紅菜苔多酚超聲提取工藝優化及其抗氧化活性研究

翟淑紅，曹洪坤，余詩琴，朱斯豪

（武漢設計工程學院食品與生物科技學院，湖北 武漢 430205）

紅菜苔又名蕓菜苔、紫菜苔，是十字花科蕓苔屬蕓苔種白菜亞種的一個變種，具有較高的營養價值，為人體提供豐富的蛋白質、維生素、碳水化合物、脂肪及一些必需的微量元素等[1]。由于紅菜苔的莖皮和葉片中富含植物多酚，采用適當的工藝，提取紅菜苔莖皮和葉片中的多酚，對于充分開發利用紅菜苔具有重要的意義[2]。

植物多酚是植物的次生代謝產物，廣泛分布于植物的葉、皮、根及果實等部位。多酚的抗氧化機制主要是活性多酚的酚羥基具有抗氧化性，釋放氫離子破壞終止氧化鏈式反應。抗氧化作用分為直接抗氧化和間接抗氧化2 種，直接抗氧化效果是螯合金屬離子、清除自由基、抑制氧化酶活性產生，而間接的氧化作用是由機體內源性抗氧化酶的保護引起的[3]。肉制品的腐敗主要是由于微生物污染、蛋白質氧化、脂肪氧化和色素降解[4]。使用多酚作為保鮮劑可以同時起到防腐劑和抗氧化劑的作用，甚至還具有一定的護色作用。水產品的保鮮主要是通過防止脂肪氧化和細菌增殖完成[5]。除此之外，植物多酚的抗菌作用還表現在破壞細胞壁及細胞膜、抑制生物大分子合成、影響能量代謝、堵塞外膜孔蛋白[6]。

采用超聲輔助的方法，從紅菜苔中提取多酚[7]，以提取時間、料液比、乙醇體積分數、提取溫度為影響因素設計單因素試驗，以總多酚含量為評價指標。在此基礎上設計正交試驗，對提取工藝進行優化，以最佳的提取工藝提取植物多酚進行抗氧化活性試驗[8]，為紅菜苔植物多酚的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅菜苔，購自紅安縣；沒食子酸、福林酚、1,1-二苯基- 2 - 三硝基苯肼（DPPH）、水楊酸、抗壞血酸等（均為分析純），國藥集團化學試劑公司提供。

1.2 試驗儀器設備

722 型可見分光光度計，天津冠澤科技有限公司產品；JP-031S 型超聲清洗機，深圳市潔盟清洗設備有限公司產品；RE-2000A 型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅菜苔的預處理

新鮮菜苔莖皮、葉于50 ℃烘箱中干燥至手捏即碎后粉碎過60 目篩，置于干燥器中存放備用。

1.3.2 紅菜苔各部位含水量的測定

稱取紅菜苔干燥前的質量記為m1，烘干后的質量記為m2。則紅菜苔含水量如下式計算：

1.3.3 多酚提取流程

準確稱取1.00 g 菜苔樣品，加入乙醇溶液，用固定功率超聲輔助提取一段時間，提取完成后，將溶液冷卻后過濾，并在45 ℃條件下旋轉蒸發，得到樣品。

1.3.4 沒食子酸標準曲線

準確稱取50 mg 沒食子酸，然后用少量蒸餾水對其進行溶解，轉移至100 mL 容量瓶中定容，取10 mL轉移定容至100 mL容量瓶，得到質量濃度為0.05 g/mL的標準溶液。精確吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL標準溶液注入25 mL 比色管中，再加入2 mL 福林酚試劑，混合均勻后加入質量分數為15%的碳酸鈉溶液5 mL 定容至25 mL，于45 ℃條件下反應40 min冷卻至室溫，于波長765 nm 處測定吸光度，重復測量3 次取平均值，根據試驗結果繪制沒食子酸標準曲線[9]。

1.3.5 菜苔總多酚的測定

吸取40 μL 樣品注入25 mL 比色管中，加入3.16 mL 水，再加入2 mL 福林酚試劑，混勻，加入質量分數為15%的碳酸鈉溶液5 mL，混合均勻后于45 ℃條件下反應40 min 冷卻至室溫，于波長765 nm 處測量吸光度，重復測量3 次。根據沒食子酸標準曲線公式計算樣品濃度值[10]。

式中：X——根據標準曲線算得樣品質量濃度，mg/mL；

V——樣品液稀釋體積，mL；

N——稀釋倍數；

W——原料質量，g。

1.3.6 單因素試驗設計

以提取時間、料液比、乙醇體積分數、提取溫度為單因素，以多酚得率為評價標準優化提取工藝。提取時間選擇5，10，15，20，25 min 這5 個水平；料液比選擇1∶5，1∶20，1∶35，1∶50，1∶65 這5 個水平；乙醇體積分數選擇35%，50%，65%，80%，95%這5 個水平；提取溫度選擇15，30，45，60，75 ℃這5 個水平。在確保其他因素不變的情況下，通過控制變量法改變其中一個因素，探究該因素對多酚得率的影響。

1.3.7 正交試驗設計

以單因素試驗得到的吸光度為參考依據，選取提取時間、料液比、乙醇體積分數和提取溫度為影響因素進行正交試驗優化提取工藝，以多酚得率為參考指標，每組進行3 次重復試驗。

1.3.8 紅菜苔多酚對DPPH·清除率的測定

試驗參照胡新穎等人[11]的DPPH·比色法稍加改動。配制不同質量濃度的提取液，依次向樣管中加入2 mL 的樣液和醇溶DPPH；對照組依次加入2 mL樣液和無水乙醇；依次向空白管中加入2 mL 的醇溶DPPH·和無水乙醇?；旌暇鶆?，避光30 min，于波長517 nm 處測量吸光度，依次記為A1，A2，A0。結果測量3 次，取平均值。同時，配制與紅菜苔多酚濃度相同的維C 溶液作對照。按下式計算DPPH·的清除率。

1.3.9 紅菜苔多酚基（·OH） 清除率的測定

試驗參照吳琳珊[12]方法稍加改動。配制不同質量濃度的提取液，依次向試管中加入濃度為9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL，濃度為9 mmol/L 的乙醇溶解水楊酸2 mL，蒸餾水2 mL 及濃度為8.8 mmol/L 的過氧化氫溶液2 mL，混勻后避光放置30 min，于波長510 nm 處測量吸光度計為A0，此時以不加過氧化氫的體系為空白溶液。取系列試管，依次加入濃度為9 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液1 mL，濃度為9 mmol/L 的醇溶水楊酸2 mL，樣品2 mL 及過氧化氫2 mL，在上述同樣反應條件下測定吸光度為A1，同上以不加過氧化氫但加樣品的測得吸光度記為A2。此時，以蒸餾水作參比，結果測量3 次取平均值。配制與紅菜苔多酚相同質量濃度的維C 溶液作對照。按下式計算·OH 的清除率：

2 結果與分析

2.1 紅菜苔的含水量

紅菜苔各部位的含水量見表1。

表1 紅菜苔各部位的含水量/%

由表1 可知，紅菜苔整體含水量較高，其中莖干含水量最高，表皮次之，葉片水含量最少。

2.2 沒食子酸標準曲線

沒食子酸標準曲線見圖1。

圖1 沒食子酸標準曲線

由圖1 可知，標準曲線的方程式以沒食子酸質量濃度為橫軸，以吸光度為縱軸，在0.01～0.05 mg/mL的范圍內，Y=0.146X-0.054 4，R2=0.999 4，線性關系良好。

2.3 單因素試驗

2.3.1 最佳提取時間的選擇

提取時間對多酚提取量的影響見圖2。

圖2 提取時間對多酚提取量的影響

由圖2 可知，當提取時間為5～15 min 時，隨著提取時間的延長，多酚提取量逐漸增加；當提取時間到達15 min 時，提取量達到最高峰值；超過15 min時，多酚的提取逐漸降低，但降低幅度較小。提取時間過長或過短都會影響菜苔多酚的提取，時間過短提取不充分，時間過長多酚含量緩慢降低，可能是由于多酚長時間處于較高溫條件下，造成部分氧化。從試驗成本和時間上考慮，試驗最佳的提取時間為15 min。

2.3.2 最佳料液比的選擇

料液比對多酚提取量的影響見圖3。

圖3 料液比對多酚提取量的影響

由圖3 可知，隨著料液比的增加，多酚提取量逐漸增加，并在料液比為1∶35 時達到峰值，料液比在1∶20 ～1∶50 時，多酚提取量穩定在峰值附近，繼續增加料液比時，多酚提取量呈現下降趨勢。當料液比過小時，溶劑不足，反應物接觸面積過小，多酚未完全提取，當料液比過大時，溶劑用量也增大，提取出來的多酚被稀釋[13]，在旋轉蒸發過程中溶劑用量過高會造成提取物的損失。考慮到試驗成本，溶劑用量越少越好，最終選取的最佳料液比為1∶35。

2.3.3 最佳乙醇體積分數的選擇

乙醇體積分數對多酚提取量的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分數對多酚提取量的影響

由圖4 可知，當乙醇體積分數超過30%時，多酚提取量呈現顯著增長趨勢；在乙醇體積分數達到80%時，多酚提取量最高為0.436 mg/g；超過80%后，隨著乙醇體積分數的增加多酚提取量緩慢下降。乙醇體積分數過高時，在后續的有機溶劑蒸發過程中會對多酚提取量產生影響。綜合考慮成本和試驗安全性，確定了從紅菜苔中提取多酚的最佳乙醇體積分數為80%。

2.3.4 最佳提取溫度的選擇

提取溫度對多酚提取量的影響。

由圖5 可知，在試驗設計的溫度范圍內，紅菜苔多酚提取量隨著溫度的升高呈現先迅速增長后緩慢降低的趨勢，在提取溫度為45 ℃時，多酚提取量最大，為0.315 mg/g；在提取溫度超過45 ℃時，持續的高溫環境會使多酚存在氧化和降解現象，所以在溫度持續上升時多酚提取量會緩慢下降。高溫條件較難維持，因此確定了最佳提取溫度為45 ℃。

2.4 正交試驗

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果

由表2 可知，提取溫度對多酚提取量的影響較大，其次是乙醇體積分數，隨后是提取時間，料液比的影響最小。即影響紅菜苔多酚的提取因素排序為D＞C＞A＞B，最佳因素組合為A2B2C1D3，即提取時間為15 min，料液比為1∶35，乙醇體積分數為75%，提取溫度為50 ℃。在此條件下進行驗證試驗，紅菜苔多酚提取量為0.345 mg/g，高于正交試驗所有試驗結果，表明該工藝穩定可行。因紅菜苔樣品單因素和正交的試驗樣品不是同一批次購買，多酚含量明顯下降，可能和季節變化有關。

2.5 紅菜苔多酚對DPPH·的清除率

多酚樣液和維C 對DPPH·的清除率見圖6。

圖6 多酚樣液和維C 對DPPH·的清除率

DPPH·是一種穩定的脂性自由基，在波長517 nm處呈紫色，其氮原子上有一個游離電子可以和抗氧化劑中的一個電子配對，使紫色褪去。紫色褪去程度越大，對自由電子清除作用越強，即抗氧化能力越強[14]。由圖6 可知，菜苔多酚和維C 對DPPH·清除率都隨質量濃度的增加而逐漸增加，且多酚對DPPH·的半抑制質量濃度IC50為24 μg/mL，而維C在24 μg/mL 對DPPH·清除率為66%，故維C 對DPPH·的清除率高于多酚?？紤]到維C 是強抗氧化劑，可知紅菜苔多酚對DPPH·具有較好的清除能力。

2.6 紅菜苔多酚對羥自由基（·OH） 的清除率

多酚樣液和維C 對·OH 的清除率見圖7。

圖7 多酚樣液和維C 對·OH 的清除率

由圖7 可知，隨著質量濃度的升高，多酚和維C對·OH 的清除能力逐漸增加，且增長速率均較為平緩，由線性回歸方程計算可得到多酚對羥自由基的半抑制質量濃度IC50為90 μg/mL，而維C 在90 μg/mL時對·OH 清除率為77.52%。由此可知，維C 對·OH的清除能力大于多酚，維C 的還原力較強，故多酚對·OH 具有一定的清除能力。

3 結論

以紅菜苔為原材料，采用超聲輔助提取多酚，以提取時間、料液比、乙醇體積分數、提取溫度4 個因素為變量設計單因素試驗，以總多酚提取量為評價標準。在此基礎上，設計正交試驗優化提取工藝。試驗結果表明，各變量對多酚提取量的影響程度依次是提取溫度＞乙醇體積分數＞提取時間＞料液比，當將體積分數為75%的乙醇溶液按1∶35 的料液比，于50 ℃的溫度下超聲輔助提取15 min 時，多酚的提取量最大。在此提取條件下得到的多酚穩定可行，多酚提取量為0.345 mg/g。后續抗氧化試驗表明，紅菜苔多酚對DPPH·和·OH 均具有較好的清除能力，并呈現一定的量級效應。研究結果證實了從菜苔中提取多酚的可行性，對紅菜苔的繼續開發提供了一定的理論基礎。

菜苔多酚提取量并非隨著超聲時間的增加而一直上升，而是在15 min 時到達峰值，之后隨著時間的增加多酚提取量緩慢降低，提取時間過短反應不完全，而當長時間處于較高溫度下時可能會使提取出來的多酚分解。當料液比過低時，反應物與溶劑接觸面積過小導致反應程度低，料液比過高時，溶劑也隨之增加，在后續的旋轉蒸發過程中會導致提取物的損失。反應后續的旋轉蒸發是利用沸點不同而去掉溶液中的乙醇，而當乙醇體積分數過高時，旋轉蒸發時會造成提取物的損失。適當增加溫度會使溶液反應更加劇烈，增加多酚提取量，而當溫度過高時，多酚可能會因為無法適應高溫環境氧化或降解。雖然未考慮到超聲功率和pH 值對結果的影響，但仍具有一定的參考依據。