甲胎蛋白和甲胎蛋白異質(zhì)體比率（AFP-L3%）對HBV相關(guān)早期肝細(xì)胞癌的診斷效能分析

唐宇雁， 謝仕斌， 朱建蕓

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院感染科， 廣州 510635

原發(fā)性肝癌，是世界上第6位常見惡性腫瘤，第3位惡性腫瘤致死病因，在我國，居惡性腫瘤的第5位及第2 位惡性腫瘤致死病因［1］。目前，我國肝癌患者年齡標(biāo)化后的總體5 年生存率僅有14.1%［2］，而BCLC 0 期和A 期患者通過根治性治療，5 年生存率可達(dá)69%～86.2%［3］。故提高肝癌的早期檢出率尤為重要及迫切。

目前，國內(nèi)外均推薦對肝細(xì)胞癌（HCC）高危人群進(jìn)行每6個月1次的超聲（US）+血清甲胎蛋白（AFP）篩查［4-5］。但US 對早期肝癌的診斷靈敏度僅有45%～47%［6］，AFP作為臨床上運(yùn)用最廣泛的肝癌標(biāo)志物，其診斷早期肝癌的靈敏度和特異度尚不能令人滿意。含有不同糖基的AFP 亞型與扁豆凝集素親和力不同，其中，AFP異質(zhì)體L3（AFP-L3）與扁豆凝集素親和力最高，主要由惡性肝細(xì)胞產(chǎn)生［7］，具有較高的特異度，目前臨床上主要以AFP-L3 占總AFP 的比例（AFP-L3%）作為肝癌診斷指標(biāo)，但關(guān)于AFP 及AFP-L3%的最佳截斷值尚存在爭議。符合中國國情的中國肝癌分期（China liver cancer staging，CNLC）中早期肝癌主要包括Ⅰa期（單個腫瘤且直徑≤5 cm）、Ⅰb期（單個腫瘤且直徑＞5 cm 或者2～3 個腫瘤且最大直徑≤3 cm）、Ⅱa 期（2～3 個腫瘤且最大直徑＞3 cm），相比BCLC 分期，CNLC 分期對于肝癌的根治性治療條件放寬，建議CNLC 分期中的Ⅱa 期可行根治性治療［8］，而BCLC 分期中則將此部分患者納入B 期，建議行化療栓塞術(shù)。既往關(guān)于AFP-L3%的肝癌研究大多基于BCLC、TNM分期等國外肝癌分期，尚缺乏其在CNLC 早期HBV 相關(guān)HCC 中的診斷效能分析。本研究以HBV 相關(guān)肝病為研究對象，旨在研究AFP 和AFP-L3%在早期肝癌中的診斷效能及其最佳截斷值，以期為臨床醫(yī)生早期發(fā)現(xiàn)肝癌、選擇更優(yōu)化的治療方案提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 入組情況 納入2019年1月—2022年7月于本院就診的慢性乙型肝炎患者346例（CHB組）和HBV相關(guān)肝硬化患者293 例（LC 組）作為對照組（CHB 組+LC組），其中包括597 例ALT 正常對照組；HBV 相關(guān)HCC患者1 080例（HCC組）（其中CNLCⅠa期419例，Ⅰb期132例，Ⅱa期69例，Ⅲ～Ⅳ期460例；ALT正常HCC患者598例，ALT升高HCC患者482例）。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）年齡18～85 歲；（2）HBsAg 陽性的同時，CHB、LC、HCC 診斷標(biāo)準(zhǔn)分別符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019 年版）》［9］、《肝硬化診治指南》［10］、《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019年版）》［8］；（3）ALT正常組肝癌的ALT 水平≤35 U/L；（4）肝癌患者為初次診斷且尚未接受治療；（5）臨床資料完整。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）合并其他原因引起的慢性肝病，如其他嗜肝病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病等；（2）合并其他腫瘤；（3）妊娠或哺乳期婦女；（4）合并HIV感染或其他免疫缺陷性疾病；（5）就診時正在服用華法林或維生素K治療。

1.2 研究方法

1.2.1 觀察指標(biāo) （1）一般資料：年齡、性別、肝性腦病分期；（2）影像學(xué)資料：通過瀏覽患者就診期間的上腹部CT/MRI動態(tài)增強(qiáng)掃描或超聲造影等影像學(xué)結(jié)果，收集肝癌患者的腹水、腫塊個數(shù)、腫塊直徑、門靜脈系統(tǒng)癌栓、肝外轉(zhuǎn)移情況；通過US/CT/MRI 收集良性肝病患者的腹水、肝炎或肝硬化情況；（3）實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：ALT、Alb、PT、TBil、AFP、AFP-L3、AFP-L3%；（4）通過Alb、TBil、PT、腹水、肝性腦病分期評估Child-Pugh 肝功能分級。

1.2.2 研究指標(biāo)檢測方法 AFP 和AFP-L3 的檢測采用磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析法（北京熱景生物技術(shù)股份有限公司），計(jì)算AFP-L3%。當(dāng)AFP 水平較低時，AFP和AFP-L3檢測不出，患者血液檢測報告顯示：AFP＜0.6 ng/mL，AFP-L3＜0.6 ng/mL，AFP-L3%＜5%，此時AFP直接取值0.6 ng/mL，AFP-L3 取值0.6 ng/mL，AFP-L3%取值5%。聯(lián)合檢測時，若有一項(xiàng)大于最佳截斷值，則判斷為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0、MedCalc 15.2.2和R語言4.1.3軟件分析數(shù)據(jù)。偏態(tài)分布計(jì)量資料采用M（P25～P75）描述，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni 法。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)算敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、約登指數(shù)、Kappa值、最佳截斷值、受試者工作特征曲線下面積（AUC），AUC 之間的比較采用Delong 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床基線特征分析 CHB 組、LC 組、HCC 組3 組間的年齡、性別、HBeAg 陽性率、HBV DNA≥100 IU/mL比率、ALT 水平、Child-Pugh 分級的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。HCC 組AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平均高于CHB組和LC組（P值均＜0.001）（表1）。

表1 3組患者臨床基線特點(diǎn)及AFP、AFP-L3、AFP-L3%的比較Table 1 Comparison of clinical baseline characteristics and distribution of AFP， AFP-L3 and AFP-L3% in three groups

2.2 對照組（CHB組+LC組）與早期HCC組（Ⅰa～Ⅱa期）的AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平比較 與對照組相比，早期HCC 組的AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平均高于對照組（P值均＜0.001）（表2）。

表2 對照組與早期HCC組AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平比較Table 2 Comparison of AFP， AFP-L3 and AFP-L3% levels between the control group and the early stage HCC

2.3 ALT 正常的對照組（CHB 組+LC 組）與ALT 正常HCC 組、不同ALT 水平HCC 組的AFP、AFP-L3、AFPL3%水平比較 與ALT 正常的對照組相比，ALT 正常的HCC 組的AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平均升高（P值均＜0.001）（表3）；與ALT 正常的HCC 組相比，ALT 升高的HCC 組的AFP 水平更高（P＜0.01），而兩組之間的AFP-L3%和AFP-L3 水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）（表4）。

表3 ALT正常對照組與ALT正常HCC組的AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平比較Table 3 Comparison of AFP， AFP-L3 and AFP-L3% levels between the control group with normal ALT and the HCC group with normal ALT

表4 不同ALT水平的HCC組的AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平比較Table 4 Comparison of AFP， AFP-L3 and AFP-L3% levels among HCC groups with different ALT levels

2.4 AFP、AFP-L3%在總體HCC 中的診斷效能分析在總體HCC 中，AFP 和AFP-L3%的最佳截斷值分別為8.5 ng/mL 和5%，均獲得良好的AUC（圖1）；AFP 和AFP+AFP-L3%間的AUC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.571，P=0.568），但高于單用AFP-L3%時（AFP vs AFP-L3%和AFP+AFP-L3% vs AFP-L3%的AUC 比較，Z分別為9.329 和10.303，P值均＜0.001），單用AFP 敏感度和特異度分別為70.4%、85.0%。（表5）。

圖1 AFP、AFP-L3%單獨(dú)及聯(lián)合診斷總體HCC的ROC曲線Figure 1 ROC curve of AFP， AFP-L3% alone and combined about the diagnosis of total HCC

表5 AFP、AFP-L3%在總體HCC中的診斷效能分析Table 5 Analysis of the diagnostic efficacy of AFP and AFP-L3% in overall HCC

2.5 AFP、AFP-L3%在早期HCC（Ⅰa～Ⅱa期）中的診斷性能分析及不同截斷值比較 在早期HCC 中，AFP和AFP-L3%最佳截斷值分別是8.7%和5%，AFP 及AFP+AFP-L3% 的AUC 值 均 高 于AFP-L3%（AFP vs AFP-L3%：Z=8.173，P＜0.001；AFP+AFP-3% vs AFPL3%：Z=8.802，P＜0.001），但單用AFP 或者聯(lián)用AFPL3%的AUC 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.609，P=0.543）；對比既往學(xué)者及指南推薦的截斷值（AFP分別取20、200、400 ng/mL；AFP-L3% 分別取10%、15%），不管是單用AFP、AFP-L3%還是兩者聯(lián)用，本研究所得截斷值的敏感度、Kappa 值及陰性預(yù)測值均最高；單獨(dú)使用AFP敏感度和特異度可達(dá)66.9%和85.1%；聯(lián)用AFP-L3%并沒有明顯提高敏感度和AUC（表6，圖2）。

圖2 AFP、AFP-L3%單獨(dú)及聯(lián)合診斷早期HCC的ROC曲線Figure 2 ROC curve of AFP， AFP-L3% alone and combined about diagnosis of CNLC early stage HCC

表6 AFP、AFP-L3%在早期HCC中的診斷性能及截斷值比較Table 6 Diagnostic performance analysis of AFP and AFP-L3% in early stage HCC and comparison of different cut-off points

3 討論

AFP 可以刺激肝癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動和侵襲，通過阻斷AFP 可以實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的凋亡［11-12］。Meta 分析［6，13］顯示，AFP 聯(lián)合US，在總體肝癌中可將US敏感度從78%提升至97%，在早期HCC中，可將US敏感度從45%～51.6%提升至63%～74.1%，并保留83.9%的特異度。AFP-L3%作為另一監(jiān)測HCC 的血清標(biāo)志物，具有高特異度和低敏感度特點(diǎn)。Meta 分析［14］顯示，AFP-L3%診斷肝癌的敏感度僅0.483，特異度高達(dá)0.929。AFP-L3%在早期HCC 中的敏感度和特異度分別為34%和92%［15］。此外，在AFP 低滴度肝癌患者中可見AFP-L3 水平異常［16-17］，且ALT 水平的升高與AFP-L3無關(guān)［18］，相對單獨(dú)AFP監(jiān)測，聯(lián)合AFP-L3%可明顯提高早期HCC 的檢出率［19］。可見，AFP-L3%可作為重要的補(bǔ)充性肝癌篩查指標(biāo)。

由于研究對象、研究類型、檢測方法不同，目前關(guān)于AFP 和AFP-L3%診斷HCC 的截斷值尚有爭議。Choi等［19］發(fā)現(xiàn)，在LC和CHB患者的隨訪中，AFP-L3使用高靈敏的“毛細(xì)管電泳芯片法”，AFP 和AFP-L3%的最佳截斷值分別為5 ng/mL 和4%，且二者聯(lián)合診斷HCC效能最佳，敏感度和特異度分別為79%和87%，并且AFP+AFP-L3%+US 聯(lián)合檢查的敏感度可達(dá)94.3%，明顯優(yōu)于AFP 聯(lián)合US。Lok 等［20］發(fā)現(xiàn)，在丙型肝炎患者長期使用抗病毒藥物治療隨訪中，當(dāng)AFP 截斷值取20 ng/mL 時，總體HCC 敏感度和特異度分別為61%和81%；當(dāng)截斷值取200 ng/mL 時，敏感度下降至22%，伴隨特異度升至100%。Marrero 等［21］的多中心病例對照研究發(fā)現(xiàn)，在納入了包括HBV、HCV、酒精等導(dǎo)致的BCLC 早期HCC 中，AFP 最佳截斷值為10.9 ng/mL，敏感度為66%，并且保留82%的特異度，AFP-L3%最佳截斷值為1.7%，敏感度和特異度分別為37%和94%；國內(nèi)外權(quán)威肝癌指南關(guān)于AFP 和AFP-L3%的截斷值推薦也各不相同。日本肝病學(xué)會建議在監(jiān)測和診斷肝癌時將AFP 和AFP-L3%截斷值取10 ng/mL 和10%［22］，美國食品藥品監(jiān)督管理局建議將AFP-L3%≥10%作為診斷截斷值。而我國原發(fā)性肝癌診療指南［8］建議在排除了良性肝病等情況后，AFP≥400 μg/L高度提示肝癌，尚未提及AFP-L3%的推薦截斷值。但是，薈萃分析［23］顯示，AFP 截斷值取400 ng/mL 時，總體敏感度僅32%。所以，AFP 截斷值取400 ng/mL并不利于我國肝癌的早期篩查。

目前，關(guān)于AFP 和AFP-L3%在早期HCC 中截斷值的研究大都基于BCLC 0期和A期，尚缺乏CNLC Ⅰa～Ⅱa期的研究。李賁等［24］以2011年版《原發(fā)性肝癌診療指南》為診斷標(biāo)準(zhǔn)，以符合米蘭標(biāo)準(zhǔn)的肝移植標(biāo)準(zhǔn)定義為早期HCC，即單發(fā)腫瘤≤5 cm 或多發(fā)腫瘤≤3 個且最大直徑≤3 cm，以AFP＞20 ng/mL 及AFP-L3%＞10%為截斷值，得出AFP＞20 ng/mL 及AFP-L3%＞10%的敏感度、特異度分別為67.1%、62.3%和72.6%、83.1%。與前述文獻(xiàn)［19，21］報道結(jié)果相近。本研究發(fā)現(xiàn)，在HBV相關(guān)CNLC 早期HCC 中，使用傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測AFP-L3，AFP和AFP-L3%的最佳截斷值分別為8.7%和5%，敏感度分別為66.9%和58.1%，特異度分別為85.1%、88.4%；與單獨(dú)AFP 或AFP-L3%相比，聯(lián)合診斷的敏感度、陰性預(yù)測值、Kappa 值均最高，敏感度可提升至67.7%，并保留有84.7%的特異度，但AFP 單用對比AFP+AFP-L3%的AUC 無差異，可見，在HBV 相關(guān)CNLC 早期HCC 中，AFP 具有較好的診斷價值；對比前述文獻(xiàn)［21］報道的其他病因所致肝癌，AFPL3%診斷HBV 相關(guān)早期HCC 的敏感度較高。此外，本研究對比了既往學(xué)者推薦的部分截斷值［8，22，25-26］，結(jié)果顯示，與AFP 截斷值分別取20、200、400 ng/mL 及AFP-L3%截斷值分別取10%和15%的單獨(dú)及兩兩聯(lián)合相比，AFP 和AFP-L3%截斷值分別為8.7 ng/mL 和5%時，單獨(dú)或者聯(lián)合檢測診斷CNLC早期HCC的敏感度、陰性預(yù)測值、Kappa值均最高。因此，筆者認(rèn)為，目前核苷類抗病毒藥物的廣泛使用已大大削減了AFP水平升高受肝臟炎癥活動方面的影響，目前推薦的AFP和AFP-L3%截斷值尚不能獲得令人滿意的早期HCC篩查效果，應(yīng)下調(diào)其在HBV相關(guān)肝癌高危人群中的截斷值，特別當(dāng)AFP和AFP-L3%水平分別大于8.7 ng/mL和5%時，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測，必要時完善診斷性影像學(xué)檢查。與既往研究［27-28］結(jié)果一致，筆者發(fā)現(xiàn)，相對單獨(dú)的AFP或AFP-L3%，二者聯(lián)合診斷總體HCC敏感度最高。

眾所周知，AFP 升高與肝臟活動性炎癥相關(guān)。為排除AFP 由于受到ALT 升高的影響而造成的假性升高，本研究納入了ALT 正常的CHB 和HBV 相關(guān)LC 患者為對照組，探討ALT 正常HCC 的AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平，發(fā)現(xiàn)ALT 升高HCC 組的AFP 水平顯著高于ALT 正常HCC 組，而兩組的AFP-L3 和AFPL3%水平無明顯差異，這與既往研究［18］相似，證實(shí)了AFP 與肝臟炎癥活動相關(guān)，而AFP-L3 不受肝臟炎癥活動的影響。因此，針對不同的ALT 水平，應(yīng)該采用不同的AFP 和AFP-L3%截斷值，AFP 升高同時伴有ALT升高時，應(yīng)更重視AFP-L3%的參考價值。

本研究表明，AFP 在HBV 相關(guān)早期HCC 的最佳截斷值為8.7 ng/mL，AFP-L3%為5%；在肝癌高危人群，AFP＞8.7 ng/mL時應(yīng)警惕肝癌的發(fā)生，需進(jìn)一步排查早期HCC。對于伴有肝臟炎癥活動的患者，AFPL3%升高亦需注意肝癌的發(fā)生。為了早期診斷HCC，有必要下調(diào)AFP和AFP-L3%診斷HCC的閾值。

本研究存在一定局限性，首先，本研究是單中心回顧性研究，未來需要開展多中心的前瞻性研究以證明AFP、AFP-L3%在CNLC 早期HCC 中的診斷意義及最佳截斷值；其次，本研究中基線資料存在一定差異，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量或者使用傾向性評分匹配等方法提高試驗(yàn)組與對照組之間的可比性；最后，本研究使用傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測AFP-L3，當(dāng)AFP 濃度過低時無法得到精確的檢測結(jié)果，可能會影響AFP-L3%的診斷效能評估，若使用高靈敏度的毛細(xì)管電泳芯片法或許可以更準(zhǔn)確評估AFP-L3%的診斷效能。此外，臨床上也需要結(jié)合其他篩查手段及影響因素以尋找性價比更高的肝癌早期篩查模式。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2023 年1 月11 日經(jīng)由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會審批，批號：Ⅱ2022-008-01。所有患者均知情同意。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：唐宇雁負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，收集數(shù)據(jù)，資料分析，撰寫論文；謝仕斌負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，修改論文；朱建蕓負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。