響應面優化冠突散囊菌發酵牛蒡茶工藝

滕迎弟，王解語，唐業豪，黃莉莉，*巫永華，2，張建萍，2，劉恩岐，2

（1. 徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇 徐州 221018；2. 徐州工程學院江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221018）

冠突散囊菌（Eurotium cristatum） 是茯磚茶加工過程中的優勢菌，大量繁殖后會形成一種金黃色閉囊殼結構，俗稱“金花”，也因此稱其為金花菌[1]，該菌的自身代謝產物無毒害作用，具有抑制腫瘤細胞增長、降血脂等生理功能[2]。大量研究表明，接種冠突散囊菌固態發酵會對其活性成分、功能特性和風味產生影響。Xiao Y 等人[3]探討了冠突散囊菌對秋季綠茶品質提升的作用機制。Zou M M等人[4]研究了用冠突散囊菌固態發酵銀杏籽粉，表明發酵銀杏籽粉的抗氧化活性明顯增強，銀杏酸含量降低44.97%。此外，發酵銀杏籽粉表現出更好的消化率，并具有令人愉悅的類似橙子的氣味。杜靜等人[5]研究表明，經冠突散囊菌固態發酵后的葛根，部分活性成分的含量提高，且發酵后產物具有一定的抗氧化活性，不良的中藥味得到改善。

牛蒡（Arctium lappa L.） 為菊科牛蒡屬兩年生草本植物，是中國傳統藥食同源的植物[6]，由于其含有牛蒡菊糖、多酚、黃酮、木脂素、氨基酸和礦物質等有益成分而被開發成牛蒡茶等產品。傳統上，牛蒡茶的加工包括切片、烘烤等工序[7]，制作工藝較為簡單，所得牛蒡茶口感苦澀，產品口感和風味不易被消費者接受；在牛蒡茶品質改善上，于沛沛等人[8]報道了接種黑曲霉渥堆發酵制備牛蒡茶的工藝。徐艷平[9]優化了靈芝發酵牛蒡茶的工藝，研究表明冠突散囊菌是影響茯磚茶品質的關鍵因素，對于形成茯磚茶菌香濃郁、湯色紅濃、口感醇厚的獨特特征和風味具有重要作用[10]。通過接種冠突散囊菌，利用“散茶發花”[11]技術改善牛蒡茶的品質，為牛蒡發酵茶的開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛蒡，購自農貿市場；冠突散囊菌（Eurotium cri-statum），北納創聯生物科技有限公司提供；福林酚、沒食子酸、蘆丁、熊果酸、葡萄糖，上海葉源生物科技公司提供；苯酚、甲醇、濃硫酸、三氯化鋁，均為分析純，國藥集團上海試劑公司提供。

1.2 儀器與設備

DFY-200C 型高速中藥粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司產品；HH.B11.500S 型電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械有限公司產品；YXQ-LS-18SI 型手提式高壓蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-2F 型超凈工作臺、BGZ-76 型電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司產品；TU-1810 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 制作流程

（1） 工藝流程。新鮮牛蒡→挑選、清洗→切片→0.1%檸檬酸浸泡護色→干制→高溫滅菌→接種冠突散囊菌→恒溫恒濕固態發酵→干燥→成品。

（2） 操作要點。取一定量的干燥牛蒡切片于250 mL燒杯中，添加一定的純水，無菌封口膜密封后，高壓蒸汽滅菌鍋滅菌15 min，放置已滅菌的無菌操作臺中冷卻至室溫，接種一定量的冠突散囊菌孢子懸液，于溫度28 ℃，濕度80%的恒溫恒濕箱中發酵，發酵完后干燥至水分含量小于10%，制成發酵牛蒡茶。

1.3.2 冠突散囊菌孢子懸液的制備

將裝有菌種的安瓿管表面消毒后在安全柜中打開，用酒精燈灼燒頂部，迅速滴上無菌水使之破裂，隨后用鑷子將其敲碎，之后吸取0.5 mL 無菌水打入凍干管，充分溶解菌粉后，用移液槍吸取200 μL 于準備好的平板中，涂布均勻，將平板置入28 ℃培養箱中培養7 d，待長出金黃色菌落后，用接種環將金黃色閉囊殼刮下，并置于裝有100 mL 無菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩均勻后，將其稀釋為濃度1×108個/ mL 的孢子懸液。

1.3.3 冠突散囊菌發酵牛蒡茶的工藝優化

（1） 基質含水量對牛蒡發酵效果的影響。設置牛蒡片初始水分含量分別為15%，20%，25%，30%，35%，接種10%（接種量為接種菌懸液體積與牛蒡質量比） 的冠突散囊菌孢子懸液，用無菌透氣封口膜封口，于溫度28 ℃，濕度80%的恒溫恒濕箱中發酵7 d，通過感官評分確定最佳初始水分含量。

（2） 接種量對牛蒡發酵效果的影響。取一定質量的牛蒡片，加無菌水至初始水分含量為25%，分別接種2%，3%，4%，5%，6%的冠突散囊菌孢子懸液，用無菌透氣封口膜封口，于溫度28 ℃，濕度80%的恒溫恒濕箱中發酵7 d，通過感官評分確定接種量。

（3） 發酵時間對牛蒡發酵效果的影響。取一定質量的牛蒡片，加無菌水至初始水分含量為25%，接種10%的冠突散囊菌孢子懸液，用無菌透氣封口膜封口，于溫度28 ℃，濕度80%的恒溫恒濕箱中發酵5，7，9，11，13 d，通過感官評分確定最佳發酵時間。

（4） 響應面優化試驗設計。基于單因素試驗結果，以發酵牛蒡茶感官評價評分為響應值進行三因素三水平響應面試驗優化發酵牛蒡茶的生產工。

響應面設計因素編碼及水平見表1。

表1 響應面設計因素編碼及水平

1.3.4 牛蒡茶的泡制與感官評價

（1） 牛蒡茶的泡制。以GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》為依據，取各試驗組的發酵牛蒡茶3 g 放入審評杯里，杯中倒入150 mL 沸水，蓋上杯蓋靜置2 min，將茶水倒進品評杯，再泡第2 次，靜置5 min，倒出茶水。

（2） 感官評定。邀請10 名已經修完“感官評價”課程的學生首先對第1 次沖泡茶湯的湯色、茶底的香氣、茶水的滋味進行評價，對第2 次沖泡茶湯的香氣、底色、湯色、滋味繼續進行評定。參考GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》，并稍作修改，通過30%滋味+ 30%香氣+ 20%外形+ 20%湯色作為計算基準得出具體分數。評價前先按表2 中的評分依據進行說明。

表2 感官評價標準

感官評價標準見表2。

2 結果與分析

2.1 冠突散囊菌發酵牛蒡茶的工藝確定

2.1.1 基質含水量對發酵茶感官評分的影響

基質含水量對發酵茶感官評分的影響見圖1。

圖1 基質含水量對發酵茶感官評分的影響

基質含水量會影響冠突散囊菌的生長情況，也會對基質的活性成分產生影響。由圖1 可知，隨著基質含水量的提高，發酵牛蒡茶的感官評分先升后降，當基質含水量為25%時，感官評分最高為87.29 分，此時牛蒡茶表面被金黃色菌花所覆蓋，具有“金花菌”的香味，無不良的風味，說明冠突散囊菌在此含水量下生長狀況優良。水分含量過低或者偏高時，感官評分較低，可能是較低和較高的水分含量都會抑制突散囊菌的生長，影響菌對基質的利用，從而影響發酵茶的感官質量。張波[12]研究表明，20%的含水量是冠突散囊菌發酵葛根時所需的水分條件，與試驗結果相近。因此，選擇25%左右進行響應面優化試驗。

2.1.2 接種量對發酵茶感官評分的影響

接種量對發酵茶感官評分的影響見圖2。

圖2 接種量對發酵茶感官評分的影響

較大的接種量可有效地縮短發酵時間，也能防止雜菌污染，試驗中發現隨著接種量的增加，冠突散囊菌在牛蒡切片上的菌絲覆蓋率越高，色澤由淺黃變金黃，“金花菌”的香氣越發濃郁。由圖2 可知，接種量低于5%時，在7 d 發酵區間內，牛蒡切片生長正常且沒有達到飽和狀態，而接種數量越多，其感官評分也就越高；當接種量大于5%時，感官評分開始降低，可能是過大的接種量會導致菌株生長所需的營養物質不足，影響產物合成，代謝廢物積累過多，從而致使冠突散囊菌覆蓋不均勻，菌絲覆蓋程度下降，影響了發酵茶的風味和色澤，降低感官評分。因此，選擇5%左右的接種量進行后續優化試驗。

2.1.3 發酵時間對發酵茶感官評分的影響

發酵時間對發酵茶感官評分的影響見圖3。

圖3 發酵時間對發酵茶感官評分的影響

微生物發酵過程中，合適的發酵時間使得菌株充分利用底物進行生物轉化，獲得較佳的發酵產品。由圖3 可知，牛蒡茶的感官評分隨著發酵時間增加有上升后下降的趨勢，當發酵到9 d 時，感官評分最高；發酵時間少于9 d 時，感官評分一直處于上升階段，說明冠突散囊菌快速增長，慢慢覆蓋牛蒡片，并在生物代謝作用下，底物分解聚合轉化成小分子化合物，“金花菌”的香氣快速增加，發酵茶的品質自然提升；發酵時間超過9 d 后，感官評分開始下降，可能過長的發酵時間，導致菌株衰退和產生不良的風味。因此，試驗控制發酵時間在9 d 左右。

2.1.4 響應面優化發酵工藝試驗結果

響應面試驗結果見表3。

表3 響應面試驗結果

建立冠突散囊菌發酵牛蒡茶工藝參數的回歸模型，得到感官評分Y 的響應值對自變量A，B，C 的二次多項式回歸方程：

響應面回歸模型方差分析見表4。

由表4 可知，回歸模型F=471.70，p＜0.000 1，表明該模型極顯著，失擬項p 值為0.312 2＞0.050 0，為不顯著，說明此回歸方程是可信的；回歸系數R2=0.977 3，表明該方程具有較好的擬合性，可以用來表示各參數對響應值的影響。R2Adj=0.948 0 表明該模型可以對94.80%的感官評分變化作出合理的解釋。總體而言，該結果具有較好的可靠性，且誤差較低，符合實際，可用來對冠突散囊菌發酵牛蒡茶試驗的分析和預測。一次項C 對感官評分影響顯著（p＜0.05），二次項A2，B2，C2對發酵茶感官評分影響都為極顯著（p＜0.01），交互項BC 對感官評分影響顯著（p＜0.05）。由圖4 可知，發酵時間的曲線最陡峭、等高線最密集，結合表4 中p 值可看出，3 個因素對發酵牛蒡茶感官評分影響的順序為發酵時間＞接種量＞基質含水量，而發酵時間和接種量的交互作用對結果影響最大。

圖4 B，C 交互作用對發酵牛蒡茶感官評分影響的等高線圖和曲面圖

根據響應面試驗模型預測的冠突散囊菌發酵牛蒡茶的最佳發酵工藝條件為基質含水量25.09%（以牛蒡切片質量為基準），接種量4.87%，發酵時間9.27 d，此條件下感官評分為預測為91.51 分。為便于實際操作，調整為基質含水量25.00%，接種量4.87%，發酵時間9.5 d，并在此條件下再進行3 次平行驗證試驗，所得產品的感官評分為92.13 分，與模型預測得分接近，說明該模型預測具有一定的可靠性，優化條件較為合理。

B，C 交互作用對發酵牛蒡茶感官評分影響的等高線圖和曲面圖見圖4。

2.2 牛蒡切片與發酵牛蒡茶感官評價結果

根據外形、氣味、滋味、湯色4 項指標對牛蒡切片和冠突散囊菌發酵的牛蒡茶成品進行比較。

牛蒡切片與發酵牛蒡茶對比見圖5，發酵前后牛蒡感官評定見表5。

圖5 牛蒡切片與發酵牛蒡茶對比

表5 發酵前后牛蒡感官評定

在外形方面，牛蒡切片為白褐色，表面較粗糙且顆粒感強，發酵牛蒡茶成品表面均勻覆蓋金黃色的菌絲；在香氣方面，牛蒡茶成品有青絲味，而發酵牛蒡茶后則帶有清新的花果香和烘焙的焦香。經過熱水沖泡3 min 后，牛蒡切片呈淺黃色、有苦澀感和草藥味、入口清淡，發酵牛蒡茶茶湯金黃澄清、無苦澀味、富有“金花菌”的風味、甘甜醇厚。由于冠突散囊菌在增長繁殖過程中，牛蒡活性成分的氧化、降解和生物轉化，使得發酵牛蒡茶茶湯滋味醇厚，而水溶性褐色素的分泌又增進了茶湯的色澤[13]。

3 結論

通過響應面優化試驗得到冠突散囊菌發酵制備牛蒡發酵茶的最佳工藝為牛蒡基質含水量25.00%，接種量4.87%，發酵時間9.5 d，在此條件所得產品茶湯金黃澄清、無苦澀味，富有“金花菌”的風味、甘甜醇厚，感官評分達到91.51 分。發酵后牛蒡茶的品質得到改善，具體的變化規律和機制需要進一步進行研究。