赤斑羚皮膚成纖維細胞的分離和培養

劉群秀，袁耀華，梁小虎，劉玉良，安俊輝，王東輝，黃茗鑫，蔡志剛*

（ 1. 上海城建職業學院，上海 201415 ； 2. 上海動物園，上海 200335 ； 3. 成都大熊貓繁育研究基地，四川 成都 610081 ）

赤斑羚（Naemorhedus baileyi）是一類小型哺乳動物，別名紅山羊、紅巖羊等，屬于哺乳綱偶蹄目牛科羊亞科斑羚屬（Naemorhedus），為典型的林棲獸類，善攀爬，多集群生活在海拔較高的林緣山地，主要以植物的嫩芽、綠葉為食[1-2]。赤斑羚的分布區域較小，僅棲息于某些亞洲國家，在我國僅分布于西藏東南部和云南西北部。由于棲息地喪失，其種群數量正在急劇減少[3-4]。1996 年，赤斑羚被IUCN列為易危（VU）物種，并于同年被中國瀕危動物紅皮書評定為稀有動物[5]。目前上海動物園擁有全國唯一的赤斑羚人工圈養種群。雖然國內外對于赤斑羚這一珍稀物種的研究在不斷進行中，但目前對其生態學、遺傳學、生理學及組織學等方面的研究仍十分匱乏。因此，在現有飼養管理模式的基礎上，非常有必要應用分子生物學的方法和手段推進對該物種的保護。

體細胞系的建立和低溫保存是研究瀕危物種的特性和保存有價值資源的基礎和重要方法[6]。皮膚成纖維細胞是皮膚主要的構成成分，對皮膚損傷的修復和再生[7-8]、對抗皮膚衰老具有重要作用[9]。目前有關赤斑羚的各方面研究較少，現有的赤斑羚報道大多是上海動物園提供的在人工圈養條件下的研究發現。赤斑羚是一種具有較大應用價值的瀕危動物，有必要建立有效的赤斑羚皮膚成纖維細胞分離培養的方法和體系。基于此，在參考現有的多種實驗動物皮膚成纖維細胞獲取和培養方法基礎上，本研究對赤斑羚原代皮膚細胞進行分離、培養，選出最適赤斑羚皮膚成纖維細胞獲取方式，優化培養條件，測定并記錄該細胞的生長特性，最終獲得可穩定增殖的赤斑羚原代皮膚成纖維細胞，以此為培養赤斑羚皮膚成纖維細胞為基礎的科研工作的進一步開展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

樣本選自上海動物園繁育的赤斑羚，7歲齡，體重18～20 kg，譜系號：SHZ13-2，身體狀態健康。

1.1.2 試劑與儀器

DMEM高糖培養基、磷酸緩沖液（PBS）、膠原酶Ⅰ型、胎牛血清（FBS）、二甲基亞砜、青霉素、鏈霉素溶液、臺盼藍染液均購自美國Gibco公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 赤斑羚原代皮膚分離

在實驗室內取赤斑羚后腿內側皮膚，剃毛后，皮膚表面采用20%碘酒和75%乙醇消毒處理，局部麻醉，隨后取2 cm×2 cm 大小的全層皮膚，放入含250 U/mL 青霉素和250 mg/L 鏈霉素的無菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中浸泡。在超凈工作臺中輕輕刮去表皮細胞和皮下組織，保留真皮層，用眼科剪剪碎至1 cm×1 cm 的小塊。用吸管轉移至50 mL 離心管內，注入無菌雙抗PBS 溶液，重復洗滌3 遍，并棄去洗滌液，將離心管置于冰上保存。

1.2.2 赤斑羚原代皮膚細胞分離

用PBS分別配置0.1% Ⅰ型膠原酶溶液，100目濾膜過濾除菌，隨后裝入50 mL 離心管，將剪碎的皮膚組織轉移至離心管中，37 ℃水浴消化40 min，消化中每10 min 振蕩一次。分別采用40 目和100 目的濾膜過濾消化完成的細胞懸濁液，1 200 r/min離心5 min后棄去上清液，將離心管的細胞吹打均勻后移入使用完全培養基的培養瓶，在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養1～2 d，在此期間觀察細胞的貼壁生長情況并根據情況更換同類完全培養基。

1.2.3 赤斑羚成纖維細胞的胰酶消化純化

每隔2 d 在顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，待貼壁細胞長至90%時對細胞進行純化。棄去培養液后采用PBS 清洗3 次，加入0.25%胰酶，在37 ℃條件下水浴消化細胞。吸取完全培養基反復吹打細胞，直到變圓的成纖維細胞完全均勻混合于培養液中，將液體移至15 mL 離心管，1 200 r/min離心2 min，棄去上清。加入完全培養基重懸細胞，吹打均勻后按1∶2進行傳代培養。置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養。每間隔2 d 觀察一次細胞生長情況，根據細胞貼壁生長情況及時換液和傳代。

1.2.4 赤斑羚成纖維細胞凍存

細胞凍存：將生長良好的赤斑羚細胞先用PBS沖洗兩遍，再去除漂浮的細胞；用預熱濃度為0.25%的胰酶消化貼壁的細胞；其混合液于室溫離心，再加入700 μL的完全培養基，溶解均勻后轉移到細胞凍存管，并加入200 μL胎牛血清和100 μL二甲基亞砜，混勻。

程序性凍存盒凍存細胞：已加入凍存液的細胞放入程序性凍存盒并放進-80 ℃超低溫冰箱儲存24 h 后于液氮罐中存放。

1.2.5 赤斑羚成纖維細胞復蘇

水浴鍋預熱至37 ℃，從-80 ℃取出細胞凍存管，放置于水浴鍋2～3 min，使凍存液溶解；1 200 r/min 離心3 min，保留沉淀，加入完全培養基，重懸后接種于細胞培養瓶，再加入3 mL 完全培養基，在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。第2 d換液時觀察并記錄細胞貼壁生長情況。

1.2.6 成纖維細胞生長特性檢測

將復蘇后的成纖維細胞接種于24 孔板（濃度為1×104個/mL），每孔加入1 mL 細胞懸浮液并進行細胞計數，在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養，每隔1 d 進行一次細胞計數，每次計數3個孔，連續9 d計數。將所得數據繪制赤斑羚成纖維細胞生長曲線圖（以培養時間為橫坐標，細胞濃度為縱坐標）。

1.3 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 9.0 軟件中雙尾檢驗進行分析。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 原代培養赤斑羚成纖維細胞形態觀察（見圖1）

圖1 原代培養赤斑羚成纖維細胞形態觀察Fig.1 Primary culture of Naemorhedus baileyi fibroblasts

用膠原酶消化法解離的細胞在貼壁1 d 后，細胞向外伸展出現生長暈，主要成分為成纖維細胞和上皮細胞。由圖1可知，培養4 d后成纖維細胞成為優勢生長細胞。10 d時細胞密度達到80%以上，此時進行第一次傳代，得到傳代細胞。傳代細胞快速貼壁生長，12～14 d 后細胞密度可達90%，表明細胞生長狀態良好。倒置顯微鏡下觀察成纖維細胞大多呈現細長梭狀，胞體中央可見扁圓的細胞核，并伴有少量鋪路石狀的上皮細胞。

之后對含有上皮細胞的成纖維細胞使用差速貼壁法進行純化，并對原代成纖維細胞經首次傳代成功后所繁殖的細胞群體用于細胞系的構建。

2.2 赤斑羚成纖維細胞的凍存前及復蘇后的活率（見表1、圖2）

表1 赤斑羚成纖維細胞凍存前及復蘇后細胞數Tab.1 Number before and after cryopreservation of Naemorhedus baileyi fibroblast cells

圖2 凍存前后赤斑羚成纖維細胞活率的比較Fig.2 Comparison of fibroblast viability of Naemorhedus baileyi before and after cryopreservation

由表1 可知，第6 代赤斑羚成纖維細胞凍存前活率和復蘇后細胞活率均在80%以上，適用于之后的研究。

由圖2可知，凍存前后細胞活率差異不顯著（P＞0.05），表明凍存和復蘇條件均適用于該細胞，細胞活力可完全滿足細胞復蘇及后續試驗的要求。

2.3 赤斑羚成纖維細胞生長曲線（見圖3）

圖3 赤斑羚成纖維細胞生長曲線Fig.3 Growth curve of fibroblasts from Naemorhedus baileyi

由圖3 可知，赤斑羚成纖維細胞生長曲線呈典型的“S”型，細胞的生長均經歷了增長期、對數期和平臺期，符合細胞在體外的生長規律。剛接到24孔板時，細胞生長速度緩慢且基數較少；從第4 d 開始，細胞生長速度顯著加快，呈對數增長；第8 d 由于空間有限出現接觸性抑制生長，且細胞數量較大，可能養分較少，出現細胞減少的現象。

3 討論

已知赤斑羚分布范圍包括印度的東南部、西藏自治區、云南省西北部、緬甸北部等區域[10-11]。由于赤斑羚分布廣且分布區域的樣本數稀少，目前關于其系統發育和分類地位尚不明確。Xiong等[12]對赤斑羚、長尾斑羚、喜馬拉雅斑羚和中國斑羚進行了測序，并與GenBank中的中華斑羚（Naemorhedus caudatus：No. AY356357、FJ469673、U17861）、Nemorhaedus caudatus raddeanus（No.EU259099-EU259107、EU259195-EU259198）、斑羚（Naemorhedus goral：No.EU259118）、灰斑羚（Naemorhedus griseus：No.FJ207532、JN632664）、赤斑羚（Naemorhedus baileyi：No.JN632663、JX506309、JX506311、JX506310）序列進行了比較，發現赤斑羚是獨立于它們的物種。但由于種群分布地和種群大小的關系，并沒有太多的樣本數據用于支撐分子進化的討論，因此不能很好地解釋赤斑羚的分類問題，今后關于斑羚屬分類問題仍需要進一步研究[13]。

膠原酶消化法[14]以及組織培養法[15]是細胞分離的經典方法。由于組織培養法極易發生污染，一般多選用膠原酶消化法[16]。由于膠原酶解離細胞會損傷細胞，因此溫度、酶濃度、處理時間尤為關鍵。在37 ℃時，酶濃度過高或消化時間過長，容易導致細胞破損死亡，造成剩余未損傷細胞不易貼壁生長，反之酶濃度過低或消化時間過短，則消化不完全，獲得細胞量不多。本試驗中，由于赤斑羚皮膚組織樣本的珍貴性，在膠原酶消化過程中采取消化赤斑羚皮膚成纖維細胞的消化時間，結果得出膠原酶消化45 min是適用于赤斑羚皮膚成纖維細胞的消化時間[17-18]。

體細胞的建立和保存不僅是保存重要物種種質資源的必要條件，而且為基因組和體細胞發育研究提供了有價值的數據。自1996年以來，赤斑羚已成為我國瀕危野生動物，因此建立赤斑羚皮膚成纖維細胞系很有必要。隨著體細胞核移植技術（SCNT）的不斷革新與成熟，該技術已被廣泛用于拯救瀕危物種[19-20]。SCNT通常以去核卵母細胞為受體，供體采用單細胞核，是一種將體細胞核轉入成熟的去核卵母細胞中，從而激活新的克隆胚胎，進而培育出基因型與供體體細胞一致的克隆動物的方法。但體細胞核移植的效率和成功率仍然很低，其中一個重要的環節就是挑選核移植供體，而成纖維細胞質量好，有利于重構胚胎的發育，是最常用的供體細胞[21-22]。有研究以小熊貓皮膚成纖維細胞為供體，兔卵泡為受體成功獲得了可發育的小熊貓-兔種間胚胎，進而充分肯定了皮膚成纖維細胞在珍稀動物種資源保護中所占的重要地位[23-24]。本試驗成功培養了赤斑羚成纖維細胞，使赤斑羚基因組DNA 材料得以保存，為后續試驗開展以及資源保護奠定了基礎。

4 結論

本研究采用膠原酶消化法對赤斑羚的后腿內側皮膚組織進行原代培養，擇優培養出原代成纖維細胞，并通過傳代使細胞進一步純化。通過生物學特性檢驗確定了本試驗所得的成纖維細胞有貼壁增長快、形態穩定等特點，可見本研究成功建立了培育赤斑羚成纖維細胞系的方法，也為赤斑羚的相關研究、瀕危物種資源的保護以及赤斑羚體內皮膚治療提供了理想的生物學材料和依據。