傳統發酵蔬菜源益生菌抗氧化特性研究進展

施 樹，羅 章

（1.重慶旅游職業學院，重慶 409000；2.西藏農牧學院，西藏 林芝 860000）

傳統自然發酵蔬菜的制作已有數千年的歷史[1]，是我國勞動人民為了延長蔬菜貯藏期，不斷在實踐中摸索出的制作加工技術和經驗的結晶。發酵蔬菜所用的原料和發酵方法各地略有不同，但其制作的原理都是利用微生物的發酵作用，使蔬菜得以貯藏的同時，也賦予其脆嫩酸爽的口感和風味。

1 傳統自然發酵蔬菜的制作方法

傳統自然發酵蔬菜的制作方法大致可以分為固態發酵法和液態發酵法。固態發酵一般的做法是：以廣口的缸作為器具，剔除菜根、損傷、腐爛、萎蔫、有病蟲害的部分，將蔬菜清洗干凈，分切或不分切，放入清洗干凈的缸中，每放一層蔬菜，在其表面均勻撒適量的鹽，最后用石頭將蔬菜壓緊，用塑料膜封住缸口發酵。例如，北方酸菜、酸豇豆等。液態發酵即泡制法，用專門的泡菜壇子作為器具，將蔬菜沒入其中浸泡發酵。可泡制的蔬菜諸多，如芹菜、蘿卜、豇豆、辣椒、黃瓜等。一般的做法是：剔除菜根部、損傷、腐爛、萎蔫、有病蟲害的部分，清洗干凈，分切或不分切。泡菜壇子清洗干凈，倒入含一定濃度食鹽的涼開水，將蔬菜浸泡其中。也可往其中加入適量老泡菜水和一些辣椒、姜、蒜、花椒、白酒、白砂糖等輔料。蓋上蓋子，壇口邊緣撒鹽，水封發酵，如四川湖南等地的泡菜。

2 傳統自然發酵蔬菜中的微生物

傳統自然發酵蔬菜是混菌發酵的產物，其中的微生物種類繁多。張璐璐[2]分析采集于廣西、四川和貴州的酸菜中的微生物顯示，主要有乳桿菌屬（Lactobacillus），片球菌屬（Pediococcus），明串珠菌屬（Leuconostoc）、魏斯氏菌屬（Weissella） 和乳球菌屬（Lactococcus），優勢菌種為耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）。孟霞等人[3]對發酵過程中青菜泡菜樣品中真菌的多樣性進行研究表明，發酵中期優勢菌是德巴利酵母屬（Debaryomyces），在發酵第15 天畢赤酵母屬（Pichia） 為絕對優勢菌，發酵第81 天奧默兒玉氏酵母（Kodamaea ohmeri） 為絕對優勢菌。Zhou Q 等人[4]研究了東北酸菜中細菌群落的動態變化：乳酸桿菌、明串珠菌屬和腸桿菌是自然發酵酸菜不同發酵期的主要微生物。Xiao Y S 等人[5]分析泡菜發酵過程中微生物多樣性，共鑒定出90 種細菌和135 種真菌，發酵起始主要是環境微生物（如微球菌科），然后是以明串珠菌科為主的異型乳酸發酵階段，最后是以乳酸桿菌科為主的同型乳酸發酵階段。朱琳等人[6]對蘿卜泡菜發酵液中細菌多樣性進行研究顯示，優勢菌屬依次分別是明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella） 和片球菌屬（Pediococcus） 等。韓俊燕等人[7]對發酵辣椒中的微生物分析顯示，剁辣椒中主要的菌屬是魏斯氏菌、明串珠菌和乳桿菌，乳桿菌（61.5%） 和片球菌（28.6%） 是酸辣椒中主要的細菌，腌辣椒中乳桿菌的豐度達到79.4%，辣椒醬中主要的微生物魏斯氏菌（40.7%） 和乳桿菌（11%）。劉長根[8]對傳統發酵蔬菜的乳酸菌多樣性進行分析顯示，泡菜中乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬及片球菌屬是主要菌屬，植物乳桿菌和短乳桿菌是主要菌種，北方酸菜中主要菌屬是乳酸桿菌屬、片球菌屬及魏斯氏菌屬，主要菌種是植物乳桿菌、短乳桿菌、棒狀亞乳桿菌及小片球菌，辣白菜中乳酸菌屬主要為乳酸菌桿菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬及魏斯氏菌屬，主要乳酸菌種為植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、清酒乳桿菌、短乳桿菌、彎曲乳桿菌及乳酸桿菌亞種。顏娜等人[9]對恩施地區酸蘿卜中細菌多樣性進行研究發現，優勢菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus），平均相對含量是55.76%。向凡舒等人[10]對建始地區泡酸豇豆水中細菌多樣性研究發現，主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus） 及明串珠菌屬（Leuconostoc），乳酸桿菌是泡酸豇豆水中的優勢菌，主要以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） 為主。郭倩倩等人[11]對晴隆酸菜中微生物進行動態分析，總發酵過程中優勢菌屬為5 個細菌屬，9 個真菌屬，發酵末期主要優勢細菌屬依次分別是魏斯氏菌屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）。Yang X Z 等人[12]對取自3 個不同家庭自然發酵的東北酸菜分析表明，厚壁菌門和變形菌門是優勢門，魏斯氏菌屬是所有樣本中最豐富的屬，1 號酸菜中發現較多的梭狀芽胞桿菌，2 號酸菜中發現較多的梭菌和腸桿菌，3 號酸菜中乳酸桿菌的相對豐度較高。任亭等人[13]研究了涪陵泡青菜頭細菌的多樣性顯示，在發酵的前期有假單胞菌（Pseudomonadaceae）、腸桿菌（Enterobacteriaceae） 及歐文氏菌（Erwinia） 等變形菌門菌群存在，后期優勢菌屬是片球菌屬（Pediococcus）。

3 益生菌及篩選

聯合國糧農組織與世衛組織（FAO/WHO） 聯合工作組定義益生菌為“當給予合適數量的活的菌時，會給宿主帶來健康益處”[14]。由此可以看出，作為益生菌應滿足5 個條件：①活的菌；②合適的數量；③對人體是安全的；④在人體內能夠存活并定殖；⑤對人體健康具有一定的功效。目前，已研究的具有益生功能的菌主要是一些乳酸菌、非乳酸菌類的細菌和酵母[15]。乳酸菌不是一個系統分類學上的概念，是指發酵糖類物質主要生成的產物是乳酸的一類細菌的總稱[16]。

可用于保健食品中的益生菌見表1[17]。

表1 可用于保健食品中的益生菌

傳統自然發酵蔬菜制品中主要優勢菌群是乳酸菌，是經過人們長期食用歷史所驗證安全的。以此為來源，分離篩選具有益生功能的乳酸菌、研制有益于人體健康的益生菌制品是研究的熱點之一。

一般采用改良后的MRS 培養基來分離乳酸菌，在MRS 瓊脂培養基中加入2%左右的碳酸鈣[18-20]，或者添加一定量的溴甲酚綠[21]，然后采用平板劃線法純化。對純化后的菌株進行革蘭氏染色，保留革蘭氏陽性菌再對其做過氧化氫試驗，篩選過氧化氫試驗陰性的菌株初步判定為乳酸菌，對其進行純化后保存備用[25]。益生性乳酸菌的篩選主要是考慮其安全性、耐酸、耐膽汁、黏附能力、對條件致病菌的拮抗活性、發酵能力和益生功能[23]。

4 傳統自然發酵蔬菜源益生菌的抗氧化性能

活性氧（Reactive oxygen species，ROS） 和活性氮（Reactive nitrogen species，RNS） 是好氧生物正常的代謝產物[24]。適當水平的ROS/RNS 對于入侵微生物的免疫反應和調節細胞間通訊起著關鍵作用[25]。機體在正常情況下，氧化物水平是處于動態的平衡狀態。當機體細胞內促氧化成分與機體內抗氧化成分之間的平衡被打破，向著有利于氧化物積累的方向轉變被稱為“氧化應激”[26]。此時，過量的氧化物會與體內的酶、蛋白質及核酸等物質發生一系列反應，導致如動脈粥樣硬化、高血壓、缺血、溢血、糖尿病、急性呼吸窘迫綜合征、病理性肺纖維化、慢性阻塞性肺病、哮喘、神經系統疾病和癌癥等疾病的發生[27]，有必要通過攝入外源抗氧化劑來減少氧化應激。益生菌被確立為膳食輔助劑，具有多種有益特性，似乎部分與其抗氧化特性有關。找到潛在的具有抗氧化特性及對人體健康有益的益生菌菌株，已經成為人們研究的興趣所在。體外和體內研究表明，益生菌表現出抗氧化潛力。單獨食用益生菌或補充益生菌的食物可以減少氧化損傷[28]。益生菌抗氧化活性的潛在機制可能是通過清除ROS、螯合金屬離子、增加抗氧化酶水平和調節微生物群來發揮抗氧化作用[29]。

白明等人[30]比較乳桿菌、乳酸乳球菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的抗氧化活性顯示，乳酸乳球菌清除自由基的能力最強，嗜熱鏈球菌次之，而乳桿菌和雙歧桿菌對自由基的清除能力最弱，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD） 對益生菌的抗氧化起主要作用，谷胱甘肽（Glutathione，GSH） 的存在因種屬和菌株的不同而差別較大，總巰基化合物（Total thiol groups，TTG） 對益生菌的抗氧化起了積極作用。Amaretti A 等人[31]對34 株乳酸菌（7 株雙歧桿菌、11 株乳酸桿菌、6 株乳球菌和10 株嗜熱鏈球菌） 進行體外抗氧化活性測定表明，當劑量至少為108CFU/d 時，抗氧化劑混合物有效地減少了阿霉素誘導的氧化應激，這些益生菌菌株可能有助于預防和控制與氧化應激相關的疾病。Paulina K 等人[32]研究了益生菌干酪乳桿菌與益生菊粉對人體血漿的抗氧化能力，結果顯示，含有干酪乳桿菌（4×108CFU）與益生菊粉（400 mg） 可對人血漿抗氧化能力和所選抗氧化酶的活性產生積極影響。Jang H J 等人[33]研究表明，從泡菜中分離出活的或熱殺死的植物乳桿菌Ln1 可能作為有用的抗氧化劑益生菌。Javad H 等人[34]對醫學文獻數據分析，表明益生菌和合生素補充可以提高抗氧化能力，增加體內抗氧化酶的數量。盧佳音[35]從東北傳統自然發酵酸菜篩選出5 株乳酸菌，具有不同的抗氧化能力，完整細胞懸液的羥自由基清除能力、DPPH（1,1- 二苯基-2- 三硝基苯肼） 自由基清除能力、還原力均高于無細胞提取物。Yang S J 等人[36]評估了從泡菜中分離的植物乳桿菌200655 的抗氧化作用，其在DPPH 和ABTS（2,2,-聯氮- 雙-3- 乙基苯并噻唑啉-6- 磺酸） 自由基清除和β - 胡蘿卜素漂白試驗中顯示出最高的抗氧化效果。王晶晶[37]對傳統自然發酵剁椒抗氧化規律進行了研究，在整個發酵過程中，剁辣椒呈現出較佳的抗氧化能力，發酵前9 d 其對DPPH 自由基清除的能力呈增強的趨勢最為明顯，發酵第9 天后上升趨勢趨于平緩。羅瀟[38]研究顯示，傳統發酵蔬菜的抗氧化能力隨著發酵時間逐步增強，SOD 活性、還原力、DPPH 自由基清除率均在第7 天達到最大值。夏海燕等人[39]從酢辣椒篩選出短乳桿菌和發酵乳桿菌，發現其抗氧化能力較強。黃承敏[40]從自然發酵剁辣椒中分離得到植物乳桿菌Y-20，研究其所產胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS） 的體外抗氧化活性，結果表明EPS 對DPPH、羥基自由基、超氧陰離子均具有清除功能。Zer C 等人[41]研究了韓國泡菜（Kimchi，KM）、德國酸菜（Sauerkraut，SK） 和酸大白菜（Pickled cabbage，PC） 的抗氧化性能，KM、SK 和PC 的80%乙醇提取物具有較高的DPPH 清除活性。孫寧等人[42]從自然發酵酸筍中篩選出4 株短乳桿菌和2 株消化乳桿菌，對DPPH 自由基清除率、ABTS 自由基清除率、還原能力均比較強，這6 株乳酸菌具備優良的益生性能和體外抗氧化活性。Kim K T 等人[43]研究評估乳酸菌菌株的益生菌特性和抗氧化活性，從泡菜中分離的短乳桿菌KU15147 的抗氧化活性高于其他測試菌株，其誘導型一氧化氮合酶和腫瘤壞死因子- α 的相對表達強度高于其他菌株，表明該菌株可以作為一種新型益生菌菌株應用于保健食品或制藥行業。解文利[44]對從貴州、吉林兩地具有代表性的發酵蔬菜中分離到的乳酸菌菌株進行體外抗氧化活性評估，貴州組乳酸菌對ABTS 自由基清除、DPPH 自由基清除、抗脂質過氧化能力整體高于吉林組。胡蝶等人[45]從泡菜汁中分離得到清酒乳桿菌、腸膜明串珠菌和彎曲乳桿菌，彎曲乳桿菌的還原能力都優于另外兩株菌，腸膜明串珠菌的DPPH清除能力最強。解文利等人[46]從泡菜中分離出的6 株植物乳桿菌，對其體外抗氧化活性研究表明，在6 株植物乳桿菌對ABTS 和DPPH 自由基清除作用中，發酵上清液組的清除率均高于完整細胞組和無細胞提取物組。Kim S 等人[47]研究了來自15 種食品中細菌菌株的無細胞上清液（Cell-free supernatant，CFS）的抗氧化活性，結果表明乳酸菌通過清除DPPH 和ABTS 自由基來緩解氧化應激，抑制了NO 的產生，并降低了脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS） 活化RAW264.7 細胞中誘導型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS） 和環氧化酶（Cyclooxygenase 2，COX-2） 的水平，試驗菌具有被用作益生菌和抗氧化功能食品的強大潛力。

5 結語

諸多研究顯示益生菌具有抗氧化特性，對改善氧化應激、減少機體被氧化、防止疾病和延緩衰老、保持機體健康具有重要意義。傳統自然發酵蔬菜制品已經被人們長期食用，安全性得以保證。這些發酵制品中含有大量的各種潛在的益生功能微生物。從中篩選具有發酵能力強，適應胃腸道環境，能在腸道中定殖，具有良好益生功能和抗氧化特性的微生物作為益生菌，開發對健康有益的益生菌食品或者藥品，改善人體健康具有重要意義。