卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)的精子優(yōu)選方法

范宇平，胡燁，滕曉明

輔助生殖技術(shù)發(fā)展至今，已成為解決人類生育問題的重要手段，其包含和衍生出的各種技術(shù)也隨著輔助生殖技術(shù)本身的進(jìn)步而日新月異。現(xiàn)在卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（ICSI）日益成熟，對(duì)于男性而言配子的問題是最受關(guān)注的，也關(guān)乎輔助生殖的各個(gè)環(huán)節(jié)[1]。ICSI 中精子優(yōu)選技術(shù)的應(yīng)用對(duì)ICSI 結(jié)局的各個(gè)指標(biāo)存在影響，如何合理選擇精子優(yōu)選技術(shù)是各生殖中心如何提高胚胎質(zhì)量的重要課題。

1 常規(guī)精子優(yōu)選方法

常規(guī)精子優(yōu)選是指采用人工方法去除精漿、死亡或在鏡下明確畸形的精子及其他有害物質(zhì)，選擇活動(dòng)力強(qiáng)，形態(tài)學(xué)相對(duì)更好的精子，并使精子在體外獲能。所謂常規(guī)，即在輔助生殖技術(shù)精液處理過程中會(huì)常規(guī)應(yīng)用，主要包括了上游法和密度梯度離心（DGC）。

上游法是將精液和培養(yǎng)液共同孵育，使活動(dòng)能力好的精子游到上層培養(yǎng)液中。該方法可除去精漿及精漿內(nèi)抑制受精的物質(zhì)，達(dá)到體外獲能。其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便、成本低廉及不良反應(yīng)少，并可獲得更高的顆粒大小和更低DNA 碎片率的精子[2]。但前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)少、黏稠或不液化的精液使上游法回收率低，故不適宜通過上游法處理，因?yàn)榫颖仨毧朔亓推渌枇ο蛏嫌蝿?dòng)。雖然上游法可回收質(zhì)量較高的精子，但一般回收率相對(duì)較低[3]。上游法的回收率依賴于精子細(xì)胞團(tuán)表面積和精子的活動(dòng)力，受精液本身的質(zhì)量和精漿中細(xì)胞碎片及白細(xì)胞的影響。

DGC 是將不同梯度的分離液和精液分層加入，經(jīng)離心得到沉淀，然后定容于培養(yǎng)液中，通常該方法用于前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)較少的精液。有研究認(rèn)為，常規(guī)參數(shù)異常的精子經(jīng)DGC處理后，得到優(yōu)選精子的頂體反應(yīng)率、低滲腫脹試驗(yàn)陽性率和核成熟的精子比例均優(yōu)于上游法[4]，經(jīng)DNA 碎片率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DGC 處理后的精子DNA 完整性明顯高于經(jīng)上游法處理的精子[5]，因而建議選擇DGC 對(duì)質(zhì)量較差的精子進(jìn)行優(yōu)選。DGC 的優(yōu)點(diǎn)是處理精液后的精子回收率較高，處理時(shí)間較短，但對(duì)比上游法，DGC 成本略高，且離心操作可能對(duì)精子存在一定損傷，因而一般推薦用于前向運(yùn)動(dòng)精子明顯少的精液。

2 不動(dòng)精子的優(yōu)選

當(dāng)ICSI 精液處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，精液中全部或絕大多數(shù)是不活動(dòng)精子，例如精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常（MMAF）或者纖毛不動(dòng)綜合征這樣的極端情況，上游法無法實(shí)現(xiàn)精子優(yōu)選，DGC 也不能確定獲得存活的精子。對(duì)于這樣的情況，應(yīng)選擇更有效的精子優(yōu)選方式以獲得活精子。

低滲透腫脹試驗(yàn)是ICSI 前判斷精子是否存活的最古老也是最簡(jiǎn)便的方法，由此判斷不動(dòng)精子是否存活。由于過程簡(jiǎn)單、成本低，低滲腫脹試驗(yàn)的臨床應(yīng)用十分廣泛，其有效性也可以明確，但低滲腫脹試驗(yàn)處理后的精子ICSI 的操作時(shí)會(huì)比較困難，且低滲腫脹試驗(yàn)后待精子恢復(fù)原樣再行ICSI 需要等待較長(zhǎng)時(shí)間。

激光輔助不動(dòng)精子優(yōu)選的方法是在ICSI 之前高倍視野下選擇形態(tài)較好的不動(dòng)精子，在靠近精子尾部尖端處用激光點(diǎn)射，活精子在激光刺激后精子尾部會(huì)立即出現(xiàn)卷曲或折角的現(xiàn)象。激光導(dǎo)致精子尾部卷曲的機(jī)制尚不清楚，可能與激光照射后介質(zhì)流入精子尾部有關(guān)[6-7]。由于激光點(diǎn)射部位在精子尾部尖端，盡量遠(yuǎn)離精子DNA 區(qū)域，因而推斷不會(huì)對(duì)精子DNA 造成損害。有研究認(rèn)為此方法可以有效鑒別極重度弱精子的存活情況，這些存活的極重度弱精子通過ICSI 可以達(dá)到與正常精子基本相同的受精率，而且有助于提高卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率[7]。但也有研究顯示激光輔助不動(dòng)精子優(yōu)選后的ICSI 與傳統(tǒng)相比，雖然能夠提高受精率，但囊胚形成率、質(zhì)量和利用率均有下降[8]。因?yàn)楸匾院桶踩缘臓?zhēng)議，目前激光輔助精子優(yōu)選在臨床開展相對(duì)較少。

3 精子形態(tài)的分選

形態(tài)選擇單精子注射（IMSI）是基于活精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢測(cè)的技術(shù)，其利用倒置顯微鏡結(jié)合數(shù)碼放大的原理，可將放大倍數(shù)提高到6 300 倍，甚至有報(bào)道其可放大倍數(shù)提高到13 000 倍[9]，從而可以觀察到精子的超微結(jié)構(gòu)，并依據(jù)精子形態(tài)學(xué)快速檢查標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)精子頂體、頂體后致密層、頸部、尾部、線粒體和精子核6 個(gè)部分進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，選擇符合正常形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)的精子進(jìn)行ICSI。但I(xiàn)MSI 的臨床價(jià)值尚存爭(zhēng)議[10-11]，首先IMSI 的形態(tài)學(xué)觀察具有一定主觀性，各文獻(xiàn)報(bào)道差異較大；其次，即便可以優(yōu)選形態(tài)正常的精子，也并不能排除DNA損傷的精子，因此有的研究認(rèn)為其對(duì)ICSI 的結(jié)局并沒有改善[12]。目前共識(shí)認(rèn)為，對(duì)于圓頭精子癥等特殊類型的畸形精子癥，IMSI配合卵母細(xì)胞激活可以提高ICSI 成功率[13]。

評(píng)價(jià)精子質(zhì)量還應(yīng)考慮精子細(xì)胞質(zhì)的異常。細(xì)胞質(zhì)成熟的精子細(xì)胞核具有固有的雙折射，因而有了偏振光顯微鏡優(yōu)選精子的方法。精子頭部的雙折射可以作為反映其細(xì)胞核正常結(jié)構(gòu)組織的指標(biāo)。雙折射也可以評(píng)估頂體反應(yīng)的狀態(tài)，因?yàn)榧?xì)胞質(zhì)成熟的精子在整個(gè)頭部出現(xiàn)雙折射，而發(fā)生頂體反應(yīng)的精子僅在頂體后區(qū)存在雙折射[14]。精子頭部的雙折射模式與精子活力和正常形態(tài)之間有一定的相關(guān)性，形態(tài)異常或活力差的精子具有異常雙折射模式，且形態(tài)與雙折射特性的關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)[15]。偏振光顯微鏡精子優(yōu)選是一種無創(chuàng)的物理優(yōu)選手段，但其過程耗時(shí)長(zhǎng)，目前臨床應(yīng)用尚不多。

4 精子功能的優(yōu)選

精子功能的優(yōu)選方式中，由透明帶穿透試驗(yàn)而來的透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)臨床常見。該方法是在普通的Petri 皿上增加4 個(gè)固定的透明質(zhì)酸點(diǎn)，并在該點(diǎn)的周圍滴加洗滌過的精子，經(jīng)培養(yǎng)結(jié)合15 min 后，成熟的精子便會(huì)結(jié)合在透明質(zhì)酸點(diǎn)上，而其他不成熟精子不會(huì)結(jié)合到該點(diǎn)而是自由游動(dòng)。行ICSI 時(shí)只要選取結(jié)合在透明質(zhì)酸點(diǎn)上的精子即可[16]。由于透明質(zhì)酸是宮頸黏液和卵泡液的組分，因此透明質(zhì)酸結(jié)合法能保證安全性。也有研究顯示，通過透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)優(yōu)選的精子，其正常形態(tài)率、核蛋白成熟度顯著增高，DNA碎片率顯著降低[17]，在嚴(yán)重畸形精子癥ICSI 中受精率和胚胎質(zhì)量也有顯著提高[18]，是目前臨床相對(duì)開展較多的精子功能優(yōu)選方法。

膜聯(lián)蛋白V選擇法是一種較為常用的磁珠活性細(xì)胞分選技術(shù)，即將膜聯(lián)蛋白V 偶聯(lián)在微小的磁珠上，將精子混懸液同磁珠混懸液孵育，凋亡的精子就會(huì)吸附在磁珠上，將此混合液通過具有磁性的分選柱，吸附凋亡精子的磁珠便會(huì)吸附在分選柱上，而未凋亡的精子則會(huì)自由通過。精子凋亡的標(biāo)志包括線粒體跨膜電位破壞、caspase-3 激活、磷脂酰絲氨酸外翻及DNA 碎片率升高等。研究顯示，這些指標(biāo)都是受精失敗的相關(guān)因素[19-20]。但由于膜聯(lián)蛋白Ⅴ選擇法無法篩選去除白細(xì)胞及未成熟的精子，故需與DGC 聯(lián)合使用。這一方法也可用于對(duì)冷凍后精子篩除凋亡精子的優(yōu)選[21]。研究顯示，與傳統(tǒng)ICSI 相比，經(jīng)膜聯(lián)蛋白V選擇法的患者受精胚胎質(zhì)量、著床率、臨床妊娠和持續(xù)妊娠率等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，僅在年齡＜30 歲的分組中，膜聯(lián)蛋白Ⅴ選擇法的優(yōu)質(zhì)囊胚率、臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率更高[22-23]，其臨床價(jià)值亦不確定。證據(jù)表明，電泳法對(duì)精子活力存在負(fù)面影響，且使用負(fù)電位的機(jī)制優(yōu)選精子對(duì)精子總數(shù)要求相對(duì)較高，并存在出生性別比的爭(zhēng)議[22]。

綜上所述，從目前臨床數(shù)據(jù)看，基于形態(tài)學(xué)和精子功能的精子優(yōu)選技術(shù)有理論上的價(jià)值，但對(duì)于ICSI 的臨床結(jié)局的改善沒有明確的證據(jù)。目前還有一些新的精子優(yōu)選技術(shù)，如微流體分離以及使用芯片技術(shù)的方法，方法越來越多，且不斷在革新。因?yàn)闆]有具有壟斷優(yōu)勢(shì)的技術(shù)，臨床值得思考的是如何選擇合適的方法去解決實(shí)際問題。

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