中國(guó)東海倪氏異冒藻(Heterocapsa niei)的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)及其分子特征*

冷天澤 顧海峰 王瑞芳, 3 郭卓然 陸斗定 戴鑫烽

中國(guó)東海倪氏異冒藻()的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)及其分子特征*

冷天澤1顧海峰2王瑞芳1, 3郭卓然1陸斗定1戴鑫烽1①

(1. 自然資源部海洋生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 自然資源部第二海洋研究所 浙江杭州 310012; 2. 自然資源部海洋生態(tài)保護(hù)與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 自然資源部第三海洋研究所 福建廈門(mén) 361005; 3. 浙江大學(xué)海洋學(xué)院 浙江舟山 316000)

異冒藻屬()包含多種可致有毒有害赤潮的物種, 其中2019年在福建近海赤潮中分離的倪氏異冒藻()被證明有毒, 然而對(duì)其超微形態(tài)結(jié)構(gòu), 特別是對(duì)作為該屬重要的分類(lèi)保守特征的體鱗, 研究還不充分。利用多種形態(tài)學(xué)方法和ITS片段分析了從廈門(mén)灣附近分離的藻株(SIO-H3), 形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)結(jié)果都顯示該藻株屬于倪氏異冒藻。其細(xì)胞呈雙錐形, 長(zhǎng)14.3～18.2 μm, 寬8.4～10.9 μm,甲板方程式為Po, cp, 5′, 3a, 7″, 6c, 5s, 5″′, 2″″。同時(shí), 發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與之前描述不同的形態(tài)特征, 該藻株細(xì)胞具有多個(gè)蛋白核(pyrenoid)和兩種形態(tài)體鱗(body scale): 一種體鱗基底層(basal layer)為粗網(wǎng)狀紋, 上層中心處有一長(zhǎng)中心刺(central spine)向上立起, 中心刺所在位置等長(zhǎng)向外輻射三根中心脊(central ridge), 中心脊末端有三根直立的次長(zhǎng)外圍刺(sub-peripheral spine); 另一種體鱗有三層結(jié)構(gòu), 其中基底層為致密網(wǎng)狀紋, 并有三個(gè)次中心孔(sub-peripheral pore), 中層和頂層各有一三叉中心脊。該研究改變了異冒藻分類(lèi)研究中一種異冒藻對(duì)應(yīng)一種體鱗結(jié)構(gòu)的觀點(diǎn)。

異冒藻; 體鱗; 蛋白核; 赤潮; 分類(lèi)學(xué)

異冒藻屬()是一類(lèi)重要的具殼板的甲藻, 包含一些赤潮種, 如環(huán)鱗異冒藻(Horiguchi)、極小異冒藻(Loeblich Lii)、圓形異冒藻(Hansen)、斯氏異冒藻(Tillmann)和渤海異冒藻(J Xiao & R Li)(Baek, 2011; Tas, 2015; Sunesen, 2020), 由其形成赤潮的區(qū)域包括溫帶和亞熱帶海域的絕大多數(shù)海區(qū)(Tas, 2015; Ojam?e, 2016; Xiao, 2018)。其中環(huán)鱗異冒藻和渤海異冒藻產(chǎn)毒, 尤其環(huán)鱗異冒藻因其赤潮期間多次引起魚(yú)蝦死亡而備受關(guān)注(Hansen, 1995; Baek, 2011; Millette, 2017)。

異冒藻屬是Stein在1883年建立的, 但由于早期缺少清晰的形態(tài)學(xué)特征描述和分子學(xué)數(shù)據(jù), 其模式種有過(guò)變動(dòng)。Stein最初在三角薄甲藻(Ehrenberg)的基礎(chǔ)上建立了該屬的模式種為三角異冒藻(Stein)(Tillmann, 2017), 130年后, 依據(jù)更清晰的形態(tài)學(xué)和分子學(xué)特征, Gottschling等(2019)建議將三角異冒藻改為T(mén)illmann, 而把斯氏異冒藻定為異冒藻屬的模式種(Tillmann, 2017)。在Morrill等(1981)描述了該屬的完整甲板方程式之后, 甲板的排列方式成為該屬種間鑒定的重要參考依據(jù)(Iwataki, 2008)。到目前為止, 異冒藻屬一共包含29個(gè)種(Hanifah, 2022; Wu, 2022), 該屬公認(rèn)的甲板方程式為Po, cp, 5′, 3a, 7″, 6c, 5～8s, 5″′, 0～1p, 2″″(Tas, 2015)。異冒藻屬不同種之間的細(xì)胞大小差異較大, 如微小異冒藻(Pomroy)長(zhǎng)為7.4 μm, 而太平洋異冒藻(Kofoid)長(zhǎng)為45 μm (Pomroy, 1989; Iwataki, 2008)。體鱗是異冒藻屬一個(gè)十分重要的分類(lèi)保守特征, Iwataki等(2004)提出可以根據(jù)不同特征的體鱗來(lái)進(jìn)行種間區(qū)分。20世紀(jì)80年代, 在香港暴發(fā)了多次環(huán)鱗異冒藻赤潮, 這是首次在中國(guó)海域報(bào)道異冒藻(Iwataki, 2002a)。之后, 在東海發(fā)現(xiàn)了微小異冒藻和斯氏異冒藻(劉瑞玉, 2008)。近幾年, 多次在長(zhǎng)江口、大連和青島近岸檢測(cè)到環(huán)鱗異冒藻和圓形異冒藻(王金輝等, 2006; 劉霜等, 2014)。2008和2012年, 在遼寧盤(pán)錦養(yǎng)殖池中暴發(fā)了赤潮, 造成大量蝦和中華絨螯蟹幼蟲(chóng)死亡, 最后該赤潮原因種被描述為一個(gè)新種: 渤海異冒藻(Xiao, 2018; 馮彤彤, 2019)。2019年, 福建霞浦暴發(fā)的赤潮導(dǎo)致大量鮑魚(yú)死亡, 分離出的堀口異冒藻()、極小異冒藻和倪氏異冒藻對(duì)鹵蟲(chóng)有致死效應(yīng), 且在有光照時(shí)對(duì)兔的紅細(xì)胞有溶血性(Wu, 2022)。這是倪氏異冒藻在中國(guó)首次被報(bào)道, 林森杰教授團(tuán)隊(duì)對(duì)其形態(tài)學(xué)和分子學(xué)做了一定的描述(Wu, 2022)。本次研究是在此基礎(chǔ)上開(kāi)展的更為細(xì)致的超微形態(tài)學(xué)研究, 并詳細(xì)闡述了多層膜藻類(lèi)的激光共聚焦顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡樣品和體鱗染色制作過(guò)程, 希望能給后來(lái)者提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻株分離與培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)藻株(編號(hào): SIO-H3)于2016年6月在福建省廈門(mén)灣采用單細(xì)胞分離法得到。采用f/2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)(Guillard, 1975), 取遠(yuǎn)洋海水, 用0.2 μm GF/F膜進(jìn)行過(guò)濾, 加入純水調(diào)節(jié)鹽度在31～33, 于121 °C下高溫高壓滅菌30 min, 濃縮培養(yǎng)基和滅菌海水以1 mL︰1 L比例進(jìn)行配置。培養(yǎng)環(huán)境溫度(20±1) °C, 光照強(qiáng)度130 μmol/(m2·s), 光照周期12 h︰12 h (光︰暗)。

1.2 光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察

取1 mL指數(shù)生長(zhǎng)期的藻株培養(yǎng)液,置于光學(xué)顯微鏡(BX53, Olympus, 日本)下觀察并拍照,使用Olympus cell Sens Standard 2.3 (Olympus, 日本)軟件測(cè)量細(xì)胞大小, 測(cè)量細(xì)胞數(shù)50個(gè)或以上。利用激光共聚焦顯微鏡觀察葉綠體和細(xì)胞核的形態(tài)和分布特征, 為觀察到細(xì)胞核, 在拍攝前, 加入SYBR green I (Sigma- Aldrich, 上海, 中國(guó), 終濃度0.1 μg/mL)試劑進(jìn)行染色30～60 s, 在630× (TCS SP5 II, Leica Mannheim, 德國(guó))下拍攝。

1.3 掃描電子顯微鏡樣品處理

1.3.1 固定 取2 mL指數(shù)期藻液于2 mL離心管中, 以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min (22331, Eppendorf AG, Hamburg, 德國(guó)), 去除上清液, 加入1.5 mL 2.5%濃度戊二醛溶液(鹽度30)中固定(生工生物工程(上海)股份有限公司,中國(guó)), 于冰箱內(nèi)4 °C冷藏過(guò)夜。

1.3.2 脫鹽和脫水 用天然滅菌海水(鹽度30)和純水配置不同鹽度梯度(海水與純水體積比依次為9︰1, 7︰3, 5︰5和3︰7)混合處理液, 將樣品浸入其中進(jìn)行脫鹽, 每個(gè)梯度30 min, 最后用純水進(jìn)行兩次30 min的脫鹽。再用30%、50%、70%、90%和100%濃度系列乙醇進(jìn)行梯度脫水, 每一步30 min, 最后用100%乙醇再進(jìn)行一次30 min脫水處理。

1.3.3 干燥、噴金和觀察 樣品干燥使用二氧化碳臨界點(diǎn)干燥儀(大連卓爾高科技有限公司, 中國(guó)), 將干燥艙溫度調(diào)節(jié)至10 °C, 之后放入樣品, 充入二氧化碳液體, 待液體覆蓋樣品后, 等待5 min, 之后排氣, 充-排氣一共循環(huán)3次。然后用導(dǎo)電膠將樣品貼到銅制載物臺(tái)上, 進(jìn)行表面噴金處理(MSP-1S, Vacuum Device, 日本), 樣品制作完成。利用掃描電子顯微鏡(Ultra 55, Zeiss, Carl 115 Zeiss AB, 德國(guó))進(jìn)行拍照, 照片通過(guò)軟件Adobe Photoshop 2021 (Adobe Systems, San Jose, California, 美國(guó))進(jìn)行后期處理。

1.4 透射電子顯微鏡樣品處理

1.4.1 固定 取2 mL指數(shù)生長(zhǎng)期藻液于2 mL離心管中以3 000 r/min離心5 min (22331, Eppendorf AG, Hamburg, 德國(guó)), 去除上清液后, 加入1.5 mL 2.5%濃度的戊二醛溶液(鹽度30天然滅菌海水配置), 室溫下固定4 h。之后用中性磷酸緩沖液漂洗樣品3次, 每次15 min, 再用鋨酸溶液(鹽度30滅菌天然海水配置, 終濃度1%)固定1～2 h, 用中性緩沖液洗滌3次, 每次15 min。

1.4.2 脫水 將上述樣品依次置于梯度濃度(30%, 50%, 70%, 80%, 90%和95%)乙醇溶液中, 每個(gè)梯度15 min, 用100%乙醇和丙酮(100%濃度)依次再各脫水20 min。

1.4.3 滲透與包埋 在室溫下, 將上述樣品加入到用Spurr包埋劑(SPI-CHEM, 美國(guó))與丙酮的混合液(體積比1︰1)中滲透1 h, 再加入到用Spurr包埋劑與丙酮的混合液(體積比3︰1)中滲透3 h, 之后加熱100% Spurr包埋劑到70 °C, 包埋樣品, 過(guò)夜。

1.4.4 切片、染色和觀察 過(guò)夜包埋后的樣品用超薄切片機(jī)(Leica Microsystems, Buffalo Grove, 美國(guó))切片, 獲得厚度70～90 nm的細(xì)胞切片; 切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液、醋酸雙氧鈾(SPI-CHEM, 美國(guó))和50%乙醇溶液各染色5～10 min后在透射電鏡(Hitachi-Science & Technology, 日本)中觀察。

1.4.5 體鱗染色觀察 吸取一滴指數(shù)生長(zhǎng)期藻液于網(wǎng)狀碳支持膜(Formvar-coated)上, 然后用暖燈照射等待液滴干燥后, 用雙蒸水洗滌3次, 之后用乙酸鈾酰水溶液(2%濃度)染色10 min, 著色后的體鱗在透射電鏡下觀察。

1.5 DNA提取, PCR擴(kuò)增和測(cè)序

取200 mL指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液(密度超過(guò)10 000 cells/mL)進(jìn)行離心收集, 采用DNA提取試劑盒(TaKaRa Mini BEST Plant Genomic DNA Extraction kit, 寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)進(jìn)行DNA提取, 提取方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將提取的基因組DNA作為PCR反應(yīng)模板來(lái)擴(kuò)增ITS序列,擴(kuò)增引物為T(mén)its(+)和Tits(-)(唐祥海等, 2006)。于0.2 mL PCR管中, 配置20 μL反應(yīng)體系: 10 × PCR buffer, 2 μL dNTP (2.5 mmol/L), 正向引物與反向引物各1 μL, 超純水12.8 μL, 0.2 μL Takara Ex Taq polymerase (5 U; TaKaRa, Osaka, 日本)和1 μL DNA。使用PCR擴(kuò)增儀T100TMThermal Cycler (Bio-Rad, CA, 美國(guó))進(jìn)行ITS片段基因擴(kuò)增, PCR程序如下: 95 °C下預(yù)變性5 min; 95 °C下變性30 s, 52 °C退火30 s, 72 °C延伸90 s, 共35個(gè)循環(huán); 72 °C延伸90 s。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,然后選取條帶清晰的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送于生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)序所得DNA正反向序列用Contig C Express軟件拼接查看并進(jìn)行編輯。將編輯好的序列放入基因庫(kù)(NCBI)進(jìn)行比對(duì)并選擇下載構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)所需的序列。使用Bio Edit v7.0.5 (Hall, 1999)軟件將目標(biāo)藻株提取的序列與從GenBank中下載的序列進(jìn)行對(duì)比及整理, 切除首尾多余堿基, 利用MEGA-11構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 采用最大似然法和鄰接法計(jì)算相似度。

2 結(jié)果

2.1 顯微光學(xué)和激光共聚焦照片

倪氏異冒藻為一種浮游甲藻, 細(xì)胞呈雙錐形, 形似花生, 通過(guò)對(duì)50個(gè)以上指數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量, 該藻株體長(zhǎng)14.3～18.2 μm [平均(16.1±2.1) μm], 體寬8.4～10.9 μm [平均(9.6±1.4) μm], 長(zhǎng)寬比1.3～2.2, 上錐(8.4～10.9 μm)與下錐(9～10.9 μm)寬基本相當(dāng)(圖1a～1c)。葉綠體遍布周身(圖1a～1c黃褐色和1e～1f紅色區(qū)域), 細(xì)胞核呈球狀(圖1d和1f綠色區(qū)域), 能看到游動(dòng)鞭毛(圖1a), 有多個(gè)蛋白核(pyrenoid), 呈透明液滴狀(圖1c)。

注: 圖a: 腹面觀; 圖b～c: 背面觀; 圖d～f: 使用細(xì)胞核染色劑SYBR Green I染色后的細(xì)胞核(綠色)和葉綠體(紅色)。py: 蛋白核; ab: 聚集體; n: 細(xì)胞核; lf: 鞭毛。比例尺: 5 μm

2.2 掃描電鏡照片

本實(shí)驗(yàn)藻株(SIO-H3)的甲板方程式為Po, cp, 5′, 3a, 7″, 6c, 5s, 5″′, 2″″ (圖2a～2d), 體鱗(body scale)分布于整個(gè)藻細(xì)胞表面(圖2e), 橫鞭毛纏繞在橫溝內(nèi)(圖2c), 體鱗的最小組成單元呈圓三角形, 邊長(zhǎng)在180～200 nm之間, 每個(gè)最小組成單元邊長(zhǎng)幾乎相等, 且每個(gè)最小單元被三條中心相連的脊(ridge)均分成3塊, 每一小塊的形狀和排列方式一致(圖2f)。

圖2 倪氏異冒藻掃描電子顯微鏡照片

注: 圖a, e: 腹面觀; 圖b: 背面觀; 圖c, d: 上錐部細(xì)節(jié); 圖e: 體鱗覆蓋細(xì)胞表面; 圖f: 體鱗細(xì)節(jié)特征。as: 溝前板; las: 左溝前板; lps: 左溝后板; rs: 右溝板; ps: 溝后板; cp: 頂板; po: 頂孔板; tf: 橫鞭毛。圖a～e比例尺: 2 μm; 圖f比例尺: 100 nm

2.3 透射電鏡照片

利用透射電鏡可以觀察到細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器的形態(tài)。細(xì)胞壁(膜)由多層膜構(gòu)成(圖3a～3b, 3f); 葉綠體位于細(xì)胞壁(膜)下方, 緊貼細(xì)胞壁(膜), 由許多片層堆疊而成(圖3a～3b, 3f); 細(xì)胞核位于下錐, 由多個(gè)棒狀染色體(interphase chromosome)聚集組成(圖3b, 3f); 多個(gè)蛋白核分布在細(xì)胞各個(gè)區(qū)域, 其橫截面近似圓形(圖3a～3b); 橫鞭毛孔周?chē)植贾w(basal body)(圖3a); 淀粉鞘(starch sheath)橫截面呈橢圓形, 比蛋白核大(圖3a)。細(xì)胞存在兩種不同形狀的體鱗(圖4): 一種邊長(zhǎng)為328～406 nm(所測(cè)體鱗數(shù)目>10個(gè)), 底層為粗網(wǎng)狀紋理的近圓三角結(jié)構(gòu), 每個(gè)鱗片上層正中央有一直立中心刺(central spine), 以此為中心呈約120°角向外輻射出三根中心脊(central ridge, 長(zhǎng)約100 nm), 在中心脊末端有1根與直立中心刺平行的外圍刺(peripheral spine), 同時(shí)中心脊末端分別向兩側(cè)再以約120°角輻射出相對(duì)細(xì)長(zhǎng)的拱形外圍脊(peripheral ridge), 3個(gè)底層外圍脊末端之間通過(guò)拱形外圍脊相連形成3個(gè)鐘形曲線結(jié)構(gòu)(圖3c～3d, 3k～3m, 4a), 拱形外圍脊與底層交匯處共長(zhǎng)有6根相對(duì)較短的次長(zhǎng)外圍刺(sub-peripheral spine)(圖3d～3k), 故每個(gè)鱗片由1根中心刺、3根中心脊、3根拱形外圍脊、3根底層外圍脊、3根外圍刺和6根次長(zhǎng)外圍刺組成, 拱形外圍脊與中心脊、外圍刺和中心刺一起構(gòu)成一個(gè)凸起立體結(jié)構(gòu)(圖3d, 3k～3m); 另一種鱗片呈圓角內(nèi)凹邊三角形, 邊長(zhǎng)為290～575 nm (所測(cè)體鱗數(shù)目>10個(gè)), 鱗片有三層結(jié)構(gòu), 基底層為致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu), 有3個(gè)次中心孔, 外邊緣有共有15條立柱(upright), 立柱頂端變尖成短刺(有6根立柱無(wú)短刺, 圖3b), 橫脊(horizontal beam)將15根立柱頂端連接起來(lái), 橫脊所在平面為中層, 在中心以約120°角等長(zhǎng)向外輻射三根中心脊(central ridge), 將中層均分成三部分, 每部分的外形近似規(guī)則多邊形, 三根中心脊末端與橫梁相連構(gòu)成中間層, 與中心脊相鄰兩立柱無(wú)短刺, 中心脊所連橫梁上方有一“人”形斜脊, 斜脊最高處向上伸出一直立刺, 立刺近頂端位置向內(nèi)伸出3根中心脊, 匯交于體鱗中心點(diǎn)并構(gòu)成頂層, 頂層中心上方有一直立短刺(圖3h～3j, 4b)。

圖3 倪氏異冒藻透射電子顯微鏡照片

注: 圖a, b: 細(xì)胞縱切面; 圖f: 細(xì)胞橫切面; 圖c～e 和g～n: 體鱗; n: 細(xì)胞核; py: 蛋白核; bb: 基體; ch: 葉綠體; ss: 淀粉鞘; ic: 染色質(zhì)

圖4 倪氏異冒藻兩種體鱗結(jié)構(gòu)示意圖

注: a: 體鱗結(jié)構(gòu)1; b: 體鱗結(jié)構(gòu)2。1: 外圍刺; 2: (直立)中心刺; 3: 次長(zhǎng)外圍刺; 4: 中心脊; 5: 底層外圍脊; 6: 拱形外圍脊; 7: 短刺; 8: 斜脊; 9: 附中心; 10: 橫脊; 11: 立柱

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

本次實(shí)驗(yàn)藻株提取了一段包含18S、ITS和28S三個(gè)片段在內(nèi)的長(zhǎng)基因(用于建樹(shù)的ITS長(zhǎng)度為571 bp, NCBI登錄號(hào)為ON682372)。以微小原甲藻作為參考株, 與其他文獻(xiàn)中的異冒藻一起建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。利用最大似然法和鄰接法兩種方法構(gòu)建的發(fā)育樹(shù)其主干拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致, 其中個(gè)別節(jié)點(diǎn)略有不同(用“*”表示); 來(lái)自不同地區(qū)的三株倪氏異冒藻聚成一支, 其中: ON682372(廈門(mén)灣)和JN020158 (阿曼海)兩株的自展值(bootstrap values) 93/97, 這兩株與另一株(福建海域ON459702)的自展值為100/98 (圖5)。

圖5 基于ITS序列所構(gòu)建的異冒藻屬的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

注: 節(jié)點(diǎn)數(shù)字代表最大似然法(左)和鄰接法分析的置信值(右),省略70%以下置信值,可信度檢測(cè)1 000次

通過(guò)基于ITS分子序列的Jukes-Cantor遺傳距離矩陣比較發(fā)現(xiàn), 三株倪氏異冒藻的核苷酸差異為0.015 7和0.026 6, 與同屬藻株之間的核苷酸差異范圍為0.015 7～0.237 0, 與外屬微小原甲藻的核苷酸差異是0.431 7 (表1)。

3 討論

在溫帶和亞熱帶都暴發(fā)過(guò)多種異冒藻赤潮, 其呈現(xiàn)的地理擴(kuò)張需引起我國(guó)的重視(Matsuyama, 1997; Matsuyama, 2012; Tas, 2015; Benico, 2021; Choi, 2021)。2008和2012年, 在我國(guó)大連近岸養(yǎng)殖池中暴發(fā)了渤海異冒藻赤潮(Xiao, 2018)。2019年, 在福建海域赤潮暴發(fā)期間分離出的倪氏異冒藻、堀口異冒藻和極小異冒藻對(duì)鹵蟲(chóng)有致死性, 在有光條件下對(duì)兔的紅細(xì)胞具有溶血性(Wu, 2022), 這反映了在我國(guó)暴發(fā)各種有毒有害異冒藻赤潮可能性在增大。然而, 由于異冒藻細(xì)胞較小, 其種間形態(tài)特征不明顯, 存在一定的鑒定難度(Pomroy, 1989; Iwataki, 2008)。根據(jù)上錐和下錐大小比例可將該屬劃分成兩大類(lèi): 上錐比下錐大(北極異冒藻Horiguchi,披針異冒藻Iwataki & Fukuyo,微小異冒藻和圓形異冒藻), 其余種類(lèi)上錐和下錐大小基本一致(Iwataki, 2003; Iwataki, 2008)。倪氏異冒藻的長(zhǎng)度和寬度與北極異冒藻和渤海異冒藻(Iwataki, 2008; Rintala, 2010; Xiao, 2018)相當(dāng), 該藻是一種世界廣布種, 在西北太平洋(Morrill, 1983)、貝爾海(Belt Sea)(H?llfors, 2004)、日本(Yoshida, 2003)、廈門(mén)海域(Wu, 2022)和馬來(lái)西亞(Razali, 2022)均有檢測(cè)到, 且在馬來(lái)西亞野外環(huán)境中, 密度達(dá)到7 000 cells/L(Razali, 2022)。2018年福建福寧灣海域表層沉積物中檢出了倪氏異冒藻孢囊(王朝暉等, 2022), 一定程度上表明該藻在早期就可能在此海域發(fā)生過(guò)赤潮事件(黃海燕等, 2009)。

異冒藻與多種甲藻形態(tài)較為相似, 如環(huán)胺藻()(Luo, 2016)和別什萊藻() (Luo, 2013), 加之細(xì)胞較小, 其屬內(nèi)種間就更加難以區(qū)分。細(xì)胞核和蛋白核的相對(duì)位置是異冒藻屬種間鑒定的重要特征(Iwataki, 2008), 倪氏異冒藻、喜沙異冒藻(Tamura)和極小異冒藻的細(xì)胞核處于下錐部, 堀口異冒藻、卵形異冒藻(Iwataki & Fukuyo)和擬三角異冒藻()的細(xì)胞核位于蛋白核上方(Iwataki, 2008)。本實(shí)驗(yàn)藻株細(xì)胞核處于下錐底部(圖1a～1b, 1f), 結(jié)合細(xì)胞核位置(圖4b), 基本可以確認(rèn)在細(xì)胞核下方?jīng)]有蛋白核的空間, 即倪氏異冒藻蛋白核位于細(xì)胞核上方, 這和之前研究結(jié)果一致(Iwataki, 2008)。而且本藻株(SIO-H3)甲板方程式Po, cp, 5′, 3a, 7″, 6c ,5s, 5″′, 2″″ (圖2a～2d)與Iwataki(2008)描述一致。

在分類(lèi)學(xué)上, 異冒藻有一個(gè)明顯的特征是細(xì)胞表面布滿了體鱗(Morrill, 1981; Iwataki, 2008), 除異冒藻外, 目前只在Watanabe, Suda, Inouye, Sawaguchi & Chihara(Watanabe, 1987, 1990)和海洋尖尾藻(Dujardin)(Clarke, 1972, 1976)中見(jiàn)到過(guò)體鱗的詳細(xì)描述(Iwataki, 2003, 2004)。海洋尖尾藻的體鱗是扁平的, 呈橢圓形, 遍布細(xì)胞表面和鞭毛(Loeblich III, 1968; Pennick, 1977),.和異冒藻的體鱗是立體結(jié)構(gòu)(Iwataki, 2004)。異冒藻中第一個(gè)體鱗被清晰描述的物種是三角異冒藻(Pennick, 1977; Morrill, 1983)。隨著環(huán)鱗異冒藻(Horiguchi, 1995)、披針異冒藻和堀口異冒藻(Iwataki, 2002b)的體鱗也被逐漸詳述后, 體鱗被視為該屬一種重要的分類(lèi)保守特征用于屬內(nèi)物種鑒定(Iwataki, 2002c; Yoshida, 2003)。Iwataki等(2004)集中描述了12種異冒藻的體鱗特征, 提出利用體鱗基底形狀(the shape of basal plate)、中央孔(central hole)的有無(wú)和刺(uprights, spine, bars)的數(shù)量來(lái)區(qū)分不同異冒藻, 如斯氏異冒藻的基質(zhì)底部(basal plate)為三角形, 環(huán)鱗異冒藻為圓形, 披針異冒藻為六邊形(Iwataki, 2004); 披針異冒藻和圓形異冒藻有一個(gè)中央孔(central hole), 其他異冒藻則沒(méi)有或還沒(méi)發(fā)現(xiàn)(Iwataki, 2004); 三角異冒藻、圓形異冒藻、極小異冒藻、擬三角異冒藻、卵形異冒藻、東方異冒藻(Iwataki, Botes & Fukuyo)、Herman & Sweeney和堀口異冒藻在基底面上有6根脊(ridge), 披針異冒藻和倪氏異冒藻只有3根, 而北極異冒藻(Horiguchi T)有3或6根(Iwataki, 2004)。在之前的研究中, 倪氏異冒藻只報(bào)道了一種類(lèi)似圖4b的體鱗結(jié)構(gòu)(Iwataki, 2004; Iwataki, 2008), 不同的是, 次中心為刺而非本次研究觀察到的圓孔(圖3e～3f)。本次研究我們不僅在倪氏異冒藻中同時(shí)記錄到了兩種體鱗結(jié)構(gòu), 而且描述了一種新的體鱗結(jié)構(gòu)(圖3c～3d、3k～3n, 4a)。除倪氏異冒藻外, 北極異冒藻和環(huán)鱗異冒藻在不同的生長(zhǎng)階段也具有不同的體鱗(Iwataki, 2004), 成熟細(xì)胞的體鱗(mature scale)相比不成熟細(xì)胞的體鱗(immature scale)基底外形更圓潤(rùn), 層次更為豐富, 刺或脊(spine)更多更長(zhǎng); 圓形異冒藻和堀口異冒藻基底的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)隨著室內(nèi)培養(yǎng)多代后會(huì)消失(Iwataki, 2004)。雖然本次實(shí)驗(yàn)藻株采用的是指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞, 但是目前還無(wú)法完全排除這兩種體鱗為不同時(shí)期細(xì)胞所有。不同倪氏異冒藻藻株的體鱗邊長(zhǎng)也不相同, 如有210 nm (藻株編號(hào): UTEX1654)(Morrill, 1981), 300 nm (藻株編號(hào): CCMP447, NIES420和TG607-1)(Iwataki, 2004)和(290～433 nm)(藻株編號(hào): SIO-H3)。

此外, 在之前的文章中(藻株號(hào): UTEX1564), 只有一個(gè)或者兩個(gè)(細(xì)胞分裂時(shí))蛋白核(Iwataki, 2008), 而本研究中的倪氏異冒藻含有多個(gè)蛋白核, 這說(shuō)明倪氏異冒藻蛋白核數(shù)量存在多種可能。

ITS系列作為非編碼區(qū), 承受的選擇壓力較小, 相較于其他區(qū)域變化較大, 通過(guò)ITS系列的系統(tǒng)發(fā)育分析, 常常用于解決一些甲藻類(lèi)的分類(lèi)學(xué)模糊問(wèn)題(Yoshida, 2003; Wayne, 2007; Stern, 2012)。但使用ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化研究有條件性, 對(duì)分析對(duì)象的序列必須做出謹(jǐn)慎選擇和調(diào)整(謝子強(qiáng)等,2017)。在對(duì)基于ITS的甲藻物種內(nèi)和物種間遺傳距離的總體評(píng)估中, Wayne等(2007)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)不同甲藻間的未校正距離總是在0.04以上, 本實(shí)驗(yàn)中的藻株和另外兩株倪氏異冒藻在此區(qū)間內(nèi)。對(duì)于微小物種鑒定而言, 無(wú)論是傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法還是利用分子技術(shù)手段, 兩者都必須相互借鑒和補(bǔ)充(謝子強(qiáng)等, 2017)。

4 結(jié)論

根據(jù)對(duì)藻株(SIO-H3)形態(tài)學(xué)和分子特征研究, 以及相關(guān)的研究報(bào)告得到以下結(jié)論:

(1) 形態(tài)學(xué)特征和分子進(jìn)化發(fā)育分析證實(shí)該研究藻株為倪氏異冒藻。

(2) 先前研究倪氏異冒藻只有一個(gè)蛋白核, 本次研究發(fā)現(xiàn)倪氏異冒藻細(xì)胞質(zhì)中有多個(gè)蛋白核。

(3) 先前研究只觀察到倪氏異冒藻的一種體鱗形態(tài), 本次研究發(fā)現(xiàn)了倪氏異冒藻有兩種形態(tài)體鱗: 一種體鱗基底層為粗網(wǎng)狀紋路, 上層中心處有一長(zhǎng)中心刺向上立起, 中心刺所在位置等長(zhǎng)向外輻射三根中心脊, 中心脊末端有三根直立的次長(zhǎng)外圍刺(該種體鱗結(jié)構(gòu)為第一次報(bào)道); 另一種體鱗有三層結(jié)構(gòu), 其中基底層為致密網(wǎng)狀紋, 并有三個(gè)次中心孔, 中層和頂層各有一三叉中心脊。

(4) 一種異冒藻不唯一對(duì)應(yīng)一種體鱗分類(lèi)特征。

王金輝, 秦玉濤, 劉材材, 等, 2006. 長(zhǎng)江口赤潮多發(fā)區(qū)潛在有毒藻類(lèi)和赤潮毒素的初步調(diào)查[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 25(S1): 15-19.

王朝暉, 鄭虎, 王文婷, 等, 2022. 福建福寧灣表層沉積物中甲藻孢囊分布與多樣性研究[J]. 海洋與湖沼, 53(6): 1396-1404.

馮彤彤, 2019. 渤海異帽藻的毒性效應(yīng)及毒素提取研究[D]. 大連: 大連理工大學(xué).

劉瑞玉, 2008. 中國(guó)海洋生物名錄[M]. 北京: 科學(xué)出版社: 600.

劉霜, 張繼民, 張洪亮, 等, 2014. 青島近海赤潮災(zāi)害分級(jí)與時(shí)空分布及赤潮生物的變化[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志, 35(4): 43-47.

唐祥海, 于仁成, 顏天, 等, 2006. 中國(guó)沿海亞歷山大藻()核糖體rDNA部分序列分析及該藻屬分子系統(tǒng)進(jìn)化研究[J]. 海洋與湖沼, 37(6): 529-535.

黃海燕, 陸斗定,2009. 甲藻孢囊研究進(jìn)展[J]. 海洋學(xué)研究, 27(3): 85-92.

謝子強(qiáng), 廖寶林, 肖寶華, 等, 2017. 運(yùn)用ITS基因分析大鵬半島海域石珊瑚系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 37(4): 8-15.

BAEK S H, KI J S, KATANO T,, 2011. Dense winter bloom of the dinoflagellatebelow the thick surface ice of brackish Lake Shihwa, Korea [J]. Phycological Research, 59(4): 273-285.

BENICO G, LUM W M, TAKAHASHI K,, 2021. Thecal tabulation, body scale morphology and phylogeny ofsp. nov. (Peridiniales, Dinophyceae) from the Philippines [J]. European Journal of Protistology, 80: 125811.

CHOI H, KIM S, 2021.sp. nov. (Peridiniales, Dinophyceae): a new marine thecate dinoflagellate from Korean coastal waters [J]. European Journal of Protistology, 79: 125797.

CLARKE K J, PENNICK N C, 1972. Flagellar scales inDujardin [J]. British Phycological Journal, 7(3): 357-360.

CLARKE K J, PENNICK N C, 1976. The occurrence of body scales inDujardin [J]. British Phycological Journal, 11: 345-348.

GOTTSCHLING M, TILLMANN U, ELBR?CHTER M,, 2019.Ehrenb. is a species not ofF. Stein but ofEr. Lindem. (Kryptoperidiniaceae, Peridiniales) [J]. Phytotaxa, 391(2): 155-158.

GUILLARD R R L, 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates [M] // SMITH W L, CHANLEY M H. Culture of Marine Invertebrate Animals. New York, USA: Springer: 29-60.

HALL T A, 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT [J]. Nucleic Acids Symposium Series, 41: 95-98.

H?LLFORS G, 2004. Checklist of Baltic Sea phytoplankton species (including some heterotrophic protistan groups) [J]. Baltic Sea Environment Proceedings, 95: 1-208.

HANIFAH A H, TENG S T, LAW I K,, 2022. Six marine thecate(Dinophyceae) from Malaysia, including the description of three novel species and their cytotoxicity potential [J]. Harmful Algae, 120: 102338.

HANSEN G, 1995. Analysis of the thecal plate pattern in the dinoflagellate(Lohmann) comb. nov. (=(Lohmann) Loeblich) [J]. Phycologia, 34(2): 166-170.

HORIGUCHI T, 1995.sp. nov. (Peridiniales, Dinophyceae): a new marine dinoflagellate causing mass mortality of bivalves in Japan [J]. Phycological Research, 43: 129-136.

IWATAKI M, 2008. Taxonomy and identification of the armored dinoflagellate genus(Peridiniales, Dinophyceae) [J]. Plankton and Benthos Research, 3(3): 135-142.

IWATAKI M, BOTES L, SAWAGUCHI T,, 2003. Cellular and body scale structure ofsp. nov. andsp. nov. (Peridiniales, Dinophyceae) [J]. Phycologia, 42(6): 629-637.

IWATAKI M, HANSEN G, SAWAGUCHI T,, 2004. Investigations of body scales in twelvespecies (Peridiniales, Dinophyceae), including a new species.sp. nov. [J]. Phycologia, 43(4): 394-403.

IWATAKI M, WONG M W, FUKUYO Y, 2002a. New record of(Dinophyceae) from Hong Kong [J]. Fisheries Science, 68(5): 1161-1163.

IWATAKI M, TAKAYAMA H, MATSUOKA K,, 2002b.sp. nov. andsp. nov. (Peridiniales, Dinophyceae), two new marine dinoflagellates from coastal Japan [J]. Phycologia, 41(5): 470-479.

IWATAKI M, TAKAYAMA H, MATSUOKA K,, 2002c. Taxonomic study onwith special reference to their body scale ultrastructure [J]. Fisheries Science, 68(S1): 631-632.

LOEBLICH III A R, 1968. A new marine dinoflagellate genus,, in axenic culture from the Salton Sea, California with remarks on the genus[J]. Proceedings of the Biological Society of Washington, 81: 91-96.

LUO Z H, KROCK B, MERTENS K N,, 2016. Morphology, molecular phylogeny and azaspiracid profile of(Dinophyceae) from the Gulf of Mexico [J]. Harmful Algae, 55: 56-65.

LUO Z H, YANG W D, XU B,, 2013. First record of(Dinophyceae) from Chinese coasts, with morphological and molecular characterization of the strains [J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 31(4): 835-845.

MATSUYAMA Y, 2012. Impacts of the harmful dinoflagellatebloom on shellfish aquaculture in Japan and some experimental studies on invertebrates [J]. Harmful Algae, 14: 144-155.

MATSUYAMA Y, UCHIDA T, HONJO T, 1997. Toxic effects of the dinoflagellateon clearance rate of the blue mussel[J]. Marine Ecology Progress Series, 146: 73-80.

MILLETTE N C, PIERSON J J, ACEVES A,, 2017. Mixotrophy in: a mechanism for dominating the winter phytoplankton [J]. Limnology and Oceanography, 62: 836-845.

MORRILL L C, LOEBLICH III A R, 1981. A survey for body scales in dinoflagellates and a revision ofand(Pyrrhophyta) [J]. Journal of Plankton Research, 3(1): 53-65.

MORRILL L C, LOEBLICH III A R, 1983. Formation and release of body scales in the dinoflagellate genus[J]. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 63(4): 905-913.

OJAM?E K, PETERSON A, LIPS I, 2016. Dark nutrient uptake at low temperature and subsequent light use efficiency by the dinoflagellate[J]. Marine Biology Research, 12(9): 978-985.

PENNICK N C, CLARKE K J, 1977. The occurrence of scales in the peridinian dinoflagellate(Ehrenb.) Stein [J]. British Phycological Journal, 12(1): 63-66.

POMROY A J, 1989. Scanning electron microscopy ofsp. nov. (Dinophyceae) and its seasonal distribution in the Celtic Sea [J]. British Phycological Journal, 24(2): 131-135.

RAZALI R M, MUSTAPA N I, YAACOB K K K,, 2022. Diversity of(Dinophyceae) and the algal bloom event in the mariculture areas of Johor Strait, Malaysia [J]. Plankton and Benthos Research, 17(3): 290-300.

RINTALA J M, H?LLFORS H, H?LLFORS S,, 2010.subsp.subsp. nov. (Peridiniales, Dinophyceae)-description of a new dinoflagellate and its occurrence in the Baltic Sea [J]. Journal of Phycology, 46: 751-762.

STERN R F, ANDERSEN R A, JAMESON I,, 2012. Evaluating the ribosomal internal transcribed spacer (ITS) as a candidate dinoflagellate barcode marker [J]. PLoS One, 7(8): e42780.

SUNESEN I, RODRíGUEZ F, KUBIS J A T,, 2020. Morphological and molecular characterization ofsp. nov. (Peridiniales, Dinophyceae) from Buenos Aires coastal waters (Argentina) [J]. European Journal of Phycology, 55(4): 490-506.

TAS S, 2015. A prolonged red tide of(Ehrenberg) F. Stein (Dinophyceae) and phytoplankton succession in a eutrophic estuary in Turkey [J]. Mediterranean Marine Science, 16(3): 621-627.

TILLMANN U, HOPPENRATH M, GOTTSCHLING M,, 2017. Plate pattern clarification of the marine dinophytesensu Stein (Dinophyceae) collected at the Kiel Fjord (Germany) [J]. Journal of Phycology, 53(6): 1305-1324.

WATANABE M M, SUDA S, INOUYE I,, 1990.gen. et sp. nov. (Gymnodinaiales, Dinophyta), a green dinoflagellate with a chlorophyll- and-containing endosymbiont [J]. Journal of Phycology, 26: 741-751.

WATANABE M M, TAKEDA Y, SASA T,, 1987. A green dinoflagellate with chlorophyllsAandB: morphology, fine structure of the chloroplast and chlorophyll composition [J]. Journal of Phycology, 23: 382-389.

WAYNE LITAKER R, VANDERSEA M W, KIBLER S R,, 2007. Recognizing dinoflagellate species using ITS rDNA sequences [J]. Journal of Phycology, 43(2): 344-355.

WU X M, LIU Y L, WENG Y B,, 2022. Isolation, identification and toxicity of three strains of(Dinophyceae) in a harmful event in Fujian, China [J]. Harmful Algae, 120: 102355.

XIAO J, SUN N, ZHANG Y W,, 2018.sp. nov. (Peridiniales: Dinophyceae): a novel marine dinoflagellate from the Liaodong Bay of Bohai Sea, China [J]. Acta Oceanologica Sinica, 37(10): 18-27.

YOSHIDA T, NAKAI R, SETO H,, 2003. Sequence analysis of 5.8S rDNA and the internal transcribed spacer region in dinoflagellatespecies (Dinophyceae) and development of selective PCR primers for the bivalve killer[J]. Microbes and Environments, 18(4): 216-222.

ULTRAMORPHOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERS OF(DINOPHYCEAE) FROM THE EAST CHINA SEA

LENG Tian-Ze1, GU Hai-Feng2, WANG Rui-Fang1, 3, GUO Zhuo-Ran1, LU Dou-Ding1, DAI Xin-Feng1

(1. Key Laboratory of Marine Ecosystem Dynamics, Second Institute of Oceanography, Ministry of Natural Resources, Hangzhou 310012, China; 2.Key Laboratory of Marine Ecological Conservation and Restoration, Third Institute of Oceanography, Ministry of Natural Resources, Xiamen 361005, China; 3. Ocean College, Zhejiang University, Zhoushan 316000, China)

The genusincludes several toxic or harmful bloom-forming species, among themwas recently isolated from a harmful algae bloom off the coastal water of Fujian, SE China, and has been proven toxic. However, its ultrastructure, especially the body scale, the important taxonomic feature of the genus, has not been well studied. A strain (SIO-H3) isolated from the Xiamen Bay in Fujian was analyzed using morphological methods along with phylogenetic analysis based on internal transcribed spacer (ITS) gene sequences. Both the morphological and molecular results show that the strain (SIO-H3) was. Its cell had a biconical shape in length of 14.3～18.2 μm and width of 8.4～10.9 μm, with a plate formula of po, cp, 5′, 3a, 7″, 6c, 5s, 5″′, 2″″. Unlike previous descriptions, the cells had several pyrenoids and two different types of body scales. One has a rough reticulate pattern in basal layer with a central spine standing upward in the top layer center, and three central ridges radiating outward in equal length from it. There are also three sub-peripheral spines standing upward at the end of each central ridge.The other one features a three-layered structure with a dense reticulate pattern in the basal layer with three sub-central pores and trigeminal central ridge in the middle and top layers. This study corrected previous view in the taxonomic study ofthat one species corresponds one type of body scale structure.

; body scale; pyrenoid; harmful algae; taxonomy

* 國(guó)家自然科學(xué)基金, 42276131號(hào), 41876139號(hào); 中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目, JG2108號(hào); 寧波市自然科學(xué)基金, 2022J195號(hào)。冷天澤, 碩士研究生, E-mail: lengtz@sio.org.cn

戴鑫烽, 副研究員, E-mail: xinfengdai@sio.org.cn

2023-04-12,

2023-05-12

Q948

10.11693/hyhz20230400084