澤瀉粉對高能低蛋白日糧誘導的蛋雞肝臟脂沉積的緩解作用

李炎林，蔣文奪，馮躍，賈逸敏，趙茹茜*

(1. 南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；2. 農業農村部動物生理生化重點實驗室，江蘇 南京 210095)

在蛋雞的集約化養殖中，脂肪肝出血綜合征(fatty liver hemorrhagic syndrome，FLHS)是常見的營養代謝性疾病[1]，主要表現為肝臟腫大油膩，質地明顯變脆且顏色呈棕色到土黃色。該病主要發生于產蛋率高峰期或者產蛋后期的雞群，發病率為5%～30%[2-3]，發病雞群產蛋率下降5%～60%[2，4]，死亡率高達20%[5]，嚴重影響蛋雞健康及其生產性能，給養殖業帶來巨大的經濟損失。FLHS肝臟脂肪異常蓄積的主要原因是脂質代謝紊亂。肝脂穩態決定于肝細胞中脂質從頭合成和脂質攝取及脂肪酸β-氧化和極低密度脂蛋白(VLDL)攜甘油三酯外排之間的平衡，脂質獲取大于脂質清除是導致脂質沉積的關鍵因素[6]。FLHS一旦發生，需較長的時間治療和調整才見效，極大影響蛋雞養殖的經濟效益[5]。

澤瀉(Alisma)是一種水生植物，其塊狀根莖可入藥，含三萜、倍半萜等活性成分[7-8]。澤瀉具有多種生物學功能，包括利尿[9-10]、抗炎[11-12]和抗動脈粥樣硬化[13-14]等。大量研究表明，澤瀉能有效緩解非酒精性脂肪肝(NAFLD)[15-17]。澤瀉提純后的單體2，3乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A能夠顯著調控乙酰CoA羧化酶1(ACC1)的磷酸化緩解小鼠高脂飲食和HepG2細胞模型中游離脂肪酸誘導的脂質沉積[18-19]。在HepG2細胞上，澤瀉醇通過降低ACC1及脂肪酸合酶(FASN)的表達緩解棕櫚酸/油酸誘導的脂質沉積[20]。Ahn等[15]發現，由澤瀉組成的方劑能夠通過降低ACC1表達緩解高脂飲食誘導的小鼠脂質變性。這些結果表明，澤瀉可能通過調控脂質從頭合成緩解哺乳動物NAFLD。然而，澤瀉能否緩解高能低蛋白誘導的蛋雞肝臟脂質沉積尚不清楚。由于澤瀉提純成本較高，不適合作為蛋雞飼料添加劑使用，而澤瀉本身成本較低，若直接使用澤瀉粉，在生產上更有應用前景。因此，本試驗通過飼喂高能低蛋白日糧人工誘發蛋雞肝脂沉積，研究澤瀉粉對肝脂沉積的影響，旨在為防控FLHS提供解決方案。

A.產蛋率；B.蛋重；*表示與CON組比較，P<0.05。

A. 脂質攝入相關基因mRNA表達(n=6)；B. 脂質清除相關基因mRNA表達(n=6)。

A. GR蛋白WB結果(n=8)；B. GR mRNA相對表達(n=6)；C. GR蛋白相對表達量(n=8)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在南京農業大學試驗動物中心內進行。澤瀉購自南京中西醫結合醫院。澤瀉打磨成粉，篩分粒度為140目，飼料中按澤瀉醇含量72 mg/kg添加[21]。澤瀉醇含量測定參考王巧娥等[22]的方法，所使用的標準品2，3乙酰澤瀉醇購自上海源葉生物科技有限公司(B21641-20 mg)，純度≥98%。

1.2 試驗設計與飼養管理

海蘭褐蛋雞72只,體重(1.69±0.09)kg,260日齡，飼養在南京農業大學實驗動物中心，室溫約24 ℃，光照16L：8D。每籠3只蛋雞，雞籠規格60 cm×46 cm×44 cm，安裝乳頭自動飲水器以提供飲水。蛋雞隨機分成3組，對照組(CON)飼喂對照日糧(10.9 MJ/kg代謝能，16.9%粗蛋白)，高能低蛋白日糧組(HF)飼喂高能低蛋白日糧(13.0 MJ/kg代謝能，12.1%粗蛋白)，澤瀉添加組(HFA)在飼喂高能低蛋白日糧的基礎上添加澤瀉粉，試驗持續12周。飼料配方和營養成分組成如表1所示，在整個試驗的過程中，母雞每日限飼喂養，110 g/只，自由飲水。12周之后，每組籠中隨機選擇1只母雞，快速斷頭處死，肝臟樣品在液氮中快速冷凍，并保存在-80 ℃。

表1 試驗日糧組成及營養成分

1.3 測定指標及方法

1.3.1 產蛋性能

每天記錄產蛋數、蛋重并計算產蛋率及平均蛋重，計算方法參考冉茜等[23]方法。

1.3.2 蛋品質測定

每組隨機選擇8枚蛋，進行蛋品質測定。

蛋殼強度(kg/cm2)：蛋受到外力碰撞后的承受能力，是反映蛋殼品質的主要指標。使用蛋殼強度測定儀(WW-2A，Nanjing Soil Instrument Factory Co.，Ltd.，南京)檢測蛋殼重(g)、蛋黃重(g)；使用分析天平檢測蛋殼厚度(mm)，利用螺旋測微器對雞蛋的大頭小頭及中間部分(除去蛋黃膜)進行測量，求3個點平均值，即為蛋殼厚度；蛋白高度(mm)、蛋黃顏色指數、哈氏單位使用多功能蛋品質分析儀(EMT-5200，Robotmation Co.，Ltd.，東京，日本)進行檢測。

1.3.3 血液生化指標檢測

使用全自動生化分析儀(Hitachi7020，Tokyo，Japan)測定血漿中的谷丙轉氨酶活性(貨號H001)和甘油三酯(貨號H201)、總膽固醇(貨號H202)含量。上述試劑均購自美康生物科技有限公司。

1.3.4 肝臟中甘油三酯檢測

肝臟中甘油三酯檢測試劑盒(貨號E1013)購自北京普利萊基因技術有限公司，具體根據試劑盒附帶的說明書進行檢測。

1.3.5 肝臟油紅染色

雞的肝臟冰凍切片(10 μm)室溫靜置30 min，蒸餾水洗滌3遍(去掉包埋劑)，每次5 min；隨后用60% 異丙醇浸洗2 min；將切片置于油紅工作液染色，蒸餾水洗滌3遍，蘇木精復染，然后用甘油明膠封片，顯微鏡觀察。

1.3.6 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測

稱取30 mg肝臟樣品(肝臟組織提前用液氮研磨)，使用TRIzol法提取組織中總RNA，按照試劑盒內附帶的說明書進行操作。用NanoDrop檢測RNA的濃度和純度(OD260/OD280比值在1.8 ～ 2.0之間)[24]。按照試劑盒說明書(AE341，全式金)逆轉錄為cDNA。PCR引物根據NCBI上相關序列，使用Primer 5.0軟件進行設計，序列見表2。

表2 RT-qPCR引物序列

1.3.7 蛋白含量的Western blot(WB)分析

RIPA裂解液配制：1% Triton-100，0.5% 脫氧膽酸鈉，150 mmol/L NaCl，0.1% SDS，50 mmol/L Tris以及1%蛋白酶抑制劑(B14001，Bimake)。稱取30 mg肝臟樣品，加入預冷的RIPA蛋白裂解液。使用自動勻漿器勻漿，5 000 r/min，20 s 1次，重復8次。勻漿結束后將樣品置于冰上靜置10 min，8 000 r/min 離心10 min，取上清液，即為全蛋白提取物，使用蛋白印跡方法檢測肝臟組織GR含量，蛋白質的上樣量為40 μg，使用Image J 軟件計算相關蛋白灰度值。

1.4 統計學分析

本試驗模型采用兩步t檢驗(CONvs. HF和HFvs. HFA)進行統計學處理，使用GraphPad Prism進行繪圖，結果以“平均值 ± 標準差”的形式表示，P<0.05表示結果具有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 蛋雞產蛋性能、蛋品質指標及血液生化指標

以周為單位計算蛋雞的產蛋率，得到折線圖，結果表明在整個試驗的過程中，蛋雞的產蛋率沒有顯著性變化(圖1A)。以周為單位計算雞蛋重量，得到折線圖(圖1B)，與CON組相比，第1～4周HF組蛋重沒有顯著變化，而5～8周、9～12周蛋重顯著降低(P<0.05)。

蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋殼重、蛋黃重、蛋白高度、蛋黃顏色指數及哈氏單位進行檢測，發現蛋品質相關指標無顯著性變化。剖檢之后對血漿中的肝損傷、脂質相關指標進行檢測，谷丙轉氨酶在該模型中無顯著性變化，說明該模型可能并未造成肝損傷。同時血漿中膽固醇和甘油三酯也無顯著性變化(表3)。

表3 蛋雞的蛋品質及血液生化指標

2.2 蛋雞肝臟中甘油三酯含量

蛋雞肝臟組織病理學評估結果表明，HF組和HFA組的切片上均可以觀察到脂滴(圖2A)，但是澤瀉粉的添加顯著降低了肝臟中的脂質沉積(圖2B)。肝臟中甘油三酯含量的檢測結果支持以上觀點(圖2C)，與對照組比較，HF組甘油三酯含量顯著升高(P<0.05)；與HF組相比，HFA組甘油三酯含量顯著降低(P<0.05)。

2.3 蛋雞肝臟中脂質代謝基因表達

RT-qPCR檢測肝臟脂攝入相關基因(圖3A)和脂清除相關基因(圖3B)，與CON組比較，HF組脂質從頭合成基因ACC、FASN及硬脂酰輔酶 A 脫飽和酶-1 (SCD1)顯著升高(P<0.05)；與HF組比較，HFA組上述基因顯著降低(P<0.05)。

2.4 蛋雞肝臟中核轉錄因子GR基因和蛋白表達

RT-qPCR檢測肝臟GR的mRNA表達量(圖4B)，與CON相比較，HF組GR mRNA表達顯著升高(P<0.05)；與HF組比較，HFA組GR mRNA表達量顯著降低(P<0.05)。Western blot 檢測GR蛋白表達水平(圖4A，4C)，與CON組相比較，HF組GR 蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與HF組比較，HFA組蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，與RT-qPCR結果一致。

3 討論

FLHS是一種常見的慢性代謝性疾病，是目前蛋雞集約化養殖過程中死亡率最高的疾病[25]。目前已報道有多種藥物可以緩解蛋雞脂肪肝。女貞子提取物[26]、苜草素[27]及甜菜堿[28]均可有效地緩解使用高能低蛋白日糧人工誘發的蛋雞FLHS。在臨床實踐中，孟憲勇等[4]指出包含澤瀉的當歸芍藥湯可以有效地控制FLHS的發生。許英民[3]指出茯苓、澤瀉、白皮、厚樸、陳皮、當歸及枳殼等水劑可以使雞群FLSH得到合理控制。這些報道表明藥物添加可以有效預防FLHS的發生。在嚙齒動物模型中，澤瀉提取物[17，29-30]、包含澤瀉的方劑[15，31-32]及澤瀉提取物單體[16，18-19，33]均可以有效緩解不同方式誘發的NAFLD。我們的試驗結果表明，在高能低蛋白模型下，蛋雞肝臟甘油三酯顯著升高，同時油紅染色發現肝臟中的脂滴明顯增多，添加澤瀉粉顯著逆轉蛋雞高能低蛋白日糧誘導的脂質沉積。在哺乳動物上，NAFLD包括單純的脂肪變性、肝炎，一旦發生炎癥進而可以發展成肝纖維化、肝硬化甚至肝癌[34]。單純的脂肪變性表現為肝臟中甘油三酯的升高，但是無其他的病理學特征，是一種良性脂肪肝[35]。谷丙轉氨酶是反應肝損傷的指標，本試驗結果發現其在該模型下沒有顯著性變化，暗示蛋雞肝臟還未發展到肝損傷階段，以上結果表明澤瀉粉可以緩解蛋雞高能低蛋白日糧誘導的良性脂肪肝。

脂質從頭合成基因(FASN、ACC1和SCD1)在肝細胞中脂質內源性輸入中扮演著重要角色。研究發現FASN、ACC1及SCD1在NAFLD發生時顯著升高[36-37]。本研究結果顯示，在高能低蛋白日糧飼喂模型中，脂從頭合成基因(FASN、ACC1和SCD1)mRNA顯著增加，而脂質攝入(CD36)、脂質β氧化(CPT1、PPARα)、脂質外排(MTTP)及脂解(ATGL、HSL)等調控基因在該模型下沒有顯著變化，日糧添加澤瀉粉能夠顯著逆轉高能低蛋白日糧誘導的FASN、ACC1和SCD1 mRNA升高，說明澤瀉粉通過調控脂質從頭合成緩解蛋雞肝臟脂質沉積。

實驗室之前的研究表明，在皮質酮誘導的雞肝臟脂質沉積模型中GR通過與啟動子結合上調FASN、ACC1和SCD1基因的表達[38]。本研究結果表明，與對照組相比，高能低蛋白處理組可以顯著促進GR mRNA和蛋白的表達，說明高能低蛋白日糧可能通過激活GR，調控脂質的從頭合成，從而促進了肝臟的脂質沉積。澤瀉粉添加顯著逆轉高能低蛋白日糧誘導GR mRNA水平和蛋白的含量的升高，原因可能是澤瀉中三萜類化合物可以作為配體與GR結合，抑制GR的活性[39]。

4 小結

澤瀉粉添加到蛋雞飼料中可以有效緩解高能低蛋白日糧誘導的肝臟甘油三酯的升高，導致肝臟脂滴明顯減少。在基因水平上，澤瀉顯著降低了高能低蛋白日糧誘導的脂質代謝基因FASN、ACC1和SCD1以及核轉錄因子GR基因和蛋白水平的升高，說明澤瀉可能通過抑制GR降低從頭合成基因的表達，從而緩解肝臟中的脂質沉積。綜上，高能低蛋白日糧可能通過GR介導的脂質從頭合成基因過量表達，導致蛋雞肝臟脂質沉積；澤瀉能夠通過減輕上述反應，對蛋雞FLHS有一定的保護作用。