艾灸對膝骨關節炎兔軟骨Wnt 信號通路及血清炎性因子的影響

張憲基 汪宗保 王科文 李 鑫 李德坤 單自亮 姚長風

（安徽中醫藥大學針灸推拿學院，安徽合肥 230038）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種在中老年人群中常見的退行性關節疾病，主要臨床表現為膝關節的疼痛、腫脹、僵硬、活動受限等[1]。流行病學研究顯示，全球約有6.5億人受到KOA的影響，其中年齡在40歲以上者約占22.9%[2]。KOA引起的膝關節不穩定對患者的日常生活造成了極大不便。因此，探索科學、有效、多樣的KOA治療方案并研究其具體作用機制顯得尤為重要。

臨床研究表明，艾灸可有效降低KOA患者體內炎性因子水平并改善患者的臨床癥狀與膝關節功能狀況[3]。有實驗顯示，不同產地和存儲期限灸材均可有效降低KOA模型大鼠膝關節腫脹程度、軟骨組織細胞病變程度和曼金（Mankin's）評分[4]。明代《針灸大成》記載：“犢鼻，主膝中痛不仁”，一項對近20年臨床針灸治療KOA文獻的復雜網絡分析也發現，犢鼻是臨床治療KOA選穴中最核心的腧穴[5]。目前研究發現，影響KOA發生和發展的信號通路有十余條，其中Wnt信號通路是與炎性反應相關的信號通路之一[6]。Wnt/β-連環蛋白（Wnt/β-catenin）信號通路在骨骼、軟骨及滑膜組織中起著直接調節作用，在軟骨細胞的不同生長階段均發揮重要調控作用[7]。研究發現，通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，能夠促進軟骨細胞增殖并抑制其細胞凋亡[8]。本研究制作KOA兔模型，并予艾灸犢鼻穴干預，觀察其干預效果，并從Wnt/β-catenin信號通路角度探討艾灸犢鼻穴治療KOA的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性普通級新西蘭兔24只，3月齡，體質量2.2～2.5 kg，購自邳州市東方養殖有限公司，合格證號：SCXK蘇20170002。兔分籠飼養，室溫24℃，飲食自由。本實驗中對動物的處理均符合國家科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》，且經安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批通過（AHUCM-rabbits-2022056）。

1.2 主要試劑 木瓜蛋白酶（批號：517S021，北京索萊寶科技有限公司）；白細胞介素-1β（IL-1β）試劑盒（批號：GR20220119，武漢基因美生物科技有限公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（批號：GR20220426，武漢基因美生物科技有限公司）；總RNA提取試劑盒（批號：3505080，美國生命技術公司）；熒光染料（批號：05229413，蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司）；反轉錄試劑盒（批號：AL21115A，北京寶日醫生物技術有限公司）；RIPA細胞裂解液（批號：09271919023，上海碧云天生物技術有限公司）；PAGE膠促凝劑（批號：1020F024，北京索萊寶科技有限公司）；PBS緩沖液粉末（批號：19022401，北京中杉金橋生物技術有限公司）；PVDF膜（批號：R7SA9081E，美國密理博公司）；山羊抗兔IgG（批號：20270051，北京中杉金橋生物技術有限公司）；蘇木素染液（批號：09232110，安徽欣樂生物技術有限公司）。

1.3 主要儀器 JW3021HR離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫箱（上海三發科學儀器有限公司）；YB-7LF生物組織包埋機（湖北孝感市亞光醫用電子技術有限公司）；PIKOREAL 96熒光定量PCR儀（美國賽默飛世爾科技公司）；EPS300電泳儀（上海天能科技有限公司）；VE-180電泳槽（上海天能科技有限公司）；VE-186轉膜儀（上海天能科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 24只兔隨機分為正常組、模型組、艾灸組，每組8只。采用木瓜蛋白酶水溶液膝關節腔注射的方式制作KOA模型，于實驗開始的第1、4、7天向模型組和艾灸組兔右膝關節腔內注射2%木瓜蛋白酶水溶液0.5 mL，并于首次藥物注射后第14天對造模兔右膝關節進行膝骨性關節病病情程度指數（Lequesne MG）評級，總分大于4分即為造模成功[9]。模型組、艾灸組所有兔均造模成功。

2.2 干預方法 造模成功后，即首次藥物注射后第15天開始，艾灸組懸灸兔右膝“犢鼻”穴，穴位定位參照《實驗針灸學》[10]，艾條距兔皮膚約3～5 cm，20 min/次，每日1次，連續艾灸21 d。空白組、模型組正常飼養，不作其他任何處理。

2.3 樣本采集 干預結束后次日，各組兔麻醉，心臟采血取動脈血5 mL，靜置，離心分離血清，-80 ℃冰箱保存備用于酶聯免疫吸附（ELISA）試驗。取各組兔右膝關節股骨端軟骨，經固定、脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋、切片等操作后備用于蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組化染色使用。取各組兔右膝關節脛骨平臺軟組織，置于液氮中，轉入-80℃超低溫保存以備用于實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative Real-time PCR，qPCR）法、蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測使用。

2.4 指標檢測

2.4.1 ELISA法 測 定 兔 血 清 中IL-1β、TNF-α含量 取-80℃保存備用的各組兔血清，按照ELISA試劑盒檢測說明書，在樣品孔和標準孔分別加入血清和標準品各50 μL，于各孔再加入50 μL酶標記抗體，封好后放置于37℃恒溫箱中反應30 min；反應結束后，充分棄盡液體，洗滌液清洗，并扣干；在各孔中加入顯色試劑，37℃避光反應10 min；各孔加入終止液50 μL，終止顯色；使用酶標儀450 nm波長測定各孔的吸光度值，繪制標準品線性回歸曲線，計算各組兔血清中IL-1β、TNF-α水平。

2.4.2 HE染色法觀察兔膝關節軟骨病理形態 取各組兔右膝關節軟骨組織石蠟切片，置入干燥箱66 ℃烤片20～30 min，常規脫蠟復水，蘇木素染液染色2～5 min，1%鹽酸酒精分化，飽和碳酸鋰溶液藍化，95%乙醇脫水2 min，伊紅染液染色，常規脫水透明，樹膠封片，顯微鏡觀察結果。

2.4.3 qPCR法檢測兔軟骨組織中Wnt信號蛋白-3α（Wnt3α）、β-catenin、基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）mRNA表達 取-80 ℃凍存的各組兔膝關節軟骨組織，采用Trizol法提取軟骨組織的總RNA，逆轉錄得到cDNA。用RT-PCR進行PCR反應，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作內參基因，引物序列見表1。2-△△Ct計算各指標mRNA的相對表達量，△△Ct=（Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內參）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組內參）。

表1 引物序列

2.4.4 Western blot法檢測兔軟骨組織中Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白表達取-80 ℃凍 存的各組兔膝關節軟骨組織，加入RIPA裂解液裂解，12 000×g離心15 min，收集上清液；配制凝膠，上樣，電泳，轉膜至PVDF膜，室溫封閉2 h；加一抗，4℃孵育過夜，洗滌液（PBST）洗滌；加二抗，室溫孵育1.2 h，洗滌液洗滌；通過ECL發光試劑盒檢測蛋白，使用Image J軟件進行膠片條帶分析，計算相對表達量。

2.4.5 免疫組化法檢測兔軟骨組織中IL-1β、TNF-α的表達 取各組兔膝關節軟骨組織石蠟切片置入干燥箱，66 ℃烤片20～30 min，常規脫蠟至水，抗原修復，緩沖液封閉；加一抗，37 ℃孵育60 min，PBS-T沖洗；加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS-T沖洗；DAB顯色，復染，脫水透明，封片，顯微鏡下采集數據及圖片。用IPP 6.0軟件分析樣本中TNF-α、IL-1β的積分光密度（integral optical density，IOD）值。

2.5 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析。本研究所有數據均符合正態分布，以均值±標準差（x-±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組兔血清IL-1β、TNF-α水平比較 模型組兔血清IL-1β、TNF-α水平顯著高于正常組（P＜0.05），艾灸組兔血清IL-1β、TNF-α水平明顯低于模型組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組兔血清IL-1β、TNF-α水平比較（x-±s） 單位：pg/mL

3.2 各組兔膝關節軟骨組織病理形態比較 HE染色結果顯示，正常組兔膝關節軟骨表面光滑平整，軟骨結構清晰，軟骨細胞數目多、形態自然且分布均勻，基質染色均勻，細胞排列整齊，潮線識別度清晰，軟骨內未見血管、神經及纖維增生。模型組兔膝關節軟骨表面粗糙不平，軟骨結構紊亂，軟骨細胞數目少且分布紊亂、形態異常，潮線不可見。艾灸組兔膝關節軟骨表面局部表現粗糙，軟骨結構較為完整，軟骨細胞數目較多且分布較均勻、形態較為正常，潮線模糊可見。見圖1。

3.3 各組兔膝關節軟骨組織中Wnt3α、β-catenin、MMP-13 mRNA相對表達量比較 模型組兔膝關節軟骨組織Wnt3α、β-catenin、MMP-13 mRNA相對表達量均顯著高于正常組（P＜0.05），艾灸組兔膝關節軟骨組織Wnt3α、β-catenin、MMP-13 mRNA相對表達量均顯著低于模型組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組兔膝關節軟骨組織中Wnt3α、β-catenin、MMP-13 mRNA相對表達量比較（x-±s）

3.4 各組兔膝關節軟骨組織Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達量比較 模型組兔膝關節軟骨組織Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達量顯著高于正常組（P＜0.05）；艾灸組兔膝關節軟骨組織上述蛋白相對表達量顯著低于模型組（P＜0.05）。見圖2、表4。

圖2 各組兔膝關節軟骨組織Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白電泳圖

表4 各組兔膝關節軟骨組織Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達量比較（x-±s）

3.5 各組兔膝關節軟骨組織IL-1β、TNF-α蛋白表達比較 免疫組化結果顯示，正常組兔膝關節軟骨表面完整，軟骨組織中幾乎未見棕色顆粒，即IL-1β、TNF-α蛋白呈弱陽性表達。模型組兔膝關節軟骨表面粗糙，棕色顆粒較多，即IL-1β、TNF-α蛋白呈強陽性表達。艾灸組兔膝關節軟骨表面較平滑，棕色顆粒相對較少，即IL-1β、TNF-α蛋白呈中等陽性表達。見圖3、圖4。

圖3 各組兔膝關節軟骨組織IL-1β免疫組化表達（×200）

圖4 各組兔膝關節軟骨組織TNF-α免疫組化表達（×200）

各組兔膝關節軟骨組織TNF-α、IL-1β蛋白表達IOD值統計結果顯示：模型組兔膝關節軟骨組織IL-1β、TNF-α蛋白表達顯著高于正常組（P＜0.05），艾灸組兔膝關節軟骨組織IL-1β、TNF-α蛋白表達顯著低于模型組（P＜0.05）。見表5。

表5 各組兔膝關節軟骨組織IL-1β、TNF-α蛋白表達（IOD值）比較（x-±s）

4 討論

骨科臨床的常見疾病KOA主要由外傷、肥胖和慢性勞損等因素引起，其病理生理表現主要體現在關節軟骨的退行性改變和繼發性的骨質疏松[6]。隨著人口老齡化現象不斷加劇以及KOA發病呈年輕化趨勢，KOA的發病率逐年上升[1]。目前，KOA主要采用藥物治療，并輔以膝關節鍛煉，以提升患肢肌力與膝關節活動度，改善膝關節的穩定性[11]。但是，非甾體類抗炎藥和止痛藥等易導致胃腸道不良反應，導致患者依從性差[12]。因此，尋找科學有效治療KOA的方法變得十分迫切。

KOA可歸屬于中醫學“痹證”范疇，《素問·痹論》曰：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也”，可見痹證與風寒濕三邪密切相關。艾灸是一種將艾絨點燃后置于腧穴或特定部位，利用其燃燒后所產生的揮發物和熱量透過皮膚組織，通過經絡傳入機體，作用于機體的過程，可溫經通絡、活血通痹，不僅安全性高、價格低廉，還具有操作簡便、副作用少等優點，故艾灸也被廣泛應用于KOA的治療之中。研究表明，艾絨燃燒時具有熱輻射和遠紅外輻射效應，可改善血液循環并通過紅外輻射共振作用使異常細胞產生共振，從而活化組織細胞，改善組織代謝環境[13]。本研究選用的犢鼻穴歸屬多氣多血的足陽明胃經，位于髕韌帶外側凹陷中，具有祛風散寒、通經活絡、消腫止痛的作用。膝關節處皮膚薄，皮下組織少，股動脈、腘動脈、脛前動脈、股深動脈等分支在此處構成動脈網，為膝關節周圍組織提供豐富的血供。艾灸通過上述兩個效應可促進膝關節動脈網功能的恢復，從而改善周圍組織代謝平衡，延緩軟骨破壞和KOA進展。

研究證實，關節軟骨是沒有血管和神經的結締組織，由軟骨細胞和細胞外基質（ECM）組成[14]，其中ECM的主要成分為Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白多糖。KOA患者軟骨退變的病理變化主要是由于膝關節軟骨細胞的增殖與凋亡之間平衡失調、軟骨基質過度降解等導致的[15]。TNF-α、IL-1β是常見且重要的炎性因子，共同參與了軟骨細胞和軟骨基質的破壞，均能誘導軟骨細胞的早期凋亡[16]。兩者在KOA患者的軟骨中均存在過度表達的現象，且兩者在KOA患者血清和關節滑液中含量均明顯升高，其含量與病情嚴重程度呈正相關[16-18]。本研究結果顯示，艾灸組兔血清及膝關節軟骨中IL-1β、TNF-α表達均明顯低于模型組，說明艾灸可緩解KOA兔的關節炎癥反應。

在關節炎（osteoarthritis，OA）的發生發展過程中Wnt/β-catenin信號通路會異常激活，從而導致ECM降解和軟骨細胞凋亡等發生[19]。Wnt信號激活后，會與其受體相結合并活化信號蛋白，從而抑制β-catenin的泛素化和降解，β-catenin分泌因此增加，Wnt進而與轉錄因子結合，從而激活基質金屬蛋白酶（MMPs）等下游基因的表達，促使軟骨破壞[20]。

β-catenin作為具有轉運功能的Wnt信號通路下游因子，在軟骨細胞的分化、增殖和凋亡中起著重要作用。研究證實，KOA患者關節液和血清中β-catenin表達水平升高，并與病情程度呈正相關[21]。而Wnt3α在OA的發展中也同樣起著重要的作用，可作為監測OA病程的指標[22]。MMP-13則是MMPs家族中的一員，參與了軟骨細胞、蛋白多糖、膠原蛋白的降解過程，ECM由此受到破壞且其正常合成被抑制，使關節軟骨腫脹，抗外力能力下降，促使軟骨退行性改變，阻止軟骨修復，并推動OA的發生發展[23]。研究表明，在KOA患者關節液、血液和軟骨中MMP-13表達量均異常升高，同時也表明關節液中MMPs的表達水平可作為間接判斷患者軟骨組織病變程度的指標之一[24]。本研究結果顯示，艾灸組兔膝關節軟骨組織Wnt-3α、β-catenin、MMP-13 mRNA及蛋白的表達均明顯低于模型組，且軟骨表面較平滑，軟骨組織結構相對完整、清晰，軟骨細胞數目相對較多，形態較正常且分布較均勻，提示艾灸可能通過對KOA兔膝關節軟骨中Wnt/β-catenin信號通路關鍵因子表達的抑制作用以延緩KOA兔軟骨破壞進展。

綜上，艾灸能夠改善KOA兔膝關節軟骨破壞，抑制血清及軟骨中IL-1β、TNF-α等炎性因子的表達，下調軟骨中Wnt-3α、β-catenin、MMP-13 mRNA及蛋白的表達，從而達到延緩KOA進展的目的，說明艾灸可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路從而發揮治療KOA的作用。下一步擬通過檢測關節液、滑膜中相關因子的表達以進一步探究艾灸改善KOA的機制研究。同時，艾灸具有熱效應、輻射效應、揮發物效應等多效應的治療特點，今后可進一步探討艾灸在改善KOA中具體發揮效應及具體有效成分的占比，為研發出新型艾灸產品提供理論基礎。