羊痘病毒80、81 基因真核表達載體構建及鑒定

葛志毅，趙 微，程思危，周園霞，馬欣欣，李有文

（ 1. 塔里木大學動物與科學技術學院，新疆 阿拉爾 843300 ；2. 新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300 ）

羊痘作為動物痘病毒病中一種嚴重的疾病，常會引起牛、羊的皮膚丘疹和炎癥，對母羊和羔羊具有很高的致死率[1-3]。羊痘流行范圍廣，在中國、瑞典、印度等國家均有相關報道[4]。隨著分子技術的不斷發展，有關羊痘的研究不再局限于其癥狀、診斷，也進入了基因水平[5]。基因組研究表明，羊痘病毒基因組全長約150 kb，共編碼147個開放閱讀框（ORF），分中間區域和兩端區域，兩端區域（ORF001～ORF023和ORF124～ORF156）與致病性、選擇宿主范圍等有關[6]。兩端區域基因研究內容較多，如ANK基因[7]、KLPL基因等[8]。而中間區域（ORF024～123）是核心部分，編碼與病毒復制、轉錄、蛋白合成、加工等生物繁殖相關的重要蛋白[9]。80、81基因隸屬核心部分，其編碼基因與病毒的復制、蛋白合成相關。Tulman等[10]在對羊痘病毒基因組全序列進行分析研究時也只是注明80、81基因屬于病毒粒子蛋白，而無其他信息，后續也未見其他研究。本試驗在前人基礎上探究80、81基因的生物學特性，研究其部分蛋白功能，以期為羊痘病毒的基礎研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

pCDNA3.1 質粒、Vero 細胞、大腸桿菌DH5α 細胞，均由塔里木畜牧科技兵團重點實驗室保存。

瓊脂糖水平電泳儀（北京市六一公司）、隔水式恒溫培養箱（上海市一恒科研儀器設備股份有限公司）、XMTP-204水浴鍋（上海博訊實業有限公司）、Tanon3500凝膠成像分析系統（河南博奧誠恒科貿有限公司）、T100 PCR 儀（Thermo 科技有限公司）、高速離心機小型臺式（eppendorf公司）、SWCJ-2FD超凈工作臺（BXOXUN公司）。

DNA Marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小提取試劑盒等購自北京天根生物工程技術有限公司；PrimeSTAR聚合酶、Q.Cut EcoR I 和Q.Cut Hind Ⅲ限制性內切酶、solutionⅠ均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學分析

分別使用在線網站SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl? Page=npsasopm. html）和swiss model（https://swissmodel.expasy.org/interactive/）對羊痘病毒80、81基因表達蛋白二級和三級結構進行預測；在線軟件Interpro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）對羊痘病毒80、81基因表達蛋白功能位點進行研究。

1.2.2 引物的設計與合成

根據GenBank 中檢索的基因組序列（GenBank 登錄號為AF124517）中80、81 基因的序列，使用Primer5.0 軟件設計2對擴增引物，預計擴增產物大小為1 908和492 bp。上游引物添加EcoR Ⅰ酶切位點,下游引物添加Hind Ⅲ酶切位點，送至上海生物工程有限公司合成。引物序列見表1，虛線下標為保護性堿基，實線下標為酶切位點。

表1 引物序列信息Tab.1 A primer sequence's details

1.2.3 羊痘病毒80、81基因組的DNA提取

根據實驗室中已存的羊痘病毒疫苗株，按照病毒基因組試劑盒說明書提取病毒基因組，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 羊痘病毒80、81基因的擴增與回收

以提取的基因組為模板擴增羊痘80和81目的基因。

擴增反應體系：Prime STAR Max 25 μL、80/81-F 2 μL、80/81-R 2 μL、羊痘病毒基因組2 μL、RNase-free water 19 μL。擴增程序：95 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，循環35 次；72 ℃ 10 min。PCR 擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒對PCR擴增產物進行回收，按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 羊痘病毒80、81基因真核表達載體的構建

將經回收的80、81基因和pCDNA3.1質粒分別使用內切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ進行快速雙酶切。酶切體系：膠回收80、81基因/pCDNA3.1質粒30 μL、Q.Cut EcoR Ⅰ 6 μL、Q.Cut Hind Ⅲ 6 μL、10×Q.Cut G.buffer 5 μL、RNase-free water 3 μL。酶切產物取10 μL瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，鑒定正確的酶切產物進行膠回收。

將酶切成功的80、81目的基因與pCDNA3.1空載體酶切產物于16 ℃，利用T4 連接酶過夜連接。連接體系為：solutionⅠ 9 μL、pCDNA3.1 2 μL及膠回收羊痘病毒80、81基因7 μL。連接后的重組質粒命名為pCDNA3.1-80、pCDNA3.1-81，將重組質粒按照轉化說明書操作，轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞中進行克隆增殖。

1.2.6 羊痘病毒80、81基因真核表達載體的鑒定

轉化增殖的連接產物挑取單克隆過夜培養后進行菌液PCR鑒定，鑒定結果為陽性的菌液產物提取重組質粒進一步進行雙酶切鑒定，鑒定結果為兩條酶切條帶的產物送往上海生物工程有限公司進行驗證。

1.2.7 Vero細胞培養與轉染

37 ℃水浴復蘇并培養Vero細胞，傳代2～3次待細胞穩定，轉染前1 d 傳代，轉染當天細胞需要達到70%～90%覆蓋。使用HBS 稀釋重組質粒pCDNA3.1-80、pCDNA3.1-81（使用無內毒素的試劑盒提取質粒），HBS稀釋Lip2000，兩液混合后加入Lip2000，37 ℃孵育6 h，更換培養基，加入新鮮生長培養基繼續培養。

1.2.8 CCK-8測定轉染后蛋白毒力

在轉染12、24、36 h 后，分別取細胞懸液使用CCK-8試劑盒進行表達蛋白毒性檢測。96 孔板接種細胞懸液100 μL，每孔加入CCK-8 10 μL，將細胞懸液置于培養箱中培養1～2 h，之后使用酶標儀檢測OD450nm吸光度。

對匯總的吸光度采用SPSS Statistics 20.0 軟件進行單因素方差分析。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

1.2.9 羊痘病毒80、81基因轉染效果鑒定

重組質粒轉染Vero細胞48 h后，棄去細胞懸液進行破碎，按照細胞基因組試劑盒提取細胞基因組，PCR 特異性擴增羊痘病毒80、81基因，證明檢測的Vero細胞中羊痘基因80、81基因轉染成功，其蛋白在細胞中表達。擴增程序同1.2.4、1.2.5，使用核酸電泳進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 羊痘病毒80、81基因生物信息學分析（見圖1～圖3）

圖1 羊痘病毒80、81蛋白二級結構Fig.1 Protein secondary structure of capripoxvirus protein 80 and 81

由圖1 可知，80 基因表達蛋白含有α-螺旋205 個，占32.28%；延伸鏈178個，占28.03%；β-轉角60個，占9.45%；無規則卷曲192 個，占30.24%。81 基因表達蛋白含有α-螺旋30 個，占18.40%；延伸鏈65 個，占39.88%；β-轉角26個，占15.95%；無規則卷曲42個，占25.77%。

由圖2可知，80基因蛋白總長約為635個氨基酸，其分子量大小為73.43 kDa，等電點（PI）為6.88；在溶液中的不穩定指數為35（閾值40），推測蛋白性質穩定；親水性平均系數為-0.083，表現出親水性；預測80 蛋白主要以α 螺旋為主。81基因蛋白總長約為492個氨基酸，其分子量大小為40.59 kDa，PI 為5.32；在溶液中的不穩定指數為32.78，推測蛋白性質穩定；親水性平均系數為0.674，表現出疏水性；預測81蛋白主要以無規則卷曲為主。

圖2 羊痘病毒80、81蛋白三級結構Fig.2 Tertiary structure of sheep pox virus proteins 80 and 81

由圖3可知，羊痘病毒80蛋白有2個解旋酶ATP結合位點，1 個解旋酶位點；羊痘病毒81 蛋白有1 個RNA 酶聚合位點，涉及病毒轉錄過程。

圖3 羊痘病毒80、81蛋白功能位點Fig.3 Functional sites of proteins 80 and 81 of sheep pox virus

2.2 羊痘病毒80、81基因的擴增結果（見圖4）

圖4 羊痘病毒80、81基因PCR擴增結果Fig.4 PCR amplification results of sheep pox virus genes 80 and 81

由圖4 可知，經PCR 擴增和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，成功擴增出1 908、492 bp的羊痘病毒80基因、81基因。

2.3 羊痘病毒80、81基因真核表達載體構建（見圖5、圖6）

圖5 羊痘病毒80、81基因酶切結果Fig.5 Enzyme digestion results of sheep pox virus genes 80 and 81

圖6 pCDNA3.1質粒酶切結果Fig.6 pCDNA3.1 plasmid digestion results

對擴增的80 基因和81 基因及真核質粒pCDNA3.1 進行雙酶切，之后進行核酸電泳鑒定。由圖5可知，80、81基因由于本身是線性片段，酶切后未見其他變化。

由圖6 可知，環狀三條帶質粒酶切后成線形單條帶質粒，表明質粒酶切成功。

2.4 羊痘病毒80、81基因真核表達載體鑒定（見圖7、圖8）

圖7 PCR擴增結果Fig.7 PCR amplification results

圖8 雙酶切鑒定結果Fig.8 Double enzyme digestion identification results

由圖7可知，連接產物經轉化菌液增殖后進行PCR擴增，核酸電泳結果顯示均能夠擴增出羊痘病毒80、81基因，表明初步構建載體成功。

由圖8 可知，羊痘病毒80、81 重組質粒均可酶切出一條質粒、一條目的基因條帶，表明重組質粒構建成功。進一步將重組質粒送往上海生物工程有限公司進行序列測定，其測序結果也表明重組質粒構建成功。

2.5 羊痘病毒80、81基因轉染后蛋白毒力（見圖9）

由圖9 可知，3 個時間段中，羊痘病毒80、81 基因轉染Vero 細胞之后蛋白的細胞活力與對照組（pCDNA3.1 質粒）相比差異均不顯著（P＞0.05），表明細胞中羊痘病毒80、81蛋白均未表現出相關毒性因子。

2.6 羊痘病毒80、81基因轉染效果鑒定

轉染表達蛋白的Vero細胞破碎后提取基因組PCR擴增羊痘病毒80、81 基因，核酸電泳結果顯示均可擴增出80、81基因，表明轉染成功，結果見圖10。

圖10 細胞基因組PCR擴增結果Fig.10 PCR amplification results of cell genome

3 討論

目前羊痘病毒預防以注射疫苗為主，疫苗主要為常規的滅活疫苗、弱毒疫苗，現階段對基因工程疫苗和活載體疫苗也進行了探索。滅活疫苗由于效果差而不再使用[6]，因此弱毒苗成為常用疫苗。與滅活苗相比，弱毒苗免疫效果明顯，免疫力持久，免疫劑量低，但接種后動物后副反應較大，接種部位可能出現痘疹[11-12]。在新型基因工程疫苗方面，Carn等[13]對P32蛋白進行了探索，但由于P32蛋白表達量不高且不穩定等問題，P32 蛋白開發成亞單位疫苗受到了嚴重制約，因此羊痘病毒疫苗研發仍是需要加以探索的領域。本試驗通過分析預測羊痘80、81基因蛋白特性，構建真核表達載體，探究羊痘病毒的80、81核心基因功能，以期為羊痘病毒疫苗的研發提供一定參考。

相比原核表達載體，本研究考慮到羊痘病毒的特性選用真核表達載體進行構建。構建后的羊痘病毒真核表達載體也表明濃度高，質粒與空載體連接容易等優勢，與其他研究結論一致[14]。后續進行細胞表達，模擬病毒在細胞中感染過程更接近真實情況。由于真核載體pCDNA3.1質粒中間未插入綠色熒光標簽，所以對80、81重組質粒轉染效果驗證無法使用熒光顯微鏡進行觀察，只能選擇轉染48 h之后提取基因組進行PCR驗證。雖然PCR驗證成功，但相比熒光顯微鏡直接觀察仍存在一定不足。80、81基因轉染Vero細胞后，運用CCK-8試劑盒檢測12～36 h表達蛋白的相關毒力因子[15]。單因素分析結果表明其與單質粒載體轉染差異不顯著，初步說明其表達蛋白在細胞中無毒力特性。但結合NCBI數據庫中的基因預測，80、81基因均為病毒粒子蛋白，所以對其功能還需進一步研究驗證。

4 結論

本研究初步構建了羊痘病毒80、81 基因真核表達載體，并驗證了其在細胞中表達的蛋白不具備毒性，研究結果為后續羊痘病毒核心基因的研究提供了參考，也為羊痘病毒疫苗的研究提供更多依據。