三種有機紫外吸收劑對菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)鰓組織抗氧化能力和細胞凋亡相關基因表達的影響*

張韋煒 董飛龍 荊 晨 劉尚書 胡豐曉

三種有機紫外吸收劑對菲律賓蛤仔()鰓組織抗氧化能力和細胞凋亡相關基因表達的影響*

張韋煒1, 2董飛龍1, 2荊 晨1, 2劉尚書1, 2胡豐曉1, 2①

(1. 福建農林大學海洋學院 福建福州 350002; 2. 福建省海洋生物技術重點實驗室 福建福州 350002)

二苯甲酮-3 (BP-3)、4-甲基芐亞基樟腦(4-MBC)和4-甲氧基肉桂酸-2-乙基己酯(EHMC)是三種常用的有機紫外吸收劑, 在水環境中被頻繁檢出, 對水生生態系統安全構成潛在威脅。為探究三種有機紫外吸收劑對菲律賓蛤仔()鰓組織抗氧化響應和相關細胞凋亡基因的影響, 將蛤仔分別暴露于環境相關濃度的三種紫外吸收劑溶液中, 檢測鰓組織抗氧化酶活性和細胞凋亡相關基因轉錄水平, 并通過第二代整合生物標志物響應法(IBRv2)對三種紫外吸收劑的生物毒性進行比較分析。結果顯示, 三種紫外吸收劑短期暴露會誘導抗氧化響應提高抗氧化能力, 而長期高濃度暴露會導致抗氧化能力的降低。BP-3、4-MBC和EHMC可能通過啟動線粒體途徑和介導的死亡受體途徑誘導菲律賓蛤仔鰓組織產生細胞凋亡。通過IBRv2分析發現, 在環境常見濃度1 μg/L的暴露水平下, 短期(1 d, 7 d)暴露時, BP-3對菲律賓蛤仔鰓組織表現出的綜合毒性效應最強, 而隨著暴露時間的延長(28 d), 三種紫外吸收劑表現出的綜合毒性效應相近。研究結果為水環境中有機紫外吸收劑的生態風險評估提供了參考數據。

有機紫外吸收劑; 菲律賓蛤仔; 鰓; 氧化脅迫; 細胞凋亡; 整合生物標志物響應法

紫外吸收劑(UV filters)可以反射或吸收紫外輻射, 被廣泛應用于防曬霜、乳液、肥皂、口紅、牙膏、香水等個人護理產品(personal care products, PCPs)以及建筑材料、涂料、粘合劑、玻璃和鞋子等(Carve, 2021)。這些化合物可分為兩類: 無機紫外吸收劑和有機紫外吸收劑(Langford, 2015)。有機紫外吸收劑主要通過吸收紫外來發揮作用, 其中二苯甲酮-3 (Benzophenone-3, BP-3)、4-甲基芐亞基樟腦(4-methyl- benzylidene camphor, 4-MBC)和4-甲氧基肉桂酸-2-乙基己酯(2-ethyl-hexyl-4-trimethoxycinnamate, EHMC)用途廣泛且使用量巨大(Ruszkiewicz, 2017)。有機紫外吸收劑通過兩種主要途徑進入水生環境: 游泳等娛樂活動的直接輸入和廢水處理廠的間接輸入。大多數有機紫外吸收劑是高度親脂性的, 因此可以在生物體和人體中富集。

近年來, 有機紫外吸收劑污染在廢水、湖泊、河流和海水以及沉積物中被頻繁檢出。例如, 有研究發現EHMC在處理過的廢水中的濃度在0.01～0.1 mg/L之間, 在未經處理的城市廢水中高達19 mg/L (Balmer, 2005)。BP-3和4-MBC在澳大利亞廢水中的含量分別高達1 340和691 ng/L (O’Malley, 2020)。BP-3和EHMC在中國巢湖中的檢測濃度分別達到68.4和32.2 ng/L (Tang, 2018)。在日本河流地表水中BP-3含量為16～41 ng/L之間(Kameda, 2011), 4-MBC和EHMC在維多利亞州菲利普灣河口地表水中的含量分別高達642和640 ng/L (Allinson, 2018)。4-MBC和EHMC在香港近岸海水中為98.67和55.7 ng/L (Tsui, 2015), 在臺灣萬里通和南海附近海水中BP-3濃度分別高達1233和55.7 ng/L (Kung, 2018; Pei, 2023)。在智利和哥倫比亞的海洋沉積物中發現BP-3、4-MBC和EHMC的最高濃度分別為2.5、7.9和17.8 ng/g(DW) (Rodil, 2009), 而EHMC在中國香港和珠江口的海洋沉積物中甚至分別達到447 ng/g和0.5 mg/g(DW) (Tsui, 2015; Huang, 2016)。以上數據顯示, 這類新興的環境污染物在水體中廣泛存在, 對水生生態系統安全造成威脅。

近年來, 越來越多的研究開始關注有機紫外吸收劑BP-3、4-MBC和EHMC污染對水生動物造成的負面影響, 包括發育毒性、生殖毒性、內分泌毒性和神經毒性等。例如, 在4-MBC暴露下, 塞內加爾鰨()的體長縮短、CAT活性下降和氧化損傷增加(Araújo, 2021)。EHMC導致斑馬魚()孵化延遲、畸形增加、多種抗氧化酶活性降低(Nataraj, 2020)。BP-3和4-MBC暴露會影響大型溞()的蛻皮和發育, 并上調內分泌相關基因的表達(Lambert, 2021)。BP-3能通過MAPK/ERK信號通路誘導斑馬魚腸神經系統異常發育(Wang, 2021)。然而, 關于BP-3、4-MBC和EHMC對海洋無脊椎動物的毒性研究鮮有報道。

菲律賓蛤仔() (俗稱花蛤、雜色蛤)目前已成為世界范圍內的重要養殖貝類之一, 也常被用作毒理學實驗對象和環境指示物種(Marisa, 2021)。鰓作為濾食性貝類的呼吸和攝食器官, 與海水直接接觸, 在對外源污染物的攝入、富集和解毒代謝過程中發揮關鍵作用(Li, 2020)。本研究將菲律賓蛤仔暴露于不同濃度的三種有機紫外吸收劑(BP-3、4-MBC和EHMC)海水溶液中, 檢測鰓組織抗氧化酶活性、脂質過氧化水平和細胞凋亡相關基因轉錄水平的劑量和時間特異性變化, 并通過第二代整合生物標志物響應法(IBRv2)來比較分析菲律賓蛤仔對BP-3、4-MBC和EHMC的綜合毒性響應, 為典型有機紫外吸收劑對海洋無脊椎動物的毒性效應研究提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

有機紫外吸收劑: BP-3 (CAS#131-57-7, 純度≥98%)、4-MBC (CAS#36861-47-9, 純度≥98%)、EHMC (CAS#5466-77-3, 純度≥98%)和內標BP-3-d5(純度≥ 99%)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。二甲基亞砜(DMSO, 純度≥99%)、純水、丙酮和甲醇均購自美國Thermo公司。本研究中各組DMSO最終濃度均低于0.001%, 以避免溶劑效應的干擾(Aguirre- Martínez, 2016)。

1.2 實驗動物和實驗設計

菲律賓蛤仔[(3.61±0.14) cm]購自福州市西營里水產市場。在暴露實驗之前, 將菲律賓蛤仔置于40 L塑料養殖箱中暫養一周, 連續曝氣, 水溫控制在(15±1) °C, 鹽度32, pH 8.1～8.3, 溶解氧(8.0±1.0) mg/L。每日人工投喂螺旋藻粉兩次[30 mg/(ind./d)]。暫養結束后, 將菲律賓蛤仔暴露于不同濃度(0、1、10和100 μg/L)的BP-3、4-MBC和EHMC海水溶液中28 d, 每組設置3個重復(每個重復50只貝)。其中, 1 μg/L為3種有機紫外吸收劑的水環境常見濃度(Balmer, 2005; Richardson, 2011), 10和100 μg/L僅能在極端環境檢測到(Mao, 2019; Huang, 2021)。每天更換全部海水并加入適量的污染物, 以保持BP-3、4-MBC和EHMC的濃度相對穩定。每周采集一次水樣凍于?80 °C冰箱, 留待測定紫外吸收劑的實際濃度。在暴露1 d、7 d和28 d時, 從每個平行組中隨機選擇10只菲律賓蛤仔, 解剖收集鰓組織, 置于?80°C中凍存。

1.3 暴露溶液中紫外吸收劑的定量

采用固相萃取法(SPE)對水樣(5 mL,=3)進行富集和凈化。用4 mL甲醇和LC級純水對OASIS?HLB (500 mg, 6 mL)固相萃取柱(Waters, USA)進行預處理。在水樣中加入內標BP-3-d5并將pH調整為3.0。裝樣后, 用5 mL水清洗試劑盒, 然后用4 mL丙酮/甲醇(1︰1,/)和6 mL甲醇洗脫, 洗脫液于1 mL水/甲醇(1︰1,/)中在氮氣流(40 °C)下輕輕干燥。參照Fisch等(2021)描述的方法, 在Waters ACQUITY UPLC?H-Plus Class高效液相色譜系統與Waters? XevosTM TQ-XS質譜儀(TQ-XS/MS) (Milford, MA, USA)上進行定量分析。目標物質在色譜柱ACQUITY UPLC?C18 (2.1 mm×50 mm, 1.7 μm粒徑) (Waters, Ireland)上進行色譜分離。BP-3、4-MBC和EHMC的平均回收率分別為89%、92%和97%。BP-3、4-MBC和EHMC的檢出限定義為信噪比3︰1, 分別為1.5、4.2和1.5 ng/L。

1.4 鰓組織氧化應激相關指標檢測

稱取100 mg鰓組織, 將樣品加入液氮后研磨, 根據質量體積比加入9倍預冷的PBS緩沖液, 旋渦振蕩器充分混勻, 制備組織勻漿液。冰上靜置5 min后, 3 000 r/min、4 °C離心10 min, 取上清液用于酶活性檢測。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽S轉移酶(GST)活性以及谷胱甘肽還原酶(GSH)、丙二醛(MDA)含量的測定均采用比色法, 所用檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5 熒光定量PCR

鰓組織總RNA采用Fast Pure? Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2 (南京諾唯贊生物科技有限公司)試劑盒提取。RNA完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 純度用NanoDrop ND-2000c儀器(賽默飛世爾科技公司)進行定量。使用HiScript? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (gDNA wiper) (南京諾唯贊生物科技股份有限公司)逆轉錄試劑盒將RNA進行反轉錄獲得cDNA模板。使用ChamQTM Universal SYBR? qPCR Master Mix 試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)在Roche Light Cycle? 480 Ⅱ熒光定量PCR儀(瑞士羅氏)上進行qPCR反應。以作為內參基因, 采用2–ΔΔCt法來計算目的基因的相對表達量(Livak, 2001; Volland, 2017)。引物通過NCBI網站的在線工具Primer-Blast設計, 目標及內參基因的引物序列見表1。

表1 引物序列

Tab.1 The primer sequences

1.6 第二代整合生物標志物響應法(IBRv2)

整合生物標志物響應法(Integrated Biomarker Response, IBR)由法國生態毒理學家Benoit Beliaeff和Thierry Burgeot首創, 經過Wilfried Sanchez等改良后形成IBRv2法, 用于全面評估各種毒理因子對生物的毒害效應。本研究將SOD、CAT、GPx、GST的酶活性和GSH、MDA含量, 以及、、、、和基因轉錄水平這12個指標全部帶入, 計算菲律賓蛤仔鰓組織的IBRv2指數。

計算方法如下:

(1) 數值標準化

Y= lg(X/0), (1)

其中,X為某一生物標志物在某暴露條件下的均值,0為對照組平均值,Y為標準化值。

(2) 數值均一化

Z= (Y–) /, (2)

其中,為所有暴露條件下的總均值,為所有暴露條件下的總標準差,Z為均一化值。

(3) 賦值

=Z–0, (3)

其中,0為對照組某生物標志物均一化值,為某生物標志物在某暴露條件下的生物標志物偏差系數, 正值代表誘導, 負值代表抑制。

(4) 計算IBRv2值

IBRv2 =Σ|/. (4)

1.7 數據統計分析

本研究所有數據分析均通過SPSS 20.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)實驗數據表示為平均值±標準差(mean±S.D.)。數據的方差齊性和正態性首先采用Kolmogorov-Smirnov檢驗和Levene’s檢驗。對照組與實驗組間的數據差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA), 差異顯著性通過Tukey’s HSD檢驗, 顯著性水平為<0.05。

2 結果

2.1 暴露溶液中紫外吸收劑水平分析

暴露溶液中紫外吸收劑的實際濃度見表2。結果表明, 實際的BP-3水平相對穩定, 與暴露試驗期間的BP-3標定濃度接近; 換水后4-MBC的測量濃度基本與標準值相當, 而在下一次換水前4-MBC的測量濃度下降了約20%; EHMC換水前、后實際暴露濃度分別為標定濃度的50%～95.3%和30%～68.9%。

表2 暴露溶液中的紫外吸收劑濃度

Tab.2 Concentrations of UV filters in exposure solutions

2.2 鰓組織抗氧化酶活性分析

如圖1所示, 在BP-3、4-MBC和EHMC脅迫下, 鰓組織SOD活性在1 d時顯著上升(<0.05), 隨著暴露時間的延長恢復到接近或低于對照組水平(除1 μg/L 4-MBC組暴露28 d仍高于對照組水平)(<0.05)。BP-3和4-MBC暴露1 d時CAT活性受到明顯抑制(<0.05), 7 d和28 d時恢復到對照組水平, 而EHMC暴露對CAT活性無顯著影響。在BP-3、4-MBC和EHMC脅迫下, 鰓組織GPx活性在1 d和7 d時無顯著變化(除1 μg/L BP-3組暴露7 d仍高于對照組水平), 隨著暴露時間的延長, GPx活性低于對照組水平(<0.05)。4-MBC暴露1 d時GSH含量顯著下降, 隨著暴露時間的延長, GSH含量恢復到接近或低于對照組水平(除1 μg/L 4-MBC組暴露28 d仍高于對照組水平) (<0.05); 而在BP-3和EHMC脅迫下, 鰓組織GSH含量在1 d時無顯著變化, 隨著暴露時間的延長, GSH含量恢復到接近或低于對照組水平(除1 μg/L BP-3組暴露7 d仍高于對照組水平) (<0.05)。BP-3、4-MBC和EHMC暴露對GST活性無顯著影響(除1 μg/L EHMC組暴露7 d低于對照組水平)。

圖1 不同濃度的BP-3、4-MBC和EHMC暴露及不同暴露階段對菲律賓蛤仔鰓SOD、CAT、GPx、GST活性和GSH含量的影響(1 d、7 d和28 d)

注: 不同字母表示組間顯著性差異(<0.05)。下同

2.3 鰓組織MDA含量分析

與對照組相比, BP-3 (100 μg/L)和4-MBC (10和100 μg/L)暴露組在1 d時MDA含量顯著降低(<0.05), 而隨著暴露時間延長, BP-34-MBC和EHMC各暴露組與對照組相比無顯著性差異(圖2)。

2.4 鰓組織細胞凋亡相關基因表達分析

如圖3所示, 在BP-3、4-MBC和EHMC脅迫下, 鰓組織(除10 μg/L BP-3組、1 μg/L 4-MBC組顯著上調)(除100 μg/L EHMC組顯著上調)基因相對表達量在1 d時顯著下調(<0.05), 7 d時(除10 μg/L EHMC組顯著下調)(除各濃度BP-3組顯著下調)(除1、10 μg/L BP-3組顯著下調)基因相對表達量顯著上調(<0.05)。BP-3、4-MBC和EHMC暴露1 d時基因相對表達量顯著下調(<0.05), 隨著暴露時間的延長恢復到接近或高于對照組水平(除各濃度組BP-3暴露7 d低于對照組水平) (<0.05)。在BP-3和4-MBC脅迫下, 鰓組織基因相對表達量在1 d時顯著下調(除10 μg/L BP-3組顯著上調) (<0.05), 隨著暴露時間的延長恢復到接近或高于對照組水平(<0.05); 而EHMC暴露7 d下調了基因相對表達量(除100 μg/L EHMC組顯著上調) (<0.05), 28 d時高于對照組水平(<0.05)。BP-3暴露1 d和7 d時下調了基因相對表達量(<0.05), 暴露至28 d時則高于對照組水平(<0.05); 在4-MBC和EHMC脅迫下, 鰓組織基因相對表達量在7 d時顯著上調(<0.05), 28 d時顯著下調(<0.05)。

圖2 不同濃度的BP-3、4-MBC和EHMC暴露及不同暴露階段對菲律賓蛤仔鰓MDA含量的影響(1 d、7 d和28 d)

圖3 不同濃度的BP-3、4-MBC和EHMC暴露及不同暴露階段對菲律賓蛤仔鰓細胞凋亡相關基因p53、gadd45、cdk、fas、caspase-2和bcl-2表達量的影響(1 d、7 d和28 d)

2.5 IBRv2分析

如圖4所示, 雷達圖展示出不同濃度的三種紫外吸收劑暴露1、7和28 d菲律賓蛤仔鰓中生物標志物的偏差系數, 反映出不同生物標志物對不同濃度紫外吸收劑暴露的響應差異。結果發現, 暴露于1 μg/L的三種紫外吸收劑中, 1 d時SOD活性、GSH含量和轉錄水平變化幅度較大; 7 d時和轉錄水平變化幅度較大; 28 d時和轉錄水平變化幅度較大。暴露于10 μg/L的三種紫外吸收劑中, 1 d時主要是GSH含量變化幅度最大; 7 d時GST活性、和轉錄水平變化幅度較大; 28 d時CAT和GPx活性以及轉錄水平變化幅度較大。暴露于100 μg/L的三種紫外吸收劑中, 1 d時主要是MDA含量變化幅度最大; 7 d時主要是GPx和GST活性以及轉錄水平變化幅度較大; 28 d時主要是GPx活性和轉錄水平變化幅度較大。

圖4 不同濃度的BP-3、4-MBC和EHMC暴露及不同暴露階段菲律賓蛤仔鰓組織生物標志物偏差系數(1 d、7 d和28 d)

對環境常見濃度1 μg/L的三種紫外吸收劑暴露下菲律賓蛤仔鰓組織的12種生物標志物響應的偏差系數絕對值進行求和, 得到1 μg/L三種紫外吸收劑在暴露1 d、7 d和28 d的IBRv2指數(圖5)。結果顯示, 三種紫外吸收劑的IBRv2值在暴露1 d時為BP-3 (1.20) > 4-MBC (1.08) > EHMC (0.79); 暴露7 d時為BP-3 (1.21) > EHMC (0.89) > 4-MBC (1.18); 暴露28 d時為BP-3 (1.09) ≈ 4-MBC (1.10) ≈ EHMC (1.04)。

圖5 1 μg/L BP-3、4-MBC和EHMC暴露下菲律賓蛤仔鰓組織的第二代整合生物標志物響應(IBRv2)指數(1 d、7 d和28 d)

3 討論

由于有機紫外吸收劑的廣泛使用、在水環境中的普遍存在和潛在的生態毒性效應, 近年來它們潛在的生態風險已成為環境領域的研究熱點(Kwon, 2021)。然而, 目前有關有機紫外吸收劑對海洋無脊椎動物的毒性效應研究鮮見報道。本研究從誘導氧化應激和細胞凋亡兩方面闡釋BP-3、4-MBC和EHMC三種有機紫外吸收劑對菲律賓蛤仔鰓組織的毒性效應, 旨在揭示常見有機紫外吸收劑對海洋無脊椎動物的生態風險。

抗氧化系統可以通過酶和非酶調節保護生物體免受氧化損傷并維持氧化還原平衡(Birnie-Gauvin, 2017)。SOD和CAT是動物體內抗氧化應激的第一道防線, SOD可以加速自由基轉化為H2O2, CAT能夠將H2O2分解成水, 從而清除ROS減少機體氧化應激損傷(Lesser, 2006)。在本研究中, 三種紫外吸收劑短期暴露顯著誘導了鰓組織SOD酶活性升高, 隨著暴露時間延長SOD酶活性恢復到接近或低于對照組水平, 并且高濃度暴露組的抑制作用更加顯著, 表現出明顯的時間和劑量特異性變化, 這與高濃度BP-3暴露28 d后的鯽魚組織SOD活性下降的結果一致(Liu, 2015)。本研究發現短期的BP-3和4-MBC暴露會抑制鰓中CAT活性, 隨著暴露時間的延長, 所有處理組的CAT活性均與對照組無顯著性差異。Campos等(2017)將搖蚊四齡幼蟲()暴露于4-MBC中48 h后也觀察到CAT活性下降。長時間暴露下, CAT活性的恢復可能是機體面對紫外吸收劑誘導的氧化應激產生的適應性響應(Zhang, 2014a)。一項近期研究同樣發現, 4-MBC暴露15 d后不會導致斑馬魚5 dpf (days post fertilization, 受精后天數)幼蟲的CAT活性變化(Prakash, 2022)。GPx和GSH一起參與H2O2的分解, 作為共同底物清除過多的ROS來防止氧化性細胞損傷(Binelli, 2011)。有研究表明, 暴露于BP-34-MBC和EHMC的嗜熱四膜蟲() GPx活性在24 h后均未見明顯變化, 這與本研究結果一致(Gao, 2013)。但是在28 d時暴露于100 μg/L的3種紫外吸收劑的鰓中GPx活性顯著降低, 這與BP-3暴露30 d后的斑馬魚GPx活性顯著降低結果一致(Velanganni, 2021), 這些結果顯示紫外吸收劑長期暴露會導致GPx活性下降, 并表現出明顯的時間依賴性。此外, 在本研究中高濃度的4-MBC和EHMC暴露28 d時, 會導致鰓中GSH含量顯著下降。作為維持細胞內氧化還原平衡的重要物質, GSH含量的減少會破壞機體的抗氧化防御系統, 導致氧化應激(Lushchak, 2012)。GST是一種Ⅱ相代謝酶, 能催化外源物質與GSH結合, 加速排出體外從而達到解毒代謝的目的。本研究發現在整個暴露期間, 大多數濃度組的GST活性均無顯著變化。與本研究結果相似, 有研究報道將搖蚊四齡幼蟲暴露在不同濃度BP-3或OC中, 48 h內同樣未觀察到GST活性顯著變化(Campos, 2017)。這些結果說明GST可能不是典型有機紫外吸收劑污染的敏感生物標志物。

MDA是膜脂過氧化的最終分解產物, 其含量變化可反映膜系統遭受氧化傷害的程度。本研究發現在100 μg/L的BP-3和4-MBC暴露1 d時菲律賓蛤仔鰓中MDA含量顯著降低, 7 d和28 d時無顯著性變化。與本研究結果相似, 有學者將10 μg/L的BP-3脅迫黃尾藍魔魚7 d后, 在其肝臟內未觀察到MDA含量顯著變化(柯懷泱等, 2022)。本研究結果說明紫外吸收劑短期暴露會提高抗氧化防御能力, 降低脂質過氧化水平; 隨著暴露時間延長, 機體面對有機紫外吸收劑引起的氧化應激做出適應性防御, 導致鰓中脂質過氧化水平恢復至對照組水平。

細胞凋亡是一種基因調控的能使細胞產生主動而有序的死亡的細胞自殺機制, 主要分為內源性途徑[線粒體途徑和內質網(ER)應激誘導途徑]和外源性途徑(死亡受體途徑) (Redza-Dutordoir, 2016)。本研究發現三種紫外吸收劑暴露可能通過線粒體途徑和介導的死亡受體途徑誘導菲律賓蛤仔鰓組織細胞凋亡。

可調控多個下游基因的轉錄, 包括、、等, 誘導線粒體途徑介導的細胞凋亡。腫瘤抑制基因能阻滯細胞周期、促進細胞凋亡(魏永永等, 2012)。是調控的生長停滯和DNA損傷誘導型基因, 其可介導DNA修復、細胞周期停滯和細胞凋亡。能控制細胞周期進程?？沟蛲龀蓡T在線粒體外膜發揮作用, 以保持膜的完整性。本研究結果顯示, 長期暴露于高濃度的三種紫外吸收劑中, 鰓內基因相對表達量顯著上調并呈濃度依賴性升高, 這表明紫外吸收劑暴露可導致的激活, 從而通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。本研究發現暴露于100 μg/L三種紫外吸收劑1 d時菲律賓蛤仔鰓內和基因相對表達量顯著下調, 而隨著暴露時間延長顯著上調。有研究報道下調能促進細胞補償性增殖;上調在一定程度上能降低細胞凋亡比例(Zhang, 2014b; 呂童歆等, 2023)。此外, 先前研究發現將菲律賓蛤仔暴露于高濃度4-MBC (10和100 μg/L) 7 d時編碼基因顯著高表達(Santonocito, 2020)。這些下游基因的顯著表達可能和被激活有關, 進一步說明和參與線粒體途徑的細胞凋亡(曾小莉, 1999; Schade, 2019)。此外,可以通過調節Bcl-2家族基因的轉錄, 調控細胞凋亡(Wei, 2021)。Bcl-2是這個家族中抗凋亡因子, 主要存在于線粒體膜上, 通過與促凋亡因子Bax形成二聚體從而起到抑制凋亡的作用(Czabotar, 2014)。在本研究中, 暴露于高濃度4-MBC和EHMC (10和100 μg/L)7 d時鰓內基因相對表達量顯著上調。與此相似, 在10和100 μg/L的4-MBC暴露7 d后, 菲律賓蛤仔消化腺中基因表達量顯著增加(Santonocito, 2020)。因此, 機體可能通過上調的轉錄表達來抑制紫外吸收劑短期暴露導致的細胞凋亡。有研究表明, 丙硫菌唑通過上調表達, 下調基因轉錄來誘導斑馬魚胚胎細胞凋亡(Shen, 2021), 這與本研究28 d時觀察到鰓組織內基因的上調表達和基因轉錄水平下降的結果一致。這些結果表明, 長期高濃度的4-MBC和EHMC暴露能激活通路, 削弱的轉錄表達, 誘導線粒體途徑的細胞凋亡。而在本研究中, BP-3暴露組抗細胞凋亡基因相對表達量短期內顯著下調, 繼續暴露至28 d時則顯著上調。這結果表明, 長期暴露于BP-3后, 菲律賓蛤仔可能通過上調鰓內表達來阻遏細胞凋亡(Novo, 2006)。

介導的細胞凋亡途徑是重要的死亡受體信號轉導途徑之一(Pallepati, 2011)。是癌細胞中應激誘導的細胞凋亡所需的起始Caspase, 與等的表達密切相關(Zhivotovsky, 2005; Baptiste-Okoh, 2008)。在本研究中, 暴露1 d時100 μg/L的4-MBC和EHMC顯著下調了鰓內基因相對表達量, 但在7 d和28 d時均被顯著誘導, 這說明被胞外刺激激活向胞內傳遞更多信號來誘導細胞凋亡(Elmore, 2007)。有研究報道H2O2暴露后, 奶牛子宮內膜細胞中基因表達量顯著上調, 而抑制基因表達在一定程度上能降低氧化應激誘導的細胞凋亡比例(靳青等, 2022)。因此, 本研究中有機紫外吸收劑也可能是通過上調的表達從而激活死亡受體途徑誘導細胞凋亡。此外, 本研究結果發現, 菲律賓蛤仔暴露于100 μg/L的BP-3和4-MBC 1d時鰓組織中基因相對表達量顯著下調, 而暴露于10 μg/L和100 μg/L三種紫外吸收劑28 d時鰓內基因相對表達量顯著上調。同樣, 朱含開等(2008)發現五氯酚暴露能引起斑馬魚胚胎表達上調增加細胞凋亡。已有研究證實, 通過膜的死亡受體作用,被細胞外部因子活化后激活, 誘導死亡受體途徑的細胞凋亡; 這兩種還可通過Bid裂解激活線粒體途徑(Pallepati, 2010)。綜上所述, 本研究結果表明, 三種紫外吸收劑的長期暴露可上調鰓內和表達, 既能激活死亡受體途徑誘導細胞凋亡, 又可增加線粒體途徑介導的細胞凋亡。

第二代整合生物標志物響應法(IBRv2)是目前生態毒理學領域表征某種污染物對受試生物的綜合毒性效應常用的研究方法。本研究中通過與參照值比較多種生物標志物的偏差系數發現, 12種不同生物標志物對BP-3、4-MBC和EHMC的響應情況有明顯差異。暴露在環境常見濃度1 μg/L的三種紫外吸收劑1 d時, SOD活性、GSH含量和轉錄水平指標變化幅度大, 而7 d和28 d、、和轉錄水平指標變化幅度較大, 這表明紫外吸收劑短期暴露主要引起氧化脅迫響應, 而隨著暴露時間的延長, 主要的生物學響應與細胞凋亡有關。此外, 本研究發現, 在環境常見濃度1 μg/L的三種紫外吸收劑短期暴露下, BP-3表現出最強的毒性效應, 而隨著暴露時間的延長, 三種紫外吸收劑表現出相近的毒性效應。

4 結論

本研究結果表明, 短期暴露于有機紫外吸收劑會誘導菲律賓蛤仔鰓組織抗氧化響應, 而長期高濃度暴露則會削弱其抗氧化防御能力。BP-3、4-MBC和EHMC可能通過激活線粒體途徑和介導的死亡受體途徑從而誘導菲律賓蛤仔鰓組織細胞凋亡。IBRv2分析發現短期暴露環境常見濃度1 μg/L時, BP-3表現出的綜合毒性效應最強。本研究結果為典型有機紫外吸收劑BP-3、4-MBC和EHMC的生態風險評估以及對海洋無脊椎動物的毒性機制研究提供了重要參考。

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EFFECT OF THREE ORGANIC ULTRAVIOLET FILTERS ON ANTIOXIDANT CAPACITY AND EXPRESSION OF APOPTOSIS-RELATED GENES IN GILLS OF

ZHANG Wei-Wei1, 2, DONG Fei-Long1, 2, JING Chen1, 2, LIU Shang-Shu1, 2, HU Feng-Xiao1, 2

(1. College of Marine Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2.Key Laboratory of Marine Biotechnology of Fujian Province, Fuzhou 350002, China)

Benzophenone-3 (BP-3), 4-methyl-benzylidene camphor (4-MBC), and 2-ethyl-hexyl-4-trimethoxycinnamate (EHMC) are commonly used organic ultraviolet (UV) filters. Recently, these UV filters have been frequently detected in aquatic environment, posing a potential threat to the safety of aquatic ecosystem. To investigate the effects of the three UV filters on the antioxidant response ofgill and apoptosis-related genes,was exposed to the three filters at environmentally relevant concentrations, and the activity of antioxidant enzymes and transcriptional levels of apoptosis-related genes in gills were investigated. Afterwards, the adverse effects of the filters were compared and analyzed using the Integrated Biomarker Response (IBR) (Version 2) method. Results show that the organic UV filters could induce initial antioxidative response to improve antioxidant capacity, while a long-term exposure to high concentrations of the UV filters could decrease the antioxidant capacity. In addition, the three filters could induce apoptosis in the gill tissue ofvia mitochondria pathway and death receptor pathway. After exposure to the three organic UV filters at common environmental concentration (1 μg/L) for 1 d and 7 d, BP-3 exhibited the strongest toxic effects ongill; and the biomarker responses were similar among the three filters in 28 d. Therefore, the toxicity of organic UV filters depends on chemical species, exposure dose, and exposure duration. This study provides reference data for ecological risk assessment of organic UV filters in aquatic environments.

organic UV filters;; gill; oxidative stress; apoptosis; integrated biomarker response

* 自然資源部東南生態脆弱區監測修復工程技術創新中心自主研究課題, KY-090000-04-2022-017號; 福建省大學生創新創業計劃項目, S202210389038號。張韋煒, 碩士研究生, E-mail: zhangweiwei0605@126.com

胡豐曉, 博士, 碩士生導師, E-mail: hufengxiao@fafu.edu.cn

2023-06-18,

2023-09-19

Q957; S968.3; Q789

10.11693/hyhz20230600126