正交結合熵權TOPSIS法優化酶解棕櫚粕的條件

韓雨琪，章勝紅，潘樹濤，曾慧，杭蘇琴

(南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095)

我國飼用蛋白資源嚴重匱乏，制約了畜牧業現代化進程。因此，應大力研發和應用非常規蛋白質資源，以節約豆粕等資源[1]。棕櫚粕(palm kernel cake，PKC)是棕櫚果仁榨取棕櫚油后的副產品，由于其價格優勢大且可替代常規飼料資源，所以我國近年來大量進口PKC[2]。PKC在豬[3]、奶牛[4]、羊[5]等動物飼喂試驗上展現出良好的經濟效益，在畜禽養殖中有廣泛的應用前景[6]。

棕櫚粕營養豐富、價格低廉，且有大量的非淀粉多糖(non-starch polysaccharides，NSPs)，其中纖維素含量約為12%，甘露聚糖含量達78%[7]。半乳甘露聚糖和甘露聚糖是存在于棕櫚粕中的抗營養因子，甘露聚糖在動物消化道增加食糜黏度，阻礙營養物質的消化吸收，限制動物對其利用[8]。

研究表明，添加外源酶可改善棕櫚粕適口性，提高養分消化率[9]。甘露聚糖酶酶解棕櫚粕的最優條件已有報道[10]，但用蛋白酶、甘露聚糖酶和纖維素酶3種酶復合來酶解棕櫚粕的研究還較少?；诘鞍踪|易與纖維素形成復合物，導致蛋白質不能直接利用[11]。優化3種酶組成的復合酶體系的酶解條件，對提高棕櫚粕的營養價值具有一定的意義。近年來廣大學者將熵權法與TOPSIS法結合，以綜合評價試驗方案，挑選出更準確更客觀的參數組合[12]。

為降低甘露聚糖和粗纖維的含量，提高其利用率及消化率，本研究篩選了蛋白酶、甘露聚糖酶和纖維素酶3種酶復合的組成及濃度，結合正交試驗和熵權法TOPSIS獲得棕櫚粕的適宜酶解條件，以提高棕櫚粕的營養價值，為棕櫚粕開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

選用產自馬來西亞的棕櫚粕，粉碎后過40目篩備用。甘露聚糖酶(1 000 U/g)、纖維素酶(50 000 U/g)、酸性蛋白酶(50 000 U/g)、木瓜蛋白酶(800 000 U/g)和中性蛋白酶(100 000 U/g)均購自上海源葉生物科技有限公司。

硫酸、三氯乙酸溶液(150 g/L)、五水硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、3，5-二硝基水楊酸均為市售分析純試劑。

1.2 儀器與設備

TECAN酶標儀、HENGZI電熱恒溫鼓風干燥箱、ANKOM A200i纖維分析儀、ANKOM F57濾袋、封口機、干燥器、分析天平、凱氏定氮儀FOSS kjeltec8400,消化爐和CRYSTAL臺式恒溫振蕩器。

1.3 試驗設計

試驗1研究了5種酶制劑的單獨適宜添加量和作用效果，確定復合酶組成及復合酶的各種酶制劑的優化添加劑量。

試驗2優化了料水比、復合酶酶解時間、酶解pH值和酶解溫度4個水解條件，分別進行單因素試驗，每個因素每個水平設置3個重復。

試驗3對顯著影響水解效果的料水比、復合酶酶解時間、酶解pH值和酶解溫度再進行4因素3水平L18(34)正交試驗，通過熵權TOPSIS方法進行綜合分析，選出最佳酶解條件。

1.4 試驗方法

1.4.1 蛋白酶種類的篩選

在37 ℃ pH值4.8條件下，分別用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶，在底物添加量為5.0 g、加酶量為250 U/g條件下酶解24 h，以三氯乙酸可溶蛋白含量為指標篩選出酶解效果最佳的蛋白酶種類。

1.4.2 復合酶中各酶制劑濃度的篩選

以1.4.1篩選出的酸性蛋白酶為基礎，在37 ℃ pH值4.8，底物用量5.0 g，料水比為1∶2條件下，水解24 h，分別篩選0、25、45、100、200和400 U/g甘露聚糖酶，0、40、80、120、160和200 U/g纖維素酶，0、125、250和500 U/g酸性蛋白酶的最佳用量，酶解結束后沸水浴煮沸10 min終止反應。多糖酶水解效果以還原糖產生量為指標確定；蛋白酶水解效果以三氯乙酸可溶蛋白增量為指標確定。

1.4.3 復合酶水解條件的單因素優化

準確稱取5.0 g棕櫚粕，加入由甘露聚糖酶45 U/g、酸性蛋白酶250 U/g和纖維素酶160 U/g組成的復合酶。分別研究料水比為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5和1∶3，酶解時間為5、8、12、16和20 h，酶解pH值為3.2、4.0、4.8、5.6和6.4；酶解溫度為22、27、32、37和42 ℃條件下的單因素水解試驗。除研究因素外，其他酶解條件和評價方法均同前。每個水平重復3次。

1.4.4 正交試驗法優化復合酶酶解條件

在單因素試驗基礎上，對料水比、時間、酶解pH值和酶解溫度進行4因素3水平的 L18(34)正交試驗，正交試驗效果以三氯乙酸可溶蛋白、還原糖和纖維素含量為指標確定，正交試驗因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

1.5 測定指標及方法

反應終止后所有樣品將料水比稀釋至1∶6，使用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖含量[13]。將樣品在105 ℃下烘干4 h，參照《飼料原料中酸溶蛋白的測定》NY/T 3801—2020的方法測定三氯乙酸可溶蛋白含量。采用ANKOM A200i型半自動分析儀，使用ANKOM F57濾袋測定粗纖維含量。

1.6 數據統計分析

本研究所有試驗數據均重復 3次，結果以“平均值±標準差”表示，采用Graph Pad Prism 7.0軟件繪制圖，通過SPSS 20.0中的 One-way ANOVA 進行單因素方差分析，并使用Duncan法進行多重比較，采用在線SPSSAU系統平臺中熵權TOPSIS法對數據進行綜合評價，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 復合酶組成的確定

2.1.1 纖維素酶濃度的篩選

由表2可知，在0～80 U/g濃度范圍內，還原糖含量隨纖維素酶濃度的增加有顯著升高(P<0.05)；而當纖維素酶濃度為160 U/g時，還原糖含量基本達到最大值，且隨著濃度的增加，還原糖含量升高不顯著(P>0.05)?？紤]到經濟節約原則，選擇160 U/g為纖維素酶的最佳用量。

表2 纖維素酶濃度對還原糖含量的影響

2.1.2 甘露聚糖酶濃度的篩選

如表3所示，在0～45 U/g濃度范圍內，隨甘露聚糖酶濃度的增加，還原糖含量呈上升趨勢，且當甘露聚糖酶濃度為45 U/g時，還原糖含量已達到較大值?？紤]到成本的因素，選擇45 U/g為甘露聚糖酶的最佳用量。

表3 甘露聚糖酶濃度對還原糖含量的影響

2.1.3 蛋白酶種類的篩選

表4顯示，酸性蛋白酶組酶解棕櫚粕中三氯乙酸可溶蛋白含量顯著高于其他處理組(P<0.05)，而中性蛋白酶組酶解棕櫚粕中三氯乙酸可溶蛋白含量與木瓜蛋白酶組無顯著差異(P>0.05)，故選擇酸性蛋白酶組成復合酶。

2.1.4 酸性蛋白酶濃度的篩選

如表5所示，不添加酸性蛋白酶時，三氯乙酸可溶蛋白含量僅為0.72%，而隨著酶濃度逐漸增加，三氯乙酸可溶蛋白含量也明顯提高，并在250 U/g時，酸溶蛋白含量已達到較大值，且繼續升高濃度，三氯乙酸可溶蛋白含量增加不顯著(P>0.05)，故選擇250 U/g為酸性蛋白酶的最佳用量。

表5 酸性蛋白酶濃度對三氯乙酸可溶蛋白含量的影響

2.2 復合酶水解條件的單因素優化

2.2.1 料水比對復合酶水解效果的影響

由圖1所示，隨著水分含量的增多，還原糖含量也相應增加，且在料水比為1∶3時，還原糖含量達到最大值，為55.53 mg/g。而料水比變化對三氯乙酸可溶蛋白蛋白含量無顯著影響，基本都保持在1.39%～1.82%之間。因此，最終選擇料水比 1∶2、1∶2.5、1∶3進行正交優化試驗。

同一指標不同橫坐標組之間比較；小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；下同。

2.2.2 酶解時間對復合酶水解效果的影響

圖2顯示，隨著酶解時間的增加，三氯乙酸可溶蛋白含量和還原糖含量均呈上升趨勢，且在24 h達到最大值，故本研究選定復合酶解時間16、20、24 h 進行正交優化試驗。

同一指標不同時間比較。

2.2.3 酶解pH值對復合酶水解效果的影響

由圖3可知，pH值的升高或降低都會抑制還原糖的生成。當pH值為3.2時，還原糖含量僅為1 mg/g；當pH為值4.8時，還原糖含量和三氯乙酸可溶蛋白含量都到達峰值(54.42 mg/g，1.473%)。因此，最終選定pH值4.0、4.8、5.6進行正交優化試驗。

同一指標不同pH值比較。

2.2.4 酶解溫度對復合酶水解效果的影響

由圖4可見，當溫度在27～42 ℃范圍內，隨著酶解溫度的升高，三氯乙酸可溶蛋白含量和還原糖含量先升高后降低，且在37 ℃達到最高值(1.473%，54.57 mg/g)。當溫度增加到47 ℃，三氯乙酸可溶蛋白含量和還原糖含量顯著低于37 ℃時的三氯乙酸可溶蛋白和還原糖含量(P<0.05)。綜上所述，選定32、37、42 ℃進行正交優化試驗。

同一指標不同溫度比較。

2.3 正交試驗結果

正交試驗結果見表6。由表 7 的方差分析結果可知，料水比對還原糖和三氯乙酸可溶蛋白含量有顯著影響(P<0.05)。

表6 正交試驗結果

表7 方差分析結果

2.4 Topsis綜合分析

用在線SPSSAU系統平臺中熵權Topsis法對數據進行分析，得到還原糖、三氯乙酸可溶蛋白和粗纖維權重系數分別為48.57%、48.60%和2.83%。由表8可知，第5組的試驗條件為最佳酶解條件，即料水比1∶2、時間24 h、pH值4.8、溫度42 ℃。

表8 TOPSIS評價計算結果

3 討論

3.1 復合酶的確定

在飼料中添加外源酶制劑已是公認的經濟有效的提高飼料利用率的方法。甘露聚糖酶能將甘露聚糖降解為寡糖和單糖[14]，反應中添加甘露聚糖酶能提高產物中還原糖的含量。纖維素酶能夠通過打破纖維素中的1，4-β-糖苷鍵將纖維素降解為葡萄糖[15]。外源蛋白酶將飼料中大分子水解為多肽和氨基酸是通過斷裂肽鍵、破壞蛋白質一級結構，從而提高其消化率[16]。寡糖和葡萄糖均屬于還原糖，以還原糖含量為指標能有效描述這兩種酶的酶解效率。蛋白質可被蛋白酶水解成小肽，這些小肽可被三氯乙酸溶解，以三氯乙酸可溶蛋白含量為指標能有效描述蛋白酶的酶解效率。

3.2 復合酶水解條件的單因素優化

料水比即底物與水劑的比例，當水劑的量少而樣品的濃度高時，樣品與酶沒有足夠大的接觸面積[17]，還原糖生成量受到限制。而水劑含量增多，一定量的水劑可以使底物和酶制劑碰撞機率增加，促進酶解反應，從而提高還原糖含量[18]。

酶與底物結合需要一定時間，時間過短，酶與底物結合不完全，生成物少。而酶具有專一性，隨酶解時間延長，底物可被結合鍵已基本被結合完全，生成物增加量逐漸減少。

pH值可影響酶的空間結構，從而改變酶的構象及活性。當pH值過低，甘露聚糖酶失去活力，使得還原糖含量極低。而在過酸條件下，促進了蛋白質的水解，改變蛋白質的一級結構和高級結構[19]，從而增加了三氯乙酸可溶蛋白的含量。本研究得到的最適pH值與目前報道的大多數甘露聚糖酶[20]、酸性蛋白酶、纖維素酶[21]的適宜pH值范圍相符，這也說明酶解反應需要在合適的 pH值下才能高效進行。

溫度對復合酶酶解效果的影響是從反應速度和酶活兩個方面影響反應效果的。在低溫條件下，酶活性穩定，但是分子運動速度慢。物質擴散速度慢，所以反應進程慢。隨著溫度在一定范圍內升高，反應速度增加并且酶逐漸達到最適反應溫度，會得到最佳的試驗效果。溫度過高，生成物含量反而降低，這可能是因為飼料加工過程中溫度過高可能會增強美拉德反應，阻斷了蛋白酶活性[22]。

3.3 最優條件下酶解對棕櫚粕還原糖、三氯乙酸可溶蛋白和纖維素含量的影響

與固定條件(溫度37 ℃、pH值4.8、料水比1∶2、時間24 h)相比，在優化后條件下反應，還原糖含量與蛋白質含量均顯著提高(54.57 mg/gvs. 65.29 mg/g；1.47%vs. 3.86%)。這與前人研究結果一致，者園園[10]優化了甘露聚糖酶酶解棕櫚粕的條件如時間、pH值和溫度，將還原糖含量提高至7.43 mg/mL。說明優化酶解條件是提高復合酶酶解效率、降低棕櫚粕中甘露聚糖的有效方法。經優化后，粗纖維含量有所降低，表明還原糖產生的原因之一是粗纖維的降解，也說明纖維素酶的添加有效地破壞了細胞壁，使它包裹著的甘露聚糖得以釋放，提高了甘露聚糖酶解效率，在很大程度上減輕了NSPs的抗營養作用。樊云雪[23]探究了單酶(β-甘露聚糖酶)和復合酶(β-甘露聚糖酶和纖維素酶)酶解PKC中甘露聚糖的最佳工藝參數，發現使用復合酶水解率提高6%且酶解產物中葡萄糖含量增高，這也進一步證實了將酶解條件優化的有效性。

4 結論

甘露聚糖酶、酸性蛋白酶和纖維素酶組成的復合酶在料水比1∶2、時間24 h、pH值4.8和溫度42 ℃條件下水解棕櫚粕，反應后還原糖含量可達65.29 mg/g，三氯乙酸可溶蛋白含量可達3.86%，粗纖維降至8.58%，能有效改善棕櫚粕的營養價值。