表達(dá)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白的偽狂犬病病毒拯救與純化

張劉輝，劉穎，馬曉，趙友驛，韓瑩瑩，金鉞，陳紅英

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是當(dāng)前我國豬場(chǎng)非常重要的一種病毒性疾病，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染所致，引起仔豬呼吸系統(tǒng)疾病、生長(zhǎng)遲緩和母豬繁殖障礙[1-2]。2006年，高致病性PRRSV(HP-PRRSV)引起的“高熱病”在我國南方豬群中暴發(fā)與流行，隨后迅速傳播到我國26個(gè)省份，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了毀滅性破壞[3]。近年流行病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，HP-PRRSV仍然在我國豬群中流行[4-5]。目前預(yù)防HP-PRRS的疫苗是滅活疫苗和弱毒疫苗，但是現(xiàn)有疫苗難以對(duì)PRRSV感染提供有效保護(hù)。因此，開發(fā)一種針對(duì)HP-PRRSV的新型疫苗，對(duì)于控制高致病性PRRS疫情尤為重要。

偽狂犬病(porcine pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(PRV)引起多種動(dòng)物的一種高度接觸性傳染病[6]。豬是該病的唯一自然宿主，各年齡階段豬都受到偽狂犬病的威脅[7]。自2011年后，我國多個(gè)省份免疫過Bartha-K61疫苗的規(guī)?；i場(chǎng)暴發(fā)了PRV變異毒株引起的新一輪PR疫情，一直困擾著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[8-10]。

PRV基因組為雙鏈線性DNA，其長(zhǎng)度為150 kb左右，包含多個(gè)非必需基因，可供外源基因插入與表達(dá)，毒力不返強(qiáng)，是常用的病毒活載體之一[2，11]。本研究以PRV三基因缺失株rPRV-gE-/gI-/TK-為親本株，通過同源重組技術(shù)，將HP-PRRSV GP5基因插入到偽狂犬病毒基因組中，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將重組病毒中增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因進(jìn)行剪接，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)HP-PRRSV GP5蛋白的重組病毒rPRV-GP5/HP，以期為豬繁殖與呼吸綜合征和豬偽狂犬病的防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和毒株

ST細(xì)胞由鄭州豬重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。PRV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pG、CRISPR/Cas9 EGFP基因雙敲除質(zhì)粒pX459-gRNA1-EZ-gRNA2以及PRV三基因缺失株rPRV-gE-/gI-/TK-均由鄭州豬重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。HP-PRRSV HeN-HC毒株由鄭州豬重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 主要試劑

病毒 RNA 快速抽提試劑盒、HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit和Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase購自南京諾維贊生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、Endo-Free Plasmid Mini Kit I-fast購自O(shè)MEGA公司；堿性磷酸酶(CIAP)、限制性酶BamHⅠ購自寶生物工程(大連)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑ZLip2000購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；兔抗PRRSV-GP5血清(bs-4504R)購自北京博奧森生物科技有限公司；FITC-山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖、DAPI染液(1 mg/mL)和抗熒光衰減封片劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

基于GenBank中公布的高致病性PRRSV HuN4毒株GP5基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物GP5-HP-F/R(表1)，BamHⅠ引入至引物的5′端。根據(jù)PRV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pG上gG啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)1條引物pG-F為上游引物，與GP5-HP-R組成1對(duì)引物，用于鑒定GP5基因的插入方向。引物EGFP-F/R用于EGFP基因表達(dá)盒的鑒定。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 重組質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP的構(gòu)建

用病毒 RNA 快速抽提試劑盒提取HP-PRRSV HeN-HC毒株的RNA，根據(jù)HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit說明合成cDNA，利用GP5基因特異引物GP5-HP-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；厥盏臄U(kuò)增產(chǎn)物克隆到已酶切并用CIAP去磷酸化的pG中質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP(圖1)，并導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α。選取單個(gè)菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中，用引物pG-F和GP5-HP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

圖1 重組病毒rPRV-GP5/HP的構(gòu)建流程

1.5 重組病毒rPRV-GP5/HP-EGFP的拯救與純化

參照Endo-Free Plasmid Mini Kit I-fast說明抽提質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP。當(dāng)6孔板中ST細(xì)胞密度為80%左右時(shí)，將PRV變異株三基因缺失毒株rPRV-gE-/gI-/TK-接種至6孔板內(nèi)，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱吸附2 h后，利用轉(zhuǎn)染試劑ZLip 2000，將質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞，5 h后加入新鮮培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞病變(CPE)達(dá)80%時(shí)反復(fù)凍融3次，收獲病毒液。

將10-1、10-2、10-3、10-4和10-5稀釋度700 μL病毒液接種于6孔板內(nèi)ST單層細(xì)胞，37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，吸棄孔內(nèi)液體后加入含1.3%低熔點(diǎn)瓊脂糖、5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，進(jìn)行重組病毒rPRV-GP5/HP-EGFP的純化。每次病毒純化時(shí)，挑取稀釋度最大孔內(nèi)的單個(gè)綠色熒光蝕斑進(jìn)行下一輪的病毒純化。收獲的病毒液重復(fù)上述步驟，直至稀釋孔內(nèi)所有蝕斑均呈現(xiàn)綠色熒光時(shí)，提取病毒DNA，用引物GP5-HP-F/R進(jìn)行PCR鑒定。

1.6 重組病毒rPRV-GP5/HP的拯救與純化

將ST細(xì)胞加入到6孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)，將CRISPR/Cas9 EGFP基因雙敲除質(zhì)粒pX459-gRNA1-EZ-gRNA2轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞，孵育5 h，再將rPRV-GP5/HP-EGFP以10-3、10-4和10-53個(gè)稀釋度接種于已轉(zhuǎn)染了雙敲除質(zhì)粒的ST細(xì)胞中，37 ℃ 5% CO2孵育2 h，然后添加新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞發(fā)生CPE，收獲病毒液。重組病毒純化步驟同1.5，但是應(yīng)挑取最大稀釋孔內(nèi)無綠色熒光蝕斑，直到觀察到所有稀釋孔內(nèi)所有蝕斑無綠色熒光時(shí)，提取病毒DNA，用引物GP5-HP-F/R和EGFP-F/R進(jìn)行重組病毒rPRV-GP5/HP的鑒定。

1.7 ST細(xì)胞中重組病毒rPRV-GP5/HP的GP5基因轉(zhuǎn)錄檢測(cè)

將純化的重組病毒rPRV-GP5/HP接種到6孔板中ST單層細(xì)胞上，待80%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收獲病毒液，反復(fù)凍融3次。提取病毒總RNA，用HiScript?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，用GP5特異引物GP5-HP-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.8 rPRV-GP5/HP感染ST細(xì)胞表達(dá)GP5的間接免疫熒光試驗(yàn)

當(dāng)12孔板內(nèi)ST細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，接種純化的重組病毒rPRV-GP5/HP。待細(xì)胞出現(xiàn)CPE且呈現(xiàn)單一病變?cè)顣r(shí)，用4%多聚甲醛固定15 min、0.5% TritonX-100室溫下通透20 min。1%BSA室溫封閉1 h后，加入1∶200稀釋的抗PRRSV GP5兔血清，4 ℃孵育過夜。加入1∶5 000稀釋的FITC-山羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育1 h。加DAPI染液，進(jìn)行5 min核復(fù)染。用抗熒光衰減封片劑進(jìn)行封片處理后，在熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP的鑒定

HP-PRRSV HeN-HC毒株GP5基因經(jīng)BamHⅠ插入到質(zhì)粒pG中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP，導(dǎo)入大腸桿菌，挑選單個(gè)菌落，用引物pG-F和GP5-HP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在約650 bp處有1條特異性條帶，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示，所測(cè)序列為639 bp，包含GP5基因(603 bp)，與預(yù)期序列長(zhǎng)度完全一致，且正向插入GP5基因(圖2)，與參考毒株HuN4的GP5基因序列比較，同源性為99.3%，表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP。

加粗部分為引物pG-F；下劃線為引物GP5-HP-F/R。

2.2 重組病毒rPRV-GP5/HP-EGFP的拯救和蝕斑純化

轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞24 h后，細(xì)胞對(duì)照組和空白轉(zhuǎn)染組在熒光顯微鏡下ST細(xì)胞無綠色熒光，而質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP轉(zhuǎn)染孔中ST細(xì)胞出現(xiàn)CPE且呈現(xiàn)明顯的綠色熒光。經(jīng)8輪蝕斑純化時(shí)，所有ST細(xì)胞出現(xiàn)CPE且均有綠色熒光(圖3)。提取病毒DNA，用引物GP5-HP-F/R進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，在約650 bp處呈現(xiàn)1條特異性條帶(圖4)，與預(yù)期結(jié)果相符。

A.純化的重組病毒rPRV-GP5/HP-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞；B. 細(xì)胞對(duì)照。

M. DNA Marker；1～3. GP5基因；4. 陰性對(duì)照。

2.3 重組病毒rPRV-GP5/HP的拯救和蝕斑純化

為了獲得不含EGFP的重組病毒rPRV-GP5/HP，將CRISPR/Cas9-EGFP敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至ST細(xì)胞，孵育一定時(shí)間再接種病毒rPRV-GP5/HP-EGFP，收獲病毒液進(jìn)行病毒蝕斑純化。結(jié)果顯示，經(jīng)4輪蝕斑純化后所有病毒蝕斑均無綠色熒光(圖5)。

圖5 重組病毒rPRV-GP5/HP 病變后的蝕斑(20×)

提取病毒DNA，利用GP5基因特異引物GP5-HP-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖6顯示：擴(kuò)增出約630 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符；利用引物EGFP-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出1條約400 bp的片段。測(cè)序結(jié)果顯示，所測(cè)序列長(zhǎng)度為436 bp，獲得的rPRV-GP5/HP在EGFP基因上缺失了1 232 bp片段，表明重組病毒rPRV-GP5/HP中EGFP基因被成功敲除，且經(jīng)空斑純化完全。

M. DNA Marker；1～4. GP5基因PCR產(chǎn)物；5～8. EGFP基因PCR產(chǎn)物；9～10. 陰性對(duì)照。

2.4 重組病毒rPRV-GP5/HP的 GP5基因轉(zhuǎn)錄檢測(cè)與表達(dá)

提取重組病毒rPRV-GP5/HP感染的ST細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用GP5特異引物GP5-HP-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增GP5基因。結(jié)果顯示，在約650 bp處有1條特異性條帶(圖7)，與預(yù)期大小相符，且測(cè)序結(jié)果正確。

M. DNA Marker；1. GP5基因PCR產(chǎn)物；2. 陰性對(duì)照。

間接免疫熒光結(jié)果顯示，試驗(yàn)組可觀察到明顯熒光，而對(duì)照孔沒有綠色熒光(圖8)，表明外源基因成功表達(dá)，進(jìn)一步證明成功構(gòu)建重組病毒rPRV-GP5/HP。

A. rPRV-GP5/HP；B. rPRV-GP5/HP-DAPI；C.陰性對(duì)照；D. 陰性對(duì)照-DAPI；標(biāo)尺=100 μm。

3 討論

20世紀(jì)80年代末，美國最早發(fā)生PRRS，后傳入歐洲，迅速擴(kuò)散到全球的大多數(shù)國家和地區(qū)[1-2]。迄今，PRRS的防控仍然是困擾世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)的一大難題。疫苗免疫仍是我國防制PRRS的主要手段。目前，由于無法區(qū)分PRRSV MLV疫苗免疫與野毒株感染，難于根除PRRS，且PRRSV基因易發(fā)生變異、重組，在臨床上MLV疫苗株與野毒株易發(fā)生基因重組，導(dǎo)致出現(xiàn)PRRSV新亞型。當(dāng)前我國豬群中流行經(jīng)典PRRSV、HP-PRRSV、歐洲型PRRSV、類QYYZ PRRSV、NADC30-like-PRRSV和NADC34-like-PRRSV，呈現(xiàn)多亞型并存的局面[12]，不同亞型之間GP5基因同源性從99.8%到83.4%，這可能是現(xiàn)有疫苗不能產(chǎn)生交叉保護(hù)的原因之一[13]，給PRRS的防控帶來了更大的挑戰(zhàn)。

豬偽狂犬病是危害養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一，主要表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)、死胎，仔豬神經(jīng)癥狀、腹瀉等[14]。近年來，CRIPSR/Cas9基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)加速了新型疫苗的研發(fā)[15-16]。通過缺失PRV的gE、TK等毒力基因，獲得的PRV重組株既安全又能夠誘導(dǎo)高水平的中和抗體[17]，同時(shí)由于PRV的高表達(dá)能力，PRV弱毒株作為活病毒載體，已廣泛用于表達(dá)外源基因，從而開發(fā)預(yù)防豬偽狂犬病和其他重要病的多價(jià)疫苗[18]。本試驗(yàn)所使用的PRV變異株三基因缺失毒株rPRV-gE-/gI-/TK[19]，是由本實(shí)驗(yàn)室對(duì)PRV變異株NY的 gE、gI、TK三基因進(jìn)行缺失而構(gòu)建的。試驗(yàn)表明，rPRV-gE-/gI-/TK對(duì)小鼠是安全的，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗PRV中和抗體，并能抵抗PRV NY毒株的攻擊，因此PRV變異株三基因缺失毒株rPRV-gE-/gI-/TK可作為表達(dá)外源基因的活載體。

PRRSV和PRV的混合感染在我國豬場(chǎng)已經(jīng)存在，且均能引起豬發(fā)生繁殖障礙，因此研發(fā)一種更加安全有效的疫苗是豬繁殖與呼吸綜合征和豬偽狂犬病免疫預(yù)防研究的重點(diǎn)。研發(fā)“一針多防”疫苗有很好的優(yōu)勢(shì)，減少在免疫過程中其它病原感染的可能性。PRV基因組有許多復(fù)制非必需基因，許多研究以PRV毒力基因缺失株作為載體研發(fā)多聯(lián)苗，能觸發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。PRRSV GP5蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是研制PRRS新型疫苗的首選靶點(diǎn)[20]。本研究選用HP-PRRSV GP5基因作為外源基因插入到rPRV-gE-/gI-/TK-三缺失株中，成功構(gòu)建重組rPRV-GP5/HP，為高致病性PRRS的防控提供了新的解決方法。

綜上，本研究利用DNA同源重組和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，將HP-PRRSV GP5基因插入到三基因缺失PRV變異毒株中，構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)HP-PRRSV GP5基因的重組病毒rPRV-GP5/HP，為針對(duì)HP-PRRSV毒株和PRV變異毒株的疫苗研發(fā)提供了技術(shù)支持。