滸苔多糖降解菌的篩選及其產物對黃豆種子萌發及生長的影響

耿 建，任召珍，叢懿潔，于佳弘，張玲俐

（1. 威海海洋職業學院，山東 威海 264300；2. 海洋經濟藻類開發與利用工程技術協同創新中心，山東 威海 264300）

0 引言

全球氣溫上升、海水富營養化，導致滸苔在溫度合適時迅速生長繁殖。2007 年以來，中國黃海連續15 年暴發以滸苔為肇事藻種的綠潮災害，對該海域和沿岸地區的生態環境、濱海景觀、旅游和海水養殖業造成了嚴重影響。滸苔是歸屬于綠藻門、綠藻綱、石莼目、石莼科、石莼屬的一種大型藻類，滸苔在全球范圍內有20 余亞種，分布較為廣泛。研究表明，滸苔細胞壁的主要成分是具有復雜結構的滸苔多糖[1]，滸苔多糖作為滸苔的主要活性成分，具有多種生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、免疫調節和降血脂等，但是由于分子量比較大，滸苔多糖具有溶解性差、生物利用率低等缺陷，極大地限制了滸苔多糖資源的高值化開發和利用。滸苔多糖的化學組成較為復雜，齊曉輝[2]研究了來源于緣管滸苔、青島綠潮滸苔及廈門條滸苔的滸苔多糖的化學組成。研究發現，綠潮滸苔多糖主要由鼠李糖構成，含有少量的半乳糖、木糖和葡萄糖醛酸；廈門條滸苔多糖則主要由阿拉伯糖和半乳糖組成；此外，還含有少量的鼠李糖和微量的巖藻糖、木糖、甘露糖和葡萄糖等成分；青島綠潮滸苔多糖則主要由鼠李糖組成，含有少量的葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖和甘露糖[3-5]。試驗所用滸苔取自青島綠潮滸苔，從滸苔的附生菌中篩選出能夠高效降解滸苔多糖的菌株，研究了滸苔降解產物對黃豆種子萌發及生長的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料來源

滸苔，采自山東乳山銀灘區域；黃豆，普通市售黃豆種子。

1.1.2 培養基制備

（1） 富集培養基（g/100 mL）。滸苔10 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉1.5 g，維氏鹽溶液5 mL，pH 值7.0～7.5。（維氏鹽溶液：K2HPO4·3H2O 6.50 g，Mg-SO4·7H2O 2.50 g，NaCl 2.50 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4·H2O 0.04 g，蒸餾水1 000 mL。）

（2） 分離培養基（g/100 mL）。蛋白胨0.5 g，酵母粉0.1 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉1.5 g，維氏鹽溶液5 mL，瓊脂1.5 g，pH 值7.0～7.5。

（3） 篩選培養基（g/100 mL）。滸苔多糖1.5 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉1.5 g，維氏鹽溶液5 mL，瓊脂1.5 g，pH 值7.0～7.5。

1.2 試驗方法

1.2.1 滸苔多糖提取

準確稱取100 g 干燥的滸苔進行超微粉碎過篩，加入1 L 體積比1∶1 的二氯甲烷和丙酮混合溶液，抽濾后于65 ℃下干燥，使用3 L 蒸餾水熱水提取7 h，離心，取上清液。加入蛋白酶K 于37 ℃條件下反應24 h，100 ℃下煮10 min，離心，取上清液。向上清液中加入 4 倍體積的95%的乙醇，置于4 ℃冰箱冷藏。將沉淀的滸苔多糖用丙酮洗滌，使用乙醇洗滌，最后進行烘干，研磨。

1.2.2 菌株篩選

（1） 滸苔降解菌株富集。稱取10 g 新鮮滸苔，置于裝有90 mL 富集培養基的三角燒瓶中，于30 ℃條件下以轉速180 r/min 培養，觀察培養液渾濁度及滸苔降解情況，培養3 d 后取10 mL 培養液于新的富集培養基中，繼續培養至渾濁。

（2） 菌株分離與篩選。將富集后的菌液梯度稀釋后涂布與分離培養基上，培養48 h。選取菌落形態不同的菌進行純化后點種與篩選培養基中，于30 ℃條件下培養48 h。利用高碘酸透明圈法篩選滸苔多糖降解菌。

1.2.3 菌株鑒定

（1） 形態學鑒定。采用平板劃線法將菌株接種到LB 固體培養基中，于30 ℃條件下培養48 h 后觀察菌落形態；將其進行革蘭氏染色，于光學顯微鏡下觀察菌體形態。

（2） 分子生物學鑒定。采用Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒提取DNA，采用通用引物，上游引物7F（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'），下游引物1540R（5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'），以菌液DNA 為模板，進行PCR 反應。將上述的PCR產物用凝膠回收試劑盒進行回收后，送至上海生工生物工程股份有限公司測序，使用NCBI 在線軟件BLAST 與已知微生物的16S rDNA 進行相似性分析。

1.2.4 大豆種子萌發及生長測定

（1） 滸苔多糖降解液制備。將菌株接種于含有1.5%滸苔多糖的培養液中，于30 ℃條件下培養48 h，然后用0.22 μm 濾膜過濾除菌，去除菌株菌體，得到滸苔多糖降解液。

（2） 試驗分組。試驗采取隨機組設計，每組30 粒種子，重復3 次，設計9 個處理。處理1：滸苔多糖發酵液原液；處理2：滸苔多糖發酵液清水稀釋100 倍；處理3：滸苔多糖發酵液清水稀釋500 倍；處理4：滸苔多糖發酵液清水稀釋1 000 倍；處理5：1.5%的滸苔多糖液；處理6：1.5%的滸苔多糖液清水稀釋100 倍；處理7：1.5%的滸苔多糖液清水稀釋500 倍；處理8：1.5%的滸苔多糖液清水稀釋1 000 倍；處理9：清水對照。

（3） 種子生物特性測定。將種子放入清水中浸泡過夜，挑選大小相似的種子隨機分9 組，放入墊有紗布的托盤中，每天噴灑處理液2 次，48 h 后計算發芽率，5 d 后測量種子芽長及干質量。

1.2.5 數據處理

采用Microsoft excel 對檢測數據統計并分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

滸苔附生菌經過富集后，在分離培養基中得到8 株不同的菌株，將其點種與篩選培養基中，只得到2 個菌株，經過高碘酸透明圈法篩選只有1 株菌株出現了明顯的透明圈，且透明圈直徑超過2 cm。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態學鑒定

在LB 固體培養基上可觀察到，菌落呈乳白色，不透明，圓形邊緣有缺刻，直徑大概1 mm，表面光滑濕潤。經革蘭氏染色可以看出該菌株為革蘭氏陽性細菌，形態呈弧狀，單個排列。

2.2.2 分子生物學鑒定

經過PCR 擴增后，菌株16SrDNA長度為1 450 bp，經過blast 對比發現該菌株與Vibrio diabolicus 相似度達到99.66%，推測該菌株為Vibrio diabolicus（魔鬼弧菌）。

2.3 滸苔多糖降解產物對黃豆種子萌發及生長的影響

2.3.1 不同滸苔多糖降解液對種子萌發的影響

滸苔多糖降解產物對黃豆種子發芽率的影響見圖1。

圖1 滸苔多糖降解產物對黃豆種子發芽率的影響

由圖1 可知，處理1 和處理5 其發芽率較處理9（對照組） 低8.9%，其他處理組黃豆種子發芽率與對照組比沒有顯著差別。說明高濃度滸苔多糖培養液不利于黃豆種子發芽，低濃度的滸苔多糖對種子發芽率影響不大。

2.3.2 不同滸苔多糖降解液對黃豆種子芽長增長的影響

滸苔多糖降解液對黃豆種子芽長增長的影響見圖2。

圖2 滸苔多糖降解液對黃豆種子芽長增長的影響

由圖2 可知，處理6 的芽長較處理9（對照組）長8.0%，處理組2 的芽長較處理9（對照組） 長4.8%。說明適宜濃度的滸苔多糖和滸苔多糖降解液均能夠促進黃豆種子芽的生長，滸苔多糖降解后促進作用更加明顯。

2.3.3 不同滸苔多糖降解液對種子生長量的影響

對種子生長量的影響見圖3。

圖3 滸苔多糖降解液對種子生長量的影響

由圖3 可知，處理7 的種子干質量較處理9（對照組） 增長22.7%，處理6 的種子干質量較處理9（對照組） 增長18.2%。處理組1～4 的種子干質量與處理9（對照組） 差距不明顯。說明滸苔多糖不能被黃豆種子很好地利用，但被降解后的滸苔多糖能夠被黃豆種子較好地吸收利用。

3 結論

滸苔這一藻類資源非常豐富，滸苔中滸苔多糖的含量高達50%，滸苔多糖具有降血糖、提高免疫力、抗腫瘤等多種生物活性，由于其多糖分子量較大，滸苔多糖在應用方面受到了極大的限制。將大分子的滸苔多糖降解為低分子量的寡糖是當前研究的熱點。目前，將大分子的滸苔多糖降解為小分子的糖的方法主要有物理法、化學法、酶法?；瘜W法降解滸苔多糖，高玉杰等人[4]利用三氟乙酸（TFA）對滸苔多糖進行降解，用于制備低分子量的滸苔多糖。有研究利用TFA 和硝酸對滸苔多糖進行降解，并對降解的工藝條件進行了優化。物理法降解滸苔多糖，由于物理法降解多糖的條件較為劇烈，可能會對寡糖的結構造成破壞。Li Bing 等人[5]利用微波輔助的方法降解滸苔多糖，由于微波作用的非特異性，降解得到的產物分子量分布差異較大，從3.1 kU 到446.5 kU 均有分布。酶降解法是利用酶作為一種特殊的生物催化劑，具有較強的底物和產物專一性，可選擇性酶解特定的糖苷鍵得到特定寡聚糖，還不造成環境污染，因此尋找一種活力高、穩定性強的海藻多糖降解酶成為了目前滸苔利用性研究的熱點。試驗從滸苔附生菌中篩選出一株能夠高效降解滸苔多糖的菌株，經分子學鑒定推測該菌株為Vibrio diabolicus。通過不同濃度的滸苔多糖降解液處理黃豆種子發現適宜濃度滸苔多糖降解液對促進黃豆種子生長有明顯作用，而對種子萌發作用不明顯。高濃度滸苔多糖培養液會抑制黃豆種子萌發及生長，所以在滸苔多糖降解液的應用中應注意濃度適宜。