紅菜苔多酚超聲提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

翟淑紅，曹洪坤，余詩琴，朱斯豪

（武漢設(shè)計工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205）

紅菜苔又名蕓菜苔、紫菜苔，是十字花科蕓苔屬蕓苔種白菜亞種的一個變種，具有較高的營養(yǎng)價值，為人體提供豐富的蛋白質(zhì)、維生素、碳水化合物、脂肪及一些必需的微量元素等[1]。由于紅菜苔的莖皮和葉片中富含植物多酚，采用適當(dāng)?shù)墓に嚕崛〖t菜苔莖皮和葉片中的多酚，對于充分開發(fā)利用紅菜苔具有重要的意義[2]。

植物多酚是植物的次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于植物的葉、皮、根及果實等部位。多酚的抗氧化機(jī)制主要是活性多酚的酚羥基具有抗氧化性，釋放氫離子破壞終止氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。抗氧化作用分為直接抗氧化和間接抗氧化2 種，直接抗氧化效果是螯合金屬離子、清除自由基、抑制氧化酶活性產(chǎn)生，而間接的氧化作用是由機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶的保護(hù)引起的[3]。肉制品的腐敗主要是由于微生物污染、蛋白質(zhì)氧化、脂肪氧化和色素降解[4]。使用多酚作為保鮮劑可以同時起到防腐劑和抗氧化劑的作用，甚至還具有一定的護(hù)色作用。水產(chǎn)品的保鮮主要是通過防止脂肪氧化和細(xì)菌增殖完成[5]。除此之外，植物多酚的抗菌作用還表現(xiàn)在破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜、抑制生物大分子合成、影響能量代謝、堵塞外膜孔蛋白[6]。

采用超聲輔助的方法，從紅菜苔中提取多酚[7]，以提取時間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度為影響因素設(shè)計單因素試驗，以總多酚含量為評價指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗，對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以最佳的提取工藝提取植物多酚進(jìn)行抗氧化活性試驗[8]，為紅菜苔植物多酚的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅菜苔，購自紅安縣；沒食子酸、福林酚、1,1-二苯基- 2 - 三硝基苯肼（DPPH）、水楊酸、抗壞血酸等（均為分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司提供。

1.2 試驗儀器設(shè)備

722 型可見分光光度計，天津冠澤科技有限公司產(chǎn)品；JP-031S 型超聲清洗機(jī)，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅菜苔的預(yù)處理

新鮮菜苔莖皮、葉于50 ℃烘箱中干燥至手捏即碎后粉碎過60 目篩，置于干燥器中存放備用。

1.3.2 紅菜苔各部位含水量的測定

稱取紅菜苔干燥前的質(zhì)量記為m1，烘干后的質(zhì)量記為m2。則紅菜苔含水量如下式計算：

1.3.3 多酚提取流程

準(zhǔn)確稱取1.00 g 菜苔樣品，加入乙醇溶液，用固定功率超聲輔助提取一段時間，提取完成后，將溶液冷卻后過濾，并在45 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到樣品。

1.3.4 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取50 mg 沒食子酸，然后用少量蒸餾水對其進(jìn)行溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中定容，取10 mL轉(zhuǎn)移定容至100 mL容量瓶，得到質(zhì)量濃度為0.05 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液注入25 mL 比色管中，再加入2 mL 福林酚試劑，混合均勻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的碳酸鈉溶液5 mL 定容至25 mL，于45 ℃條件下反應(yīng)40 min冷卻至室溫，于波長765 nm 處測定吸光度，重復(fù)測量3 次取平均值，根據(jù)試驗結(jié)果繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

1.3.5 菜苔總多酚的測定

吸取40 μL 樣品注入25 mL 比色管中，加入3.16 mL 水，再加入2 mL 福林酚試劑，混勻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的碳酸鈉溶液5 mL，混合均勻后于45 ℃條件下反應(yīng)40 min 冷卻至室溫，于波長765 nm 處測量吸光度，重復(fù)測量3 次。根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算樣品濃度值[10]。

式中：X——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算得樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——樣品液稀釋體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

W——原料質(zhì)量，g。

1.3.6 單因素試驗設(shè)計

以提取時間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度為單因素，以多酚得率為評價標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化提取工藝。提取時間選擇5，10，15，20，25 min 這5 個水平；料液比選擇1∶5，1∶20，1∶35，1∶50，1∶65 這5 個水平；乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇35%，50%，65%，80%，95%這5 個水平；提取溫度選擇15，30，45，60，75 ℃這5 個水平。在確保其他因素不變的情況下，通過控制變量法改變其中一個因素，探究該因素對多酚得率的影響。

1.3.7 正交試驗設(shè)計

以單因素試驗得到的吸光度為參考依據(jù)，選取提取時間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度為影響因素進(jìn)行正交試驗優(yōu)化提取工藝，以多酚得率為參考指標(biāo)，每組進(jìn)行3 次重復(fù)試驗。

1.3.8 紅菜苔多酚對DPPH·清除率的測定

試驗參照胡新穎等人[11]的DPPH·比色法稍加改動。配制不同質(zhì)量濃度的提取液，依次向樣管中加入2 mL 的樣液和醇溶DPPH；對照組依次加入2 mL樣液和無水乙醇；依次向空白管中加入2 mL 的醇溶DPPH·和無水乙醇。混合均勻，避光30 min，于波長517 nm 處測量吸光度，依次記為A1，A2，A0。結(jié)果測量3 次，取平均值。同時，配制與紅菜苔多酚濃度相同的維C 溶液作對照。按下式計算DPPH·的清除率。

1.3.9 紅菜苔多酚基（·OH） 清除率的測定

試驗參照吳琳珊[12]方法稍加改動。配制不同質(zhì)量濃度的提取液，依次向試管中加入濃度為9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL，濃度為9 mmol/L 的乙醇溶解水楊酸2 mL，蒸餾水2 mL 及濃度為8.8 mmol/L 的過氧化氫溶液2 mL，混勻后避光放置30 min，于波長510 nm 處測量吸光度計為A0，此時以不加過氧化氫的體系為空白溶液。取系列試管，依次加入濃度為9 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液1 mL，濃度為9 mmol/L 的醇溶水楊酸2 mL，樣品2 mL 及過氧化氫2 mL，在上述同樣反應(yīng)條件下測定吸光度為A1，同上以不加過氧化氫但加樣品的測得吸光度記為A2。此時，以蒸餾水作參比，結(jié)果測量3 次取平均值。配制與紅菜苔多酚相同質(zhì)量濃度的維C 溶液作對照。按下式計算·OH 的清除率：

2 結(jié)果與分析

2.1 紅菜苔的含水量

紅菜苔各部位的含水量見表1。

表1 紅菜苔各部位的含水量/%

由表1 可知，紅菜苔整體含水量較高，其中莖干含水量最高，表皮次之，葉片水含量最少。

2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1 可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫軸，以吸光度為縱軸，在0.01～0.05 mg/mL的范圍內(nèi)，Y=0.146X-0.054 4，R2=0.999 4，線性關(guān)系良好。

2.3 單因素試驗

2.3.1 最佳提取時間的選擇

提取時間對多酚提取量的影響見圖2。

圖2 提取時間對多酚提取量的影響

由圖2 可知，當(dāng)提取時間為5～15 min 時，隨著提取時間的延長，多酚提取量逐漸增加；當(dāng)提取時間到達(dá)15 min 時，提取量達(dá)到最高峰值；超過15 min時，多酚的提取逐漸降低，但降低幅度較小。提取時間過長或過短都會影響菜苔多酚的提取，時間過短提取不充分，時間過長多酚含量緩慢降低，可能是由于多酚長時間處于較高溫條件下，造成部分氧化。從試驗成本和時間上考慮，試驗最佳的提取時間為15 min。

2.3.2 最佳料液比的選擇

料液比對多酚提取量的影響見圖3。

圖3 料液比對多酚提取量的影響

由圖3 可知，隨著料液比的增加，多酚提取量逐漸增加，并在料液比為1∶35 時達(dá)到峰值，料液比在1∶20 ～1∶50 時，多酚提取量穩(wěn)定在峰值附近，繼續(xù)增加料液比時，多酚提取量呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)料液比過小時，溶劑不足，反應(yīng)物接觸面積過小，多酚未完全提取，當(dāng)料液比過大時，溶劑用量也增大，提取出來的多酚被稀釋[13]，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中溶劑用量過高會造成提取物的損失。考慮到試驗成本，溶劑用量越少越好，最終選取的最佳料液比為1∶35。

2.3.3 最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取量的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取量的影響

由圖4 可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過30%時，多酚提取量呈現(xiàn)顯著增長趨勢；在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時，多酚提取量最高為0.436 mg/g；超過80%后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加多酚提取量緩慢下降。乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時，在后續(xù)的有機(jī)溶劑蒸發(fā)過程中會對多酚提取量產(chǎn)生影響。綜合考慮成本和試驗安全性，確定了從紅菜苔中提取多酚的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.3.4 最佳提取溫度的選擇

提取溫度對多酚提取量的影響。

由圖5 可知，在試驗設(shè)計的溫度范圍內(nèi)，紅菜苔多酚提取量隨著溫度的升高呈現(xiàn)先迅速增長后緩慢降低的趨勢，在提取溫度為45 ℃時，多酚提取量最大，為0.315 mg/g；在提取溫度超過45 ℃時，持續(xù)的高溫環(huán)境會使多酚存在氧化和降解現(xiàn)象，所以在溫度持續(xù)上升時多酚提取量會緩慢下降。高溫條件較難維持，因此確定了最佳提取溫度為45 ℃。

2.4 正交試驗

正交試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

由表2 可知，提取溫度對多酚提取量的影響較大，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)，隨后是提取時間，料液比的影響最小。即影響紅菜苔多酚的提取因素排序為D＞C＞A＞B，最佳因素組合為A2B2C1D3，即提取時間為15 min，料液比為1∶35，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，提取溫度為50 ℃。在此條件下進(jìn)行驗證試驗，紅菜苔多酚提取量為0.345 mg/g，高于正交試驗所有試驗結(jié)果，表明該工藝穩(wěn)定可行。因紅菜苔樣品單因素和正交的試驗樣品不是同一批次購買，多酚含量明顯下降，可能和季節(jié)變化有關(guān)。

2.5 紅菜苔多酚對DPPH·的清除率

多酚樣液和維C 對DPPH·的清除率見圖6。

圖6 多酚樣液和維C 對DPPH·的清除率

DPPH·是一種穩(wěn)定的脂性自由基，在波長517 nm處呈紫色，其氮原子上有一個游離電子可以和抗氧化劑中的一個電子配對，使紫色褪去。紫色褪去程度越大，對自由電子清除作用越強(qiáng)，即抗氧化能力越強(qiáng)[14]。由圖6 可知，菜苔多酚和維C 對DPPH·清除率都隨質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加，且多酚對DPPH·的半抑制質(zhì)量濃度IC50為24 μg/mL，而維C在24 μg/mL 對DPPH·清除率為66%，故維C 對DPPH·的清除率高于多酚。考慮到維C 是強(qiáng)抗氧化劑，可知紅菜苔多酚對DPPH·具有較好的清除能力。

2.6 紅菜苔多酚對羥自由基（·OH） 的清除率

多酚樣液和維C 對·OH 的清除率見圖7。

圖7 多酚樣液和維C 對·OH 的清除率

由圖7 可知，隨著質(zhì)量濃度的升高，多酚和維C對·OH 的清除能力逐漸增加，且增長速率均較為平緩，由線性回歸方程計算可得到多酚對羥自由基的半抑制質(zhì)量濃度IC50為90 μg/mL，而維C 在90 μg/mL時對·OH 清除率為77.52%。由此可知，維C 對·OH的清除能力大于多酚，維C 的還原力較強(qiáng)，故多酚對·OH 具有一定的清除能力。

3 結(jié)論

以紅菜苔為原材料，采用超聲輔助提取多酚，以提取時間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度4 個因素為變量設(shè)計單因素試驗，以總多酚提取量為評價標(biāo)準(zhǔn)。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計正交試驗優(yōu)化提取工藝。試驗結(jié)果表明，各變量對多酚提取量的影響程度依次是提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時間＞料液比，當(dāng)將體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液按1∶35 的料液比，于50 ℃的溫度下超聲輔助提取15 min 時，多酚的提取量最大。在此提取條件下得到的多酚穩(wěn)定可行，多酚提取量為0.345 mg/g。后續(xù)抗氧化試驗表明，紅菜苔多酚對DPPH·和·OH 均具有較好的清除能力，并呈現(xiàn)一定的量級效應(yīng)。研究結(jié)果證實了從菜苔中提取多酚的可行性，對紅菜苔的繼續(xù)開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

菜苔多酚提取量并非隨著超聲時間的增加而一直上升，而是在15 min 時到達(dá)峰值，之后隨著時間的增加多酚提取量緩慢降低，提取時間過短反應(yīng)不完全，而當(dāng)長時間處于較高溫度下時可能會使提取出來的多酚分解。當(dāng)料液比過低時，反應(yīng)物與溶劑接觸面積過小導(dǎo)致反應(yīng)程度低，料液比過高時，溶劑也隨之增加，在后續(xù)的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中會導(dǎo)致提取物的損失。反應(yīng)后續(xù)的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)是利用沸點不同而去掉溶液中的乙醇，而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時會造成提取物的損失。適當(dāng)增加溫度會使溶液反應(yīng)更加劇烈，增加多酚提取量，而當(dāng)溫度過高時，多酚可能會因為無法適應(yīng)高溫環(huán)境氧化或降解。雖然未考慮到超聲功率和pH 值對結(jié)果的影響，但仍具有一定的參考依據(jù)。