乳酸菌發酵寬皮柑桔全果漿營養品質及揮發性成分的變化

干世卿,戴杰科,徐藝橙,楊立啟,聶小華*

1(浙江工業大學 食品科學與工程學院,浙江 杭州,310014)2(杭州華味亨生物科技有限公司,浙江 杭州,311100)

乳酸菌發酵植物基飲品是近年來最受關注的益生產品,可綜合植物源活性物質和乳酸菌等功能特性,且乳酸菌代謝作用可賦予植物基飲品發酵風味[1],甚至影響到植物源活性物質的結構與數量[2-3]。常見的商業化乳酸菌有植物乳桿菌、嗜酸乳球菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和發酵乳桿菌等。由于果蔬基質為低酸低氮源體系,在酸脅迫和低氮脅迫下,乳酸菌生長繁殖會受到一定程度上的抑制[4]。已有研究表明,乳酸菌種類很大程度上影響著其在果蔬基質中的適應能力、發酵過程以及代謝產物,這些都與產品品質和風味密切有關[1-2,5-6],因此應選擇合適的乳酸菌進行果蔬基質的發酵。

柑橘是我國重要的經濟作物,富含低分子糖類、有機酸類、維生素C、纖維素和礦物質等營養成分,同時還存在著大量的酚酸、黃酮、類胡蘿卜素、類檸檬苦素和香豆素等活性物質[7],尤其酚酸和黃酮是柑橘及其制品內在營養品質的特征成分[7]。現有國內外研究主要針對柑橘果汁進行乳酸菌輕度發酵[2,6,8],果皮活性物質未能得到利用。迄今為止,以柑橘全果漿為基質的乳酸菌深度發酵研究還較少[9]。

寬皮柑桔(CitrusreticulateBlanco)是一類果皮寬松、剝皮容易的柑橘品種群,年產量約占柑橘總量的60%。浙江省作為柑橘生產的主產區之一,寬皮柑桔廣泛種植于溫州、臺州、寧波和杭州等地。本文以溫州蜜桔這一寬皮柑桔為原料,采用植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌為發酵菌種,比較其在寬皮柑桔全果漿中的發酵性能,綜合評價其深度發酵過程中活性物質、抗氧化活性與揮發性成分的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寬皮柑桔采用溫州蜜桔,產地浙江溫州,選擇無明顯缺陷、成熟度合適的果實;植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,Lp-115)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus,La-14)和副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei,Lpc-37)等凍干粉,美國杜邦公司生產。DPPH,Sigma公司;沒食子酸、蘆丁和維生素C,上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

LHR-150型生化培養箱,上海科學儀器有限公司;JPB-607A型便攜式酸度計,上海雷磁儀器有限公司;CRZIG Ⅱ型冷凍離心機,日本日立公司;UV762型紫外可見分光光度計,上海精科實業有限公司;Trace1300-ISQ型氣相色譜-質譜聯用儀,美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 柑橘全果漿發酵產物的制備

參考楊立啟等[9]的方法。全果用次氯酸鈉溶液(含有效氯0.06%)和水依次清洗后,壓榨得到渾濁型全果漿,調整pH值至4.5,無菌條件下分別接種一定量的Lp-115、La-14和Lpc-37,30 ℃下發酵。

1.3.2 pH的測定

采用JPB-607A便攜式酸度計測定全果漿及其發酵產物的pH值。

1.3.3 活性物質含量的測定

全果漿及發酵產物經離心(8 000 r/min,10 min)后,上清液用于活性物質含量的測定。維生素C含量測定采用碘量法[10];總酚含量測定采用福林酚法[5],以沒食子酸為標準品;總黃酮含量測定采用氯化鋁法[11],以蘆丁為標準品。

1.3.4 抗氧化活性的測定

全果漿及發酵產物經離心(8 000 r/min,10 min)后,上清液用于抗氧化活性的測定。自由基清除能力測定采用DPPH法[6];鐵離子還原力測定采用鐵氰化鉀法[12]。以維生素C為對照品,結果表示為g維生素C當量/L。

1.3.5 揮發性成分的測定

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用(solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPEM-GC-MS)方法。按照楊立啟等[9]的方法,應用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭吸附全果漿及發酵產物中揮發性成分。

GC-MS條件:DB-5 MS毛細管柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);30 ℃保留2 min,以5 ℃/min升溫至250 ℃,保留5 min;載氣(氦氣),流速1.0 mL/min,分流比10∶1。EI離子源,電子能量70 eV,離子源溫度250 ℃,m/z40～550范圍內掃描。

數據進行圖譜庫NIST和Xcalibur 3.0(Thermo Fisher Scientific)檢索,匹配度大于80%,結合文獻資料確定揮發性成分;按峰面積歸一法計算每種揮發性成分的相對含量。

1.4 數據分析

每組樣品平行測定3次,表示為平均值±標準偏差;主成分分析(principal component analysis,PCA)采用SPSS軟件。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌發酵寬皮柑桔全果漿過程中pH變化

寬皮柑桔全果漿中富含葡萄糖、果糖和蔗糖等低分子糖類,乳酸菌可將其代謝形成有機酸,由此引起pH下降。乳酸菌發酵寬皮柑桔全果漿過程中pH變化如圖1所示。結果表明,寬皮柑桔全果漿pH發生快速下降,而后趨于平緩;其中發酵3 d時Lpc-37和La-14僅將pH值降低了0.59和0.5,Lp-115則使pH發生大幅下降;發酵10 d后全果漿pH由起始的4.5分別降至2.72(Lp-115)、3.63(La-14)和3.44(Lpc-37),說明不同種類的乳酸菌在寬皮柑桔全果漿中生長情況存在明顯差異。這是因為寬皮柑桔全果漿的起始pH較低(4.5),氮源匱乏,且酚酸、黃酮可能影響乳酸菌的生長[4,13];已有研究表明,乳酸菌耐受和適應環境脅迫的能力與其菌株種類有著密切關聯[4]。

2.2 乳酸菌發酵寬皮柑桔全果漿過程中活性物質含量變化

寬皮柑桔全果漿含有豐富的維生素C、酚酸和黃酮等活性物質[7,12],其在乳酸菌發酵過程中變化如圖2所示。經Lp-115、La-14和Lpc-37發酵后,寬皮柑桔全果漿中維生素C含量由起始0.73 g/L快速下降而后趨于平緩,三者之間無顯著差異;發酵10 d后維生素C含量下降了70%以上。該現象常見于果蔬基質的發酵[8,14],維生素C屬于烯醇,易氧化形成醌。寬皮柑桔全果漿中總酚含量呈現不斷增加的趨勢,其中Lp-115的作用明顯強于La-14和Lpc-37,發酵10 d時分別達到3.23、2.08、1.84 g/L。這是因為全果漿為富含果肉果皮的渾濁體系,存在著大量的不溶性酚類物質,其在乳酸菌的糖苷酶和酚酸酯酶[3,15 ]作用下得到釋放;同時,酚類物質在低酸環境中也不易被氧化成醌。但寬皮柑桔全果漿中總黃酮含量隨發酵時間呈現截然不同的趨勢,其在Lp-115發酵產物中提高1.35倍(3 d),而后維持在1.3 g/L附近;在La-14發酵產物中表現為先降后增,Lpc-37發酵產物中基本無變化(0.93～1 g/L)。一般來說,乳酸菌發酵果蔬基質中總酚和總黃酮含量得到提高[2,6,8]。推測其原因是:乳酸菌分泌的糖苷酶將不溶性膳食纖維結合的黃酮釋放形成可溶性黃酮;也可能將可溶性黃酮苷水解成不溶性黃酮苷元[3]。

A-維生素C含量;B-總酚含量;C-總黃酮含量圖2 乳酸菌發酵寬皮柑桔全果漿過程中活性物質的含量變化Fig.2 Changes in active compound contents in C.reticulate Blanco pulp during Lactobacillus fermentation

2.3 乳酸菌發酵寬皮柑桔全果漿過程中抗氧化活性的變化

乳酸菌發酵寬皮柑桔全果漿過程中抗氧化活性的變化如圖3所示。經Lp-115和La-14發酵后,寬皮柑桔全果漿的DPPH自由基清除能力均呈現先增加而后基本穩定,10 d后分別達到0.47、0.33 g維生素C當量/L;鐵離子還原力也得到顯著提高,分別在發酵5 d和7 d達到最大值(2.82、1.89 g維生素C當量/L);但Lpc-37明顯降低了全果漿清除DPPH自由基和還原鐵離子的能力。推測其原因有:a)不溶性酚類物質的釋放情況[3,15];b)酚類物質的結構轉變[2-3];c)乳酸菌分泌抗氧化酶的能力[16];d)酚類物質的氧化程度[14,17];e)維生素C的損失狀況[8,14]。眾所周知,乳酸菌在果蔬基質中的生長、發酵以及分泌糖苷酶、酯酶和抗氧化酶等,存在著較大的菌株差異性。總體上,乳酸菌發酵寬皮柑桔全果漿的抗氧化活性依次為:Lp-115發酵產物> La-14發酵產物 >Lpc-37發酵產物,前者明顯高于后二者。

A-DPPH自由基清除能力;B-鐵離子還原力圖3 乳酸菌發酵寬皮柑桔全果漿過程中抗氧化活性的變化Fig.3 Change in antioxidant activity of C.reticulate Blanco pulp during Lactobacillus fermentation

2.4 乳酸菌發酵寬皮柑桔全果漿過程中揮發性成分的變化

乳酸菌發酵寬皮柑桔全果漿過程中揮發性成分種類及相對含量如表1所示。寬皮柑桔全果漿及發酵產物中共鑒定出64種揮發性成分,包括36種烯類、10種醛類、7種醇類、4種酯類、3種有機酸類、1種酮類以及3種其他類,其中D-檸檬烯含量最高(59.73%～68.9%)。

表1 乳酸菌發酵寬皮柑橘全果漿中揮發性成分的相對含量 單位:%

烯類化合物是寬皮柑桔全果漿的重要揮發性成分,其相對含量從83.82%增加到87.11%(Lp-115)和87.62%(Lpc-37),La-14則使其降低至80.66%,說明發酵產物中烯類化合物與乳酸菌種類有關。D-檸檬烯是柑橘特征揮發性風味成分[18],相對含量發生不同程度的下降,尤其La-14發酵產物中降低了9.17%;β-欖香烯、β-萜品烯和β-月桂烯等相對含量增加了1%以上,其中前二者可賦予產品檸檬香氣和茴香氣味,后者可賦予產品香脂香氣。

寬皮柑桔全果漿經乳酸菌發酵后,醛類化合物相對含量明顯降低,己醛、辛醛、癸醛、橙花醛和紫蘇醛等含量極低甚至未檢出,該結果說明柑橘特有清香風味發生減弱;已有研究表明,醛類化合物在乳酸菌代謝作用下可還原成為相應的醇類化合物[19]。醇類化合物主要為芳樟醇,相對含量從起始的5.13%分別降至4.17%(Lp-115)、3.52%(La-14)和2.04%(Lpc-37);乙醇、α-松油醇和4-松油醇等相對含量顯著提高,其中Lp-115發酵產物中乙醇相對含量提高較多;發酵產物中檢出了微量香茅醇,可賦予產品玫瑰香氣;La-14發酵產物中新增異戊醇,具有蘋果白蘭地香氣和辛辣味。全果漿及發酵產物中酯類化合物相對含量較低(0.21%～4.13%),其中乙酸乙酯相對含量提高了0.82%(Lp-115)、3.88%(La-14)和3.07%(Lpc-37),可賦予產品甜果香味。發酵產物中均檢出香芹酮,具有薄荷風味,僅Lp-115明顯提高其相對含量。

寬皮柑桔全果漿中不存在短鏈脂肪酸,乳酸菌發酵后可檢出乙酸、異丁酸、異戊酸等,其在Lp-115發酵產物中相對含量極低。發酵產物中反式-檸檬烯氧化物消失;微量的正己烷和乙偶姻檢出,其中乙偶姻是乳酸菌發酵特有的代謝產物[20]。

2.5 揮發性成分的主成分分析

乳酸菌發酵寬皮柑桔全果漿中揮發性成分的主成分分析如圖4所示。PC1和PC2貢獻率分別為49.9%和27.5%,累積貢獻率達77.4%,基本上可反映全部信息;PC1反映醇類化合物、酯類化合物、有機酸類等指標,PC2反映烯類化合物、醛類化合物和其他類揮發性成分等指標。根據距離的遠近,寬皮柑桔全果漿與發酵產物相比,揮發性成分變化存在顯著差異;La-14發酵5 d和發酵10 d的全果漿揮發性成分變化較為顯著,Lp-115和Lpc-37發酵5 d和10 d的全果漿揮發性成分存在一定差異。該結果說明寬皮柑桔全果漿的揮發性成分受乳酸菌種類和發酵時間影響,其中La-14的影響最大,意味著柑橘特性風味向乳酸菌發酵風味的轉變。

圖4 寬皮柑桔全果漿及發酵產物中揮發性成分的主成分析Fig.4 PCA for unfermented and fermented C.reticulate Blanco pulps注:UF代表未發酵寬皮柑桔全果漿;Lp-115(5)和Lp-115(10) 代表植物乳桿菌Lp-115發酵全果漿5 d和10 d;La-14(5)和 La-14(10)代表嗜酸乳桿菌La-14發酵全果漿5 d和10 d;Lpc-37(5) 和Lpc-37(10)代表副干酪乳桿菌Lpc-37發酵全果漿5 d和10 d。

3 結論

本文研究了乳酸菌Lp-115、La-14和Lpc-37發酵寬皮柑桔全果漿過程中營養品質與揮發性成分的變化規律。Lp-115對寬皮柑桔全果漿的發酵能力最強,其發酵產物中總酚和總黃酮含量高于La-14發酵產物和Lpc發酵產物,但3種乳酸菌發酵產物中維生素C含量均發生明顯下降;Lp-115和La-14可顯著提升寬皮柑桔全果漿抗氧化活性,但Lpc-37導致抗氧化活性發生一定程度的下降。采用SPEM-GC-MS法分析全果漿及發酵產物的揮發性成分,烯類化合物、醛類化合物和芳樟醇等發生明顯下降,說明柑橘特有清香風味有所下降;酯類化合物(尤其乙酸乙酯)、香芹酮和乙偶姻等有所增加,賦予了產品乳酸菌發酵風味。主成分分析表明寬皮柑桔全果漿揮發性成分很大程度上受到乳酸菌種類和發酵時間的影響,尤其La-14;與La-14和Lpc-37相比,Lp-115更適合用于寬皮柑桔全果漿的發酵生產。