中藥防治病理性瘢痕的信號通路研究現狀*

趙 悅,趙文斌,郭 晴,郭媛媛,謝兵

(云南中醫藥大學第一附屬醫院/云南省中醫醫院,云南 昆明 650021)

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩,是創傷后傷口異常愈合所引起的皮膚纖維化疾病,中醫上又稱為蟹足腫或巨痕癥。臨床表現為色紅質硬的腫塊隆出正常皮膚表面,范圍局限或超過病灶,形狀不一,可伴有瘙癢、疼痛等異常感覺,或者發生攣縮、造成畸形,給患者的身心造成極大負擔。治療方法包括手術、激光、放射、物理加壓、注射激素等,雖然運用比較廣泛,但仍存在費用昂貴、容易復發、不良反應及副作用較多等問題。中藥治療病理性瘢痕歷史悠久,經驗豐富,近年來實驗研究發現其作用機制與成纖維細胞、炎癥反應、細胞外基質(ECM)、膠原代謝、肉芽組織及血管生成等有關。本文對近年來中藥通過調節信號通路影響病理性瘢痕形成的研究現狀綜述如下。

1 轉化生長因子-β(TGF-β)/激活素受體樣激酶(ALK)/Smads蛋白信號通路

轉化生長因子β(TGF-β)能夠誘導免疫細胞向傷口聚集,促進細胞外基質的產生,誘導成纖維細胞分化為肌成纖維細胞以及增加血管生成等能力,在瘢痕疙瘩的形成中發揮重要作用[1]。TGF-β中的TGF-β1是與增生性瘢痕形成最密切的生物活性因子。Smads蛋白家族是調節細胞內TGF-β的特異性蛋白質,它可以對活化的TGF-β受體復合物作出應答[2],是TGF-β信號傳導的關鍵介質[3]。Smad蛋白分為3類:Smad1、2、3、5被稱為通路限制 Smad;Smad4稱為普通Smad;Smad6、7是抑制Smad。ALK是TGF-β的Ⅰ型受體,與其配體結合傳導信號。

TGF-β活化后與絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結合,形成穩定的配體受體復合物,激活smads蛋白傳遞信號,作用于下游受體,從而調節靶基因轉錄,調控成纖維細胞增殖、分化及細胞外基質的合成。

1.1 體外實驗(包括病理性瘢痕成纖維細胞、增生性瘢痕成纖維細胞、瘢痕疙瘩成纖維細胞等) 林尊文[4]推斷粉防己堿抑制增生性瘢痕成纖維細胞的機制可能是通過誘導smad7表達和下調smad2,以阻斷下游信號通路傳導,從而抑制Ⅰ、Ⅲ膠原表達和細胞増殖。張浩等[5]發現莪術二酮通過下調TGF-β1/Smads信號傳導通路,促進膠原酶解,從而有效改善增生性瘢痕的發生與發展。有研究[6-8]表明,黃芪甲苷、黃芪總苷能抑制瘢痕HSF細胞增殖,誘導細胞凋亡,負向調控TGF-β1/Smads信號傳導通路。徐志山等[9-12]研究發現苦參堿、氧化苦參堿能影響自噬相關調控蛋白的表達,減少膠原合成,抑制TGF-β1/Smads信號傳導通路。TANG M等[13]發現人參皂苷Rg3抑制細胞遷移,減少膠原合成及血管生成,同樣可以達到下調TGF-β1/Smads信號傳導通路的目的。而芍藥苷可以誘導細胞自噬,抑制TGF-β1自分泌,減少α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達,從而抑制TGF-β1/Smads信號傳導通路[14-16]。SONG R等[17]探討發現綿馬素PB抑制細胞增殖和分化,減少膠原合成,下調 TGF-β1/Smads信號傳導通路。許小琪等[18]通過丹參酮ⅡA在體外抑制HSF細胞增殖、分化,抑制Smad2、3磷酸化,下調p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3的比值,減少VEGF和COL I膠原的分泌,推斷其可能與抑制TGF-β1/Smad信號通路有關。

唐黎黎[19]研究發現青蒿琥酯能夠下調瘢痕上皮細胞TGF-β1和整合素β1的表達,并上調MMP-1的表達。李戰等[20-21]研究證實青蒿琥酯下調HSF細胞中Smad3和I型膠原的表達,抑制結締組織生長因子,促進MMP-1表達,減少膠原沉積。

He S等[22]發現黃芪和丹參的提取物可通過介導TGF-β/Smad途徑,抑制膠原合成,減少瘢痕疙瘩的形成。復方芪參提取物的主要成分為黃芪總苷、黃芪多糖和丹酚酸,何淑芳[23]推論其可能是通過調控MAPK通路,間接影響TGF-β/Smad信號轉導,經不同途徑和多個靶點,共同發揮其抗瘢痕疙瘩作用。

青川復合物是由川芎素、青藤堿按2∶3比例配置的復合物。王暢研究發現青川復合物能夠抑制TGF-β1、p-Smad2/3、p-Smad4蛋白的表達,同時上調p-Smad7蛋白從而達到阻礙TGF-β/Smad信號通路傳導的目的,發揮抑制HSF細胞增殖和膠原蛋白合成以及誘導細胞調亡的作用[24]。

1.2 體內實驗(包括兔耳增生性瘢痕模型、裸鼠瘢痕疙瘩模型等) Hou Q等[25]發現局部施用仙鶴草、藕節、乳香、蒲黃的提取物能夠對TGF-β1/Smad通路產生雙向調節作用,可以促進傷口愈合,并且減輕瘢痕形成。王愛麗等[26]探討苦參素對裸鼠增生性瘢痕的抑制作用,發現苦參素涂膜劑能下調Smad3 mRNA和蛋白的表達,抑制TGF-β1/Smads信號通路,使瘢痕愈合率升高。王莎麗及周忠志等[27-28]的實驗研究結果證明,積雪草苷可抑制皮膚瘢痕的形成,使瘢痕厚度、炎癥反應、膠原沉積、成纖維細胞分化均減少,TGF-β1/Smads信號通路受到抑制。呂紅梅[29]研究發現姜黃素抑制增生性瘢痕形成的機制可能是通過調控TGF-β1/Smad2/3 信號通路,使得瘢痕顏色變淺,質地變軟。楊逸璇等[30]研究發現石榴皮多酚軟膏能夠降低TGF-β1、Smad4表達,調控TGF-β/Smad信號通路來抗增生性痤瘡瘢痕。

2 TGF-β1/Smad泛素化調節因子2(Smurf2)信號通路

泛素-蛋白酶體途徑是細胞中蛋白質選擇性介導及降解關鍵組分的重要途徑,其中的E3泛素連接酶可以泛素化降解細胞因子,從而在TGF-β1/Smad信號通路活性的調節中起到關鍵作用。據相關研究報道,E3泛素連接酶中的Smad泛素化調節因子2(Smurf2)能夠參與影響多種纖維化疾病的發生發展。

體外實驗研究中,王瑤等[31]發現補骨脂素可能通過TGF-β1/Smurf2信號通路,抑制α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的表達,起到抑制瘢痕形成的作用。

在此基礎上,劉昌玲[32]進一步研究推測,在增生性瘢痕成纖維細胞中,Smurf2 可能通過泛素化降解Smad7,減弱Smad7對TGF-β1信號轉導的負向調控作用,從而增強TGF-β1/Smad信號轉導,促進增生性瘢痕的形成。

3 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)由細胞外信號調節激酶(ERK)、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)以及p38組成。相關研究發現,大絲裂原活化蛋白激酶(BMK)/ERKS通路也與MAPK信號通路有關[33]。

3.1 細胞外信號調節激酶(ERK)信號通路 ERK是具有絲氨酸和蘇氨酸雙重磷酸化能力且分布于細胞質內的蛋白激酶,主要包含ERK1和ERK2,在生長活躍的增殖期瘢痕中ERK1和ERK2基因表達明顯偏高。ERK信號通路通過磷酸化的激活方式來調控細胞的生理功能。

體外實驗[34-35]研究中,五倍子中的單寧酸能夠調節miR-21/mTOR信號通路及miR-203的表達水平,抑制ERK1/2的磷酸化。張楠楠等[36]探討丹參抗成纖維細胞增殖的作用后發現,隱丹參酮能夠負向調控ERK/MAPK信號通路,下調MAP2K1及其下游MAPK1基因的表達,并促進caspase-3基因的表達,從而抑制HSF細胞增殖。Fan C等[37]發現紫草素通過ERK/Smad信號通路,減少TGF-β1誘導的膠原產生,下調瘢痕中的α-SMA表達,從而減弱細胞收縮。Tang M等[38]研究得到人參皂苷通過影響TGF-β/Smad和ERK信號通路,可以抑制增生性瘢痕的血管形成和細胞外基質沉積。朱君等[39]研究發現表兒茶素降低活性ERK1/2的蛋白表達,阻滯細胞周期,從而抑制成纖維細胞增殖。馬新蘋等[40]以不用濃度的白芍總苷處理瘢痕疙瘩成纖維細胞,結果發現其可以抑制纖維化標記蛋白Ⅰ型膠原α1鏈、Ⅲ型膠原α1鏈和α-SMA的表達,抑制ERK信號通路活化,誘導細胞凋亡。

3.2 P38/MAPK信號通路 P38/MAPK是合成膠原蛋白、刺激細胞外基質產生的正向調節劑,同時也是TGF-β1及α-SMA的傳導介質。

陳劍鈺等[41]通過體外實驗研究發現齊墩果酸通過激活p38和JNK通路線粒體死亡途徑,可以下調MMP-1、TIMP-1、P3I1、TGF-β1蛋白的表達,并上調MMP-2的表達,抑制瘢痕增生指數,增加膠原纖維的疏松度,從而誘導細胞調亡。

3.3 c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路 JNK信號通路同樣通過磷酸化活化參與影響細胞的生理功能。

體外實驗研究發現齊墩果酸能夠激活JNK通路從而誘導細胞調亡[41]。有研究報道,艾葉中的異澤蘭黃素能夠抑制PDGFβ蛋白的表達,促進JNK磷酸化和Bcl2表達,從而抑制PDGFβ/ERK通路,上調JNK/Bcl-2信號傳導通路,共同發揮誘導細胞凋亡的作用[42-43]。

復方芪參提取物對瘢痕疙瘩的作用機制,除了干擾TGF-β/Smad信號轉導通路外,還能調控MAPK通路[23]。其中p38通路負責調控Smad2/3磷酸化、Smad2/3/4復合物以及Smad7表達;ERK和JNK通路則負責調控Smad2/3磷酸化的轉位入核,以上均提示ERK、JNK和p38通路均參與調控靶基因PAI-1的轉錄活性及蛋白表達。

4 音猬因子(SHH)信號通路

Shh信號通路能夠調控細胞周期、誘導細胞凋亡。Shh激活后與其膜蛋白受體(Ptch)結合,同時釋放平滑蛋白(Smo)后激活核轉錄因子Gli,從而傳導信號。有學者研究發現Shh信號通路可以上調促凋亡基因從而誘導成纖維細胞的凋亡。

4.1 體外實驗 有研究表明,紫草素能夠下調Shh信號通路的下游基因Ptch-1和Gli-1的表達,影響凋亡相關蛋白(Cyclin D1、Bcl-2)的表達,從而誘導細胞凋亡[44],減少膠原合成和血管生成[45-46],可以推斷紫草素是通過阻斷Shh信號通路來達到抵抗成纖維細胞活化的作用。

康復新液聯合積雪苷霜軟膏可以明顯緩解增生性瘢痕的瘙癢、疼痛等癥狀,改善瘢痕的厚度、硬度、顏色等皮損形態,經實驗證明其原理可能是通過抑制Shh、Patch、Smo、Gli-1等不同因子,下調SHH信號通路活性,從而抑制成纖維細胞的過度增生[47]。

4.2 體內實驗 趙文斌等[48-49]研究發現傣藥咪多領(又名云南琵琶甲)能逆轉Hedgehog信號通路相關蛋白的表達,降低Nanog、Oct4以及SHH、Patch、Smo、Gli-1的表達水平。此外,研究還發現咪多領能上調miR-27b-3p,抑制GDF-6,從而抑制HSF細胞中GDF-6、COL1a2、COL3a1和α-SMA的表達水平。

5 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路

PI3K是生長因子受體中的重要因子,參與介導例如細胞骨架重組、細胞存活、細胞凋亡等多種重要的生物事件[50]。AKT又稱PKB或Rac,同樣參與細胞存活和凋亡的過程。mTOR屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的關鍵蛋白分子,可以影響蛋白質翻譯、基因轉錄以及成纖維細胞生長周期,激活下游底物,調控PI3K/Akt信號通路。除此之外,PTEN也具有拮抗信號通路活化的作用。總而言之,PI3K、Akt是信號通路傳遞的必要途徑,mTOR分子是信號通路作用的下游靶蛋白,都能調控纖連蛋白的表達。

如果發生與損傷相關的炎癥反應時,PI3K/Akt/mTOR通路的激活因子(包括表皮生長因子、促生長因子、胰島素和鈣調蛋白等)就會被釋放出來,首先激活PI3K磷酸化,然后磷酸化質膜上的Akt立刻激活下游的mTOR和金屬蛋白酶,從而控制成纖維細胞的生長以及纖維蛋白的表達[1]。

5.1 體外實驗 鹿曉蘭[51]研究發現中藥單體虎杖中的白藜蘆醇對瘢痕疙瘩TGF-β1/mTOR通路中TGF-β1、PI3K、mTOR等關鍵分子具有抑制作用;唐志銘等[52]觀察到白藜蘆醇能夠下調成纖維細胞中mTOR信號通路的關鍵分子Akt、mTOR的表達,從而抑制PI3K/Akt/mTOR信號傳導通路。相關研究[53-54]表明,莪術二酮除了與TGF-β1/Smads信號傳導通路有關外,還能夠下調PI3K/Akt/mTOR信號傳導通路[5]。三七皂苷R1可以下調PI3K/Akt信號傳導通路。WANG M等[55]研究發現紅豆杉中的紫杉醇能抑制細胞侵襲,阻滯細胞周期,減少炎癥反應,下調Akt信號傳導通路。綿馬素PB也可以下調PI3K/Akt信號傳導通路[17]。單寧酸同樣抑制Akt的磷酸化[34-35]。李娜[56]研究發現白僵蠶能夠有效抑制包括PI3K/Akt在內的多種分子信號通路。吳登艷等[57]不同濃度的黃芩苷對瘢痕的抑制作用,發現其通過下調PI3K/Akt/mTOR信號通路來抑制增生性瘢痕。SILB等[58]研究發現槲皮素可以降低Akt的磷酸化,抑制PI3K/Akt通路,同時抑制HIF-1。

5.2 體內實驗 據相關研究顯示,由黑醋、五倍子、蜈蚣、丹參、威靈仙、地骨皮、白礬等中藥成分組成的五倍子瘢痕膏,也能夠抑制PI3K/Akt/mTOR 信號傳導通路[34]。

6 Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路

Wnt信號通路已被證明在細胞增殖、分化、凋亡、成活、遷移等在內的各種功能中起著關鍵性作用。Wnt/β-catenin信號的相關分子(如Wnt3a、Wnt5a等)能夠影響成纖維增殖、遷移和膠原生成的過程,參與瘢痕疙瘩的發病機制。在Wnt/β-catenin信號轉導通路中,糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是Wnt的下游信號分子,是β-catenin的上游信號分子。Wnt/β-catenin信號轉導通路主要受控于GSK-3β的磷酸化[59]。

6.1 體外實驗 費猛[53]研究表明三七皂苷R1除了能下調PI3K/Akt信號傳導通路外,還能抑制GSK-3β的磷酸化,下調Wnt/β-catenin信號傳導通路。紫杉醇同樣影響多個信號通路,不僅下調Akt信號傳導通路,還下調GSK-3β信號傳導通路[55]。

6.2 體內實驗 秦慧真等[60]整理歸納了積雪草苷治療多種疾病的復雜藥理作用,其中有關積雪草苷抑制瘢痕增生、修復皮膚損傷的作用機理是能夠抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原、抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的表達,負向調控Wnt/β-catenin信號通路的活性,同時上調TGF-β1、血管內皮生長因子、一氧化氮合酶、單核細胞趨化蛋白1的表達等。

7 其他

雖然以下信號通路的相關文獻還有待完善,但作為影響病理性瘢痕的重要環節,其也有望成為中藥防治病理性瘢痕的新方向、新靶點。

7.1 JAK/STAT信號通路 JAK/STAT通路中最重要的是STAT3分子[61]。細胞因子在組織損傷后大量釋放,同時Janus激酶磷酸化STAT3,激活細胞因子轉錄應答基因[62]。STAT3在細胞增殖、遷移以及產生炎癥反應等多種影響瘢痕的因素調控中起著主導作用[63]。

7.2 整合素信號通路 整合蛋白家族由主要細胞表面受體及整合素受體等組成,和ECM相互作用介導信號轉導,參與調控生長因子、應答機械信號、調控細胞骨架重組等多種過程[64]。

7.3 TLR通路 Toll樣受體(TLR)激活炎癥反應,拮抗TGF-β阻滯劑發揮作用,在瘢痕疙瘩形成與發展過程中具有促進作用。其中TLR6、7、8在瘢痕疙瘩中表達明顯上調。

7.4 上皮—間質轉化通路 上皮—間質轉化(EMT)是指細胞由上皮細胞轉變為間充質細胞的變化過程[61]。EMT過程中涉及到TGF-β、Smad、HIF-α、TNF-α、IL-1α、IL-1β等目前對于瘢痕疙瘩機制研究中幾乎所有的分子。因此,EMT及其通路的發現能大大拓寬瘢痕疙瘩機制研究的道路[65-66]。

8 小結

病理性瘢痕的發病機制和影響因素非常復雜,本文只針對近年來中藥與病理性瘢痕形成的相關信號通路做了簡要闡述,但仍存在一些不足。首先,上述幾種信號通路之間的關系還未完全明確。其次,由于中藥單體或復方制劑的有效成分在相關文獻中沒有具體數據統計,因此不能對每種成分進行比較分析。此外,文獻的研究方法以體外瘢痕成纖維細胞實驗為主,基于體內研究的動物模型相對較少。最后,作用機制大多探究通路相關的重要環節,例如調控基因表達、磷酸化蛋白、激活下游信號分子等。因此后續可著重于信號通路之間、中藥有效成分比較、動物模型或其他研究水平和藥理作用等方面進行深層次研究。

隨著信號通路相關研究的不斷深入,醫學對病理性瘢痕的治療靶點也愈發精確。相信未來可以為中藥預防和治療病理性瘢痕提供嶄新的研究思路,以獲得更加高效低毒的臨床中藥制劑。總而言之,祖國醫學的寶貴財富還有待我們繼續探索和挖掘。