雞內皮素3(EDN3)基因啟動子區序列生物信息學分析

宋興超，安清明，張曉東，孟金柱，趙園園，吳震洋

(銅仁學院農林工程與規劃學院/貴州省梵凈山地區生物多樣性保護與利用重點實驗室，貴州 銅仁 554300)

烏骨雞的營養特性和藥用價值主要與其烏質性狀密切相關，該性狀是烏骨雞新品種選育的一個核心育種目標[1]。通過分子標記輔助選育烏度更深的烏骨雞新品種對提高烏骨雞產業的經濟價值具有重要意義。烏骨雞的烏度決定于體內黑色素沉積量的高低，而黑色素的沉積受多因子共同調控。內皮素(EDN)是一類由內皮細胞分泌的含有21個氨基酸殘基的內皮縮血管肽，具有3種異構體，分別為內皮素1(EDN1)、內皮素2(EDN2)和內皮素3(EDN3)，廣泛存在于脊椎動物血管內皮及各組織細胞[2]。在色素沉積的關鍵部位，EDN3主要由表皮中的角化細胞合成，由旁分泌途徑作用于相鄰的黑色素細胞且對早期黑色素細胞的遷移及增殖分化具有促進作用，并可通過與其受體(EDNRB)結合促進黑色素的合成[3-4]。已有研究表明，EDN3基因可使小鼠[5]、綿羊[6]和羊駝[7]等脊椎動物色素沉積相關基因的表達量及黑色素含量增加，并且適當濃度的外源性EDN3能夠促進黑色素細胞的增殖分化。貓科動物相鄰不同條紋及花斑的皮膚及毛囊中EDN3基因的表達量存在差異，導致真黑色素轉化為褐黑色素，并影響后期花紋的形成[8]。在雞上，復雜遺傳物質的重組能夠導致EDN3基因表達蛋白含量增加，生成過量色素細胞，進而形成烏雞的烏色表型[9-10]，特別是該基因與東鄉綠殼蛋雞雞冠顏色及產蛋量存在關聯[11]。上述研究均表明，EDN3基因是脊椎動物色素沉積的關鍵基因。

啟動子作為結構基因5′調控區上游的一段核苷酸序列，可供RNA聚合酶識別并與模板DNA特異性結合，是基因轉錄水平調控的中心，能夠調控基因表達的強度、部位及模式，保證轉錄起始的精確性和有效性[12]。EDN3基因的轉錄、表達及功能發揮在很大程度上會受到啟動子區序列結構特征的影響。因此，對于基因啟動子的深入研究有助于明確其結構、功能及其表達調控機制。然而，目前EDN3基因調控雞色素沉積的轉錄機制尚不明確。因此，本研究通過獲取雞EDN3基因啟動子區序列，并對其核心啟動子區、轉錄因子結合位點、順式作用元件和CpG島等結構進行生物信息學預測及分析，初步探究雞EDN3基因啟動子區序列結構特征，旨在為下一步開展雞EDN3基因雙熒光素酶報告基因重組載體構建及啟動子區轉錄活性檢測等相關研究提供借鑒與參考，同時也為深入解析EDN3基因調控烏骨雞色素沉積性狀的分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 不同物種EDN3基因啟動子區序列獲得

NCBI數據庫中尚未登錄雞EDN3基因啟動子區序列，利用關鍵詞“EDN3 chicken”在GenBank中“Gene”數據庫進行查詢，獲得該基因定位于雞20號染色體NC_052551.1(11 141 887～11 158 648)，以起始密碼子ATG中“A”作為+1，選取52 bp外顯子1及其上游2 000 bp核苷酸序列共計2 052 bp作為EDN3基因候選啟動子區，用于結構預測和分析。環頸雉(NW_022205322.1)、鵪鶉(NC_029535.1)、巖雷鳥(NC_064448.1)、棕硬尾鴨(NC_048912.1)、鳳頭潛鴨(NC_045574.1)、山羊(NC_030820.1)、綿羊(NC_056066.1)、牛(NC_037340.1)、豬(NC_010459.5)和人(NC_000020.11)EDN3基因啟動子區序列均來源于Ensembl基因組數據庫。

1.2 序列結構分析方法

1.2.1 雞EDN3基因啟動子區結構特征預測

利用不同在線軟件(表1)對雞EDN3基因啟動子區序列的核心啟動子區、轉錄因子結合位點和CpG島等結構進行生物信息學預測及分析。

表1 雞EDN3基因啟動子區結構分析軟件

1.2.2 不同物種EDN3基因啟動子區相似性分析及系統進化樹構建

運用DNASTAR Lasergene 17.3軟件的MegAlign程序進行雞與其他物種EDN3基因啟動子區序列相似性分析；基于MEGA 5.0軟件構建不同物種EDN3基因啟動子區序列分子系統進化樹。

2 結果

2.1 雞EDN3基因核心啟動子區域分析

Promoter 2.0預測雞EDN3基因可能存在2個啟動子臨界位置，分別為1 000 bp(預測分值0.637)和1 700 bp(預測分值0.626)。TSSW程序預測獲得2個啟動子位置，分別為1 679 bp(得分10.45)和1 633 bp(得分7.42)。FPROM程序預測出1個潛在的啟動子，為1 544 bp(得分3.56)，相應的TATA-box為1 514 bp(TTTAAAAG，得分6.56)。BDGP軟件預測雞EDN3基因可能存在3個潛在轉錄起始位點(表2)，其中預測分值較高的2個潛在的轉錄起始位點(TSS)T和A分別位于雞EDN3基因啟動子區5′側翼633 bp和1 547 bp處，推測592～642 bp和1 506～1 556 bp序列為雞EDN3基因潛在的核心啟動子區域。通過上述不同算法的啟動子和轉錄起始位點預測軟件的綜合分析提示，592～2 000 bp可能為雞EDN3基因潛在的候選核心啟動子區域。

表2 雞EDN3基因潛在啟動子區預測結果

2.2 雞EDN3基因啟動子區轉錄調控元件預測

利用DNAMAN 8.0軟件預測轉錄調控元件表明，雞EDN3基因啟動子區存在2個CAAT-box、3個GC-box、6個TATA-box和9個E-box等基本轉錄調控元件(表3)。通過AliBaba 2.1、PROMO、Patch 1.0、JASPAR2022和AnimalTFDB 3.0在線軟件預測雞EDN3基因啟動子區存在多個潛在轉錄因子作用元件(表4)，包括Sp1、C/EBP、NF-1、Ftz、ER、E1、NF-muE1、REV-Erbα、AP-1、GCN4、Oct-1、Olf-1、GATA-1、Krox-20、MRF4、AP-4、RAP1和repressor_of_CA等識別位點共計51個。其中，Sp1、C/EBPα、NF-1、Ftz、ER、E1、NF-muE1、REV-Erbα的結合位點出現頻率較高，分別為20、7、4、2、2、2、2和2個，其他轉錄因子結合位點均為1個。

表3 雞EDN3基因啟動子區基本調控元件

表4 雞EDN3基因啟動子區主要轉錄因子及其結合位點

2.3 雞EDN3基因啟動子區CpG島分析

以CpG檢測含量/期望含量(Observed/Expected ratio)>0.60，GC含量>50%，CpG島長度>100 bp作為參數，基于3種不同的生物信息學在線軟件CpGFinder、MethPrimer和EMBOSS Cpgplot對雞EDN3基因2 052 bp啟動子區進行CpG島預測。結果顯示，CpGFinder預測雞EDN3基因存在1個CpG島，位于1 491～1 965 bp，長度為475 bp。MethPrimer和EMBOSS Cpgplot軟件預測結果一致，在相同位置預測到3個CpG島(圖1)，分別位于1 338～1 449 bp和1 482～1 760 bp，長度分別為112 bp、279 bp和223 bp，表明EDN3基因啟動子區是依賴于CpG島的調控區域。初步提示，該區域內的SNPs可能會影響EDN3基因啟動子的甲基化水平，推測CpG島的存在可能對EDN3因啟動子轉錄調控起關鍵作用。

橫軸線為預測序列的位置，縱軸線為該序列的GC含量，藍色柱狀為預測的CpG島位置。

2.4 不同物種EDN3基因啟動子區序列相似性分析與系統進化樹構建

基于NCBI公共數據庫中環頸雉、鵪鶉、巖雷鳥、棕硬尾鴨、鳳頭潛鴨、山羊、綿羊、牛、豬和人的基因組數據，分別獲得不同物種EDN3基因2 052 bp啟動子區核苷酸序列，利用DNASTAR Lasergene 17.3軟件包中的MegAlign程序進行雞與其他物種EDN3基因啟動子區序列相似性分析。由表5可知，雞與環頸雉EDN3基因啟動子區相似性最高為90.3%，與豬相似性最低為38.8%，初步推測雞該基因啟動子區序列在不同物種間既具有保守性，又存在一定程度的差異。

表5 雞與其他物種EDN3基因啟動子區同源序列的相似性

應用MEGA 5.0構建不同物種EDN3基因啟動子區核苷酸序列的系統進化樹(圖2)表明，該進化樹明顯分為兩大類群，一大類為非哺乳動物，包括雞、環頸雉、巖雷鳥、鵪鶉、棕硬尾鴨和鳳頭潛鴨；另一大類為哺乳動物，包括綿羊、山羊、牛、豬和人。其中雞與鵪鶉同屬雞形目聚在一個小分支，親緣關系最近，與豬親緣關系最遠，這與相似性分析的結果基本一致。

3 討論

由于真核生物啟動子區序列結構對基因表達具有重要調控作用，因此，多數科學工作者在解析目的基因功能時常對啟動子序列進行分析[13-14]。啟動子是一段供RNA聚合酶定位用的核苷酸序列，通常位于基因5′端轉錄起始位點上游2 000 bp，是調控基因轉錄、表達的關鍵順式作用元件，也是利用基因工程技術改良畜禽產品品質的重要組成部分[15]。因此，啟動子序列結構特征生物信息學預測分析對于基因表達調控研究及利用轉基因或基因編輯技術改良畜禽產品品質具有重要理論意義與實踐價值。真核生物的啟動子序列一般存在TATA-box、CAAT-box和GC-box等基本調控元件，與該基因的轉錄調控有著必然的聯系。本研究通過DNAMAN 8.0軟件預測到雞EDN3啟動子區存在2個CAAT-box、3個GC-box、6個TATA-box和9個E-box等基本轉錄調控元件，該結構是否可以提高雞EDN3基因的轉錄效率，有待于進一步深入驗證。關于基因啟動子生物信息學預測的算法較多，不同算法的預測結果可能不盡相同，因此本研究基于Promoter 2.0、TSSW、FPROM和BDGP 4種在線啟動子預測軟件進行綜合比對分析。通過上述不同算法的啟動子和轉錄起始位點軟件的預測結果綜合分析提示，本研究獲得的雞EDN3基因592～2 000 bp為可能的候選核心啟動子區域，下一步將采用擴增不同啟動子缺失片段的方法，通過構建雙熒光素酶重組載體，利用雙熒光素酶檢測系統對不同長度啟動子片段開展活性檢測。CpG島主要位于基因的啟動子區和第一外顯子區，它的存在與否以及存在數目通常是衡量一個基因是否發生甲基化的重要前提，對基因的轉錄調控有重要作用。DNA甲基化是基因表達調控的一種重要表觀遺傳調控機制，可以改變DNA穩定性、構象以及與蛋白質間的相互作用方式[16]。在脊椎動物細胞中，啟動子區CpG島的DNA甲基化情況與基因的表達調控密切相關[17-19]。本研究利用3種不同CpG島在線軟件均預測雞EDN3基因基因啟動子區1 500～2 000 bp區域存在潛在的CpG島，該結構域的存在是否可以通過降低基因甲基化的方式提高雞EDN3基因的表達水平，進而導致烏骨雞烏色性狀的形成尚需深入研究。

轉錄因子(TF)也稱為反式作用因子，通過與RNA聚合酶和順式作用元件的相互識別和結合進而調節基因的表達[20]。TF對基因在轉錄水平調控主要是通過結合到靶基因的啟動子區域，提高靶基因的mRNA的轉錄水平，探究基因啟動子的轉錄因子結合位點，有助于分析調控該基因轉錄的潛在上游TF。為進一步增加預測結果的準確性，本研究利用AliBaba 2.1、PROMO、Patch 1.0、JASPAR2022和AnimalTFDB 3.0在線軟件綜合預測雞EDN3基因啟動子區存在Sp1、C/EBPα、NF-1、Ftz、ER、E1、NF-muE1和REV-Erbα等轉錄因子潛在結合位點。其中，Sp1(specificity protein 1)對GC-box親和力較強，是大多數基因的基本轉錄調控因子，在多種組織中廣泛表達，幾乎參與行使機體內所有細胞功能，在細胞增殖與分化、動物的生長與繁殖等方面可發揮關鍵作用[21-22]，該轉錄因子的數量高達20個，推測位于轉錄起始位點上游的多個Sp1轉錄因子結合位點可能是調節EDN3基因穩定表達的潛在轉錄因子，對該基因的轉錄調控起到關鍵作用，但目前還未在黑色素細胞中進行研究證明。另外，C/EBPα、NF-1等轉錄因子結合位點的功能也很廣泛，能在雞不同組織和器官中發揮作用[23-24]。本研究預測的雞EDN3基因啟動子區多個潛在的轉錄因子是否能夠對該基因的轉錄調控有影響，進而影響烏骨雞烏色性狀的形成有待進一步研究。

4 結論

本研究通過預測分析NCBI數據庫中雞EDN3基因2 052 bp啟動子區序列表明，雞EDN3基因啟動子區存在TATA-box、GC-box、CAAT-box和E-box等基本調控元件和3個CpG島結構域；多種在線軟件綜合預測EDN3基因啟動子區，發現存在多個SP1、C/EBP和NF-1等轉錄因子潛在結合位點。該研究可為后期烏骨雞EDN3基因結構和功能研究提供理論依據，同時為EDN3基因調控烏骨雞烏質性狀分子機制研究提供參考。