將向光生長，在幼苗頂端形成一個頂部彎鉤來保護幼嫩的莖尖分生組織，最終發育為胚軸細長且帶有頂部彎鉤的黃化苗。當幼苗伸出土壤或在白光條件下培育時黃化苗將轉綠，上述過程專業上分別稱之為暗形態和光形態建成。無光條件下光敏色素（PHYs）失活，導致光敏色素互作因子PIF（PIFs）和E3泛素連接酶COP1和SPA蛋白組成的E3泛素連接酶復合體（COP1/SPAs）積累，從而促進暗形態發生。在黑暗環境下，缺失會導致幼苗表現出光形態特征，如：下胚軸較短，子葉展開和頂端缺陷。在有光條件下，PHYs被激活，調節PIFs的降解和減除COP1/SPA復合體穩定性，導致下胚軸伸長蛋白HY5的積累，促進光形態建成。我國部分南方煙區在育苗階段易遭遇多霧、陰雨等天氣，加上塑料大棚薄膜的隔絕，特別是多年使用的育苗大棚，其透光度顯著降低，棚內往往出現寡照環境，致使煙苗出現莖稈細弱、葉色偏黃等暗形態建成特征，嚴重影響煙草移栽后的正常生長發育。

光是一種重要的環境因子，它幾乎參與調控烤煙生長發育的各個階段，如：種子萌發，幼苗發育、營養生長和生殖生長等。在幼苗發育階段，光亦抑制煙草下胚軸伸長，促進子葉展開，頂部彎鉤消失等。然而，關于光調控煙草幼苗發育的分子機理的研究卻較少。因此，本研究以煙草為試材，比較有光和無光條件下種子萌發和幼苗發育表型的差異；在此基礎上，以已經萌發的種子為試材，研究有光和無光條件下其基因表達差異，并通過Go富集和蛋白-蛋白互作網絡的研究方法，構建了光調控煙草早期幼苗發育的分子網絡。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗設計

試驗用CV87煙草種子，由貴州煙草研究所提

供。所有種子在授粉后40?d收獲，在熱風干燥機中40?℃機械干燥36?h。脫粒后的種子在室溫下保存，所有試驗在1個月內完成。試驗設2個處理，每個處理3次重復，分別在持續黑暗和12 h光/暗間斷的光周期條件下進行種子萌發和幼苗發育試驗，該試驗在0.8%的瓊脂發芽床上進行。在培育的第1～9天，通過3D-表型組學平臺比較2種環境下種子萌發和幼苗發育的表型變化。在培育第4天，即種子萌發完成后即將進入幼苗發育階段，將2個處理、3次重復共6個試驗樣品，每個樣品稱取0.5?g進行轉錄組測序，取樣部位為幼苗整體，比較2種處理的差異表達基因和信號通路，探析光調控幼苗發育的分子網絡。

1.2??試驗方法

1.2.1 ?種子萌發和幼苗發育??種子萌發試驗以及發芽率和發芽勢的測定參照本課題組已公開發表的方法。將100粒煙草種子按照10×10的規格均勻點播在0.8%的瓊脂發芽床表面，分別置于25?℃，12 h光周期和持續黑暗的人工氣候箱內萌發，每處理3次重復。從第1天開始記錄種子發芽數，每隔1天記錄1次種子萌發的數量，連續記錄至第14天為止。于第7天計算發芽勢和第14天計算發芽率。發芽勢=7 d萌發種子數/被測種子數×100%，發芽率=14 d內萌發種子數/被測種子數×100%。種子萌發和早期幼苗發育2個階段的界定標準參照本課題組已公開發表的方法，其中吸脹后第1至4天為種子萌發階段，吸脹后第6至9天為幼苗發育階段。

1.2.2 ?表型組數據??種子或幼苗表型測定參照文獻[23-24]。將3次重復，每個重復100粒種子放置在一個成像室內，通過Scanalyzer HTS（德國，LemnaTec公司）以天為單位獲得圖像。使用LemnaTec HTS系統中的Lemna Grid軟件處理圖像，測量種子（幼苗）的總周長、總面積以及胚根、胚軸、子葉的周長和面積。從第1到9天測定種子（幼苗）的總周長和面積。從第6到9天測定胚根、胚軸和子葉的周長和面積；此外，在第6到9天測量子葉彎曲率。

1.2.3 ?轉錄組測序??轉錄組測序參照本課題組已公開發表的方法。首先使用TRIzol試劑盒（天根生化科技，北京）提取萌發4 d后種子中的總RNA。隨后交由上海歐易生物技術有限公司進行轉錄組測序。通過NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Science，美國）檢測提取的RNA純度，通過Agilent 2100生物分析儀（Agilent Technologies，美國）檢測RNA的完整性。通過TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit（Illumina，美國）構建基因文庫。使用Illumina HiSeq X Ten平臺對文庫進行測序，并產生150?bp的成對末端讀序。通過Triomatic處理原始讀序。最后本課題組完成了數據分析，其中基因差異表達分析使用DESeq（2012）R包。<0.05，FC>2或<0.5以及FPKM＞1被用作差異表達的閾值。隨后，應用數學模型對轉錄組數據進行分析。篩選出了在發芽4?d的差異表達基因（DEGs），根據超幾何分布，用hiplot pro（https：//hiplot.com.cn/）的“GO/KEGG富集分析”進行基因本體Gene Ontology（GO）富集分析。

1.2.4 ?蛋白-蛋白互作網絡的建立??通過高通量測序獲得的差異表達基因來預測對應蛋白之間的相互作用網絡，有助于挖掘核心調控基因。基于Genemania在線數據庫（https：//genemania.org/）將所有基因名稱整理到一個列表，預測差異表達基因的互作關系。

1.2.5 ?RT-PCR??為驗證RNA測序的結果，在光合作用和碳代謝通路上隨機選擇10個表達差異較大的基因進行qRT-PCR驗證，選擇作為內參，反應體系參照文獻[26]，對qRT-PCR的相對表達水平和RNA-seq的FPKM值進行相關性分析，并根據相關系數分析RNA-seq測序結果的準確性。引物序列如表1所示。

1.2.6 ?統計分析??采用SPSS Statistics 25對處理數據進行方差分析和多重比較，采用Graphpad prism v9.5.0.730對數據進行整理并作圖。

2 ?結 ?果

2.1??光照對煙草早期幼苗發育的影響

由表2可知，相比于黑暗處理，12?h光周期處理的種子發芽率提高了約30%，差異顯著（＜0.001）。由圖1可知，12?h光周期處理和黑暗處理下萌發過程中的種子周長和面積差異不顯著，而萌發后的幼苗面積差異顯著（＜0.001或＜0.01）。其中，在發育的第6～7天，黑暗處理的幼苗周長和面積顯著高于12?h光周期處理（＜0.001或＜0.01）；第8天，兩個處理周長仍存在顯著差異（＜0.001），而面積差異不顯著；而第9天，12?h光周期處理的幼苗面積顯著高于黑暗處理（＜0.001）。以上結果說明光照影響種子的萌發率，但不影響種子的萌發表型；對幼苗發育表型影響較大。

由圖2可知，從發育第7天始，黑暗處理下幼苗的胚軸長顯著高于12 h光周期處理（＜0.001），在發育的第9天，下胚軸長度最終增加了約2?cm。在發育的第7天，黑暗處理的胚根長度顯著大于12?h光周期處理（＜0.05）；而在發育的第9天，黑暗處理的胚根長度顯著小于12?h光周期處理（＜0.01）。由圖3可知，從發育第7天始，黑暗處理下子葉面積顯著大于12?h光周期處理（＜0.001）。從發育第7天始，黑暗處理下幼苗的子葉開口長度顯著小于12?h光周期處理，直至發育的第9天，子葉開口約縮短了2?cm（＜0.05或＜0.001）。綜上所述，光環境顯著影響了煙草種子的發芽指標和幼苗發育表型。相比于黑暗環境，12?h光周期更加適宜種子萌發。而在幼苗發育階段，黑暗環境會減少幼苗的子葉開口開度，增加下胚軸長度（圖4）。

2.2??光照對煙草幼苗發育早期基因表達水平的影響

利用Illumina平臺對12?h光周期和黑暗處理第4天的樣品進行轉錄組測序，獲得551個差異表達基因（Different expression genes， DEGs），其中364個上調、187個下調。對551個差異表達基因進行蛋白質互作網絡分析，發現28個基因在蛋白水平存在互作關系（表3），其中等15個基表達上調。是類囊體膜蛋白基因，該蛋白與色素分子結合形成捕光色素蛋白復合體，而光捕獲蛋白是綠色植物PSI的核心。、、、和等5個基因為膜內周蛋白基因，是正確組裝PSI所必需的。編碼葉綠體3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPA亞基，而葉綠體3-磷酸甘油醛脫氫酶是催化卡爾文循環促進CO固定的關鍵酶。以上結果說明，在幼苗發育早期光照可能會促進PSI形成和卡爾文循環。等13個基因表達下調。、、、等4個基因參與調控種子脫水、休眠和早期胚發育。和參與油脂代謝。響應逆境反應。以上結果說明在早期幼苗發育階段光照可能會抑制種子休眠和油脂代謝。

2.3 ?光照對煙草幼苗發育早期信號通路的影響

由圖5可知，不同光照條件下煙草幼苗發育早期差異表達基因通過GO富集分成3個部分：生物過程（Biological processes，BP）、分子功能（Molecular functions，MF）和細胞組分（Cellular components，CC）。BP模塊包括葉綠素代謝過程、代謝物和能量的前體形成、光合作用、色素合成、卟啉類化合物代謝過程。MF模塊包括氧化還原酶活性、水楊酸結合和核糖體結構組成等。CC模塊包括葉綠體葡萄球體、葉綠體葡萄球體膜、光合作用膜、質體葡萄球體、質體葡萄球體膜和質體膜。以上結果說明，種子萌發后光主要促進葉綠素合成和光合作用。

2.4 ?RT-PCR驗證轉錄組測序結果

根據轉錄組數據，從代謝物和能量的前體形成、光合作用反應通路中隨機選取10個差異表達基因，通過RT-PCR對這些基因從種子萌發到幼苗發育過程中的表達趨勢進行動態分析，引物列表見表1。發現轉錄組測序FPKM值與RT-PCR基因相對表達量的皮爾遜相關系數普遍大于0.8，且所選的10個基因在幼苗發育的第4天時，兩種方法下表達趨勢一致（圖6）。

3 ?討 ?論

苗全苗壯是煙草高產高效栽培技術的基礎，但壯苗受到諸多因素制約，除種子質量外，漂浮育苗期間的光環境亦影響煙苗素質。楊興有等、劉國順等和鄒焱等研究表明，光照強度降低，煙苗高度增加，莖圍、葉片厚度、干物質積累等均降低。李鵬志等和黃建等研究表明調光膜處理可以改變光質，使煙苗生育進程均比普通膜處理提前，最終成苗期提前5 d。在自然環境下，光照是不斷變化的，常出現光環境與煙苗生長需求不協調的情況，在生產中易出現高腳苗、鐵稈苗和黃化苗等，嚴重影響烤煙生產。本研究比較了煙草幼苗在12 h光周期和持續黑暗下的表型動態變化，發現相比于12 h光周期環境，在持續黑暗環境下，煙草幼苗發育成了細長且黃化的高腳苗，不適宜的光環境嚴重阻礙了煙草幼苗的正常發育。

種子萌發始于靜止種子吸水膨脹，至胚根突破胚乳和種皮后露白而完成萌發。王素琴等研究表明光照對不同品種煙草種子發芽有顯著影響，而招啟柏等認為光不是煙草種子萌發的必要條件。宋碧清等根據光照對煙草種子發芽的影響程度，將煙草品種分為光照敏感型、中等光敏型和光照不敏感型3種類型，對于光照不敏感種子，它們在黑暗與光照條件下的發芽率差異不大，但光照能加快這些種子的發芽進程。Dong等和王堯等研究發現新采收的煙草種子萌發普遍需光，而后熟完成后種子萌發的光依賴性喪失。本研究試驗材料為新鮮采收的種子，12?h光周期環境下煙草種子發芽率約為89.23%，顯著暗環境下的發芽率52.61%，黑暗條件顯著抑制了新鮮煙草種子的萌發，這說明未完成后熟的種子并不會喪失光依賴性。

種子萌發完成后，將進入幼苗發育階段，也就是農民廣泛關注的“出苗”事件。在模式植物擬南芥中，光參與調控幼苗發育的相關研究已經取得顯著進展，與光形態相比，暗形態下胚軸更長，且形成了一個特異性組織頂鉤。PIFs和COP1/SPAs促進暗形態發生；而PHYs和HY5促進光形態發生。煙草與擬南芥的發育模式類似，光抑制幼苗的下胚軸伸長，促進子葉展開、頂鉤消失。本研究發現，在黑暗環境中生長的幼苗，其面積和直徑顯著高于12小時光周期處理的幼苗。此外，這些幼苗的下胚軸長度也顯著更長，子葉面積顯著更大，但子葉曲率顯著小于12小時光周期處理的幼苗。而在轉錄水平上，本研究未篩選到擬南芥同源基因和類似的信號通路。Liu等通過轉錄組和蛋白組聯合分析的方法也未篩選到參與煙草幼苗形態發育的光敏色素信號通路基因，今后需要通過遺傳學試驗進一步探究。本研究發現光促進家族6個光捕獲蛋白編碼基因表達上調，而參與調控種子成熟脫水、休眠和早期胚胎發育的、、、等4個基因表達下調。這可能表示暗環境促進了煙草種子休眠，并且抑制了煙草幼苗的捕光過程。

關于萌發后的種子是否也進行微弱的光合作用，目前仍不清晰。大洋洲海藻種子發芽期間就存在光合作用，以增強后續葉子和根部的生長。擬南芥種子在萌發初期便進行強烈的光合作用，而抑制其光合作用對萌發進程是有害的。在煙草種子完成萌發后，參與光合作用和葉綠體發育的信號通路就已經被激活，為苗期的光合作用做儲備。在本研究中，通過GO富集發現葉綠素代謝過程、代謝物和能量的前體形成、光合作用、色素合成、卟啉類化合物代謝等與光合作用相關生物學過程參與了煙草早期幼苗發育的調控。這說明煙草在幼苗期雖然光合面積很小，但光合作用、光系統、碳代謝基因在幼苗在光環境中的發育似乎仍起到重要的作用。

4 ?結 ?論

光照是調控煙草種子萌發和幼苗發育的一個重要環境因子，本研究通過表型組學定量分析了光參與調控的煙草種子萌發和早期幼苗發育的全過程，同時通過轉錄組學篩選出受光誘導表達的基因和信號通路，并通過qRT-PCR進驗證。研究發現，12?h光周期處理種子發芽勢和發芽率較黑暗處理顯著提高。光照不影響種子的萌發表型，但對幼苗發育表型影響較大；光抑制胚軸伸長，但促進子葉開展。光促進光捕獲蛋白家族的6個基因和膜內周蛋白、和?三個基因的表達，而抑制、、、、和和等11個基因的表達，這些基因的功能包括油脂代謝、調控種子休眠、光合作用、光系統的組裝和光系統的捕光等生物學過程。本研究解析了光調控煙草種子萌發的分子機制，可為今后煙草耐寡照育種提供了理論依據。

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