通過式固相萃取柱/超高效液相色譜-串聯質譜法快速檢測飼料中8 種糖皮質激素

趙天珍，宋長江，何國成，丘金珠，梁 瑩，宋海霞

（ 中山市農產品質量安全檢驗所，廣東 中山 528400 ）

糖皮質激素可分為內源性及人工合成的糖皮質激素。由于具有解熱、抗炎和抗過敏的作用，合成類糖皮質激素被添加在動物飼料中[1-2]。動物生長過程中過量使用這些激素會導致其在動物源性食品中殘留，進而影響人類健康[3]，故已被各國禁止在飼料中添加。糖皮質激素藥物的殘留檢測方法有免疫分析法[4]、毛細管電泳法[5]、液相色譜法[6]、液相色譜-串聯質譜法[7]、液相色譜-飛行時間質譜法[8]等。其中，液相色譜法等常用于快速篩查，無法準確定性；液相色譜-飛行時間質譜法設備昂貴，使用成本高；液相色譜-串聯質譜法具有選擇性好靈敏度高等優點，應用廣泛。通過式固相萃取小柱（PRiME HLB）是近年來通過式固相萃取柱[9-10]建立的樣品前處理新技術，具有操作簡單、無活化和平衡、凈化效率高等優點，廣泛應用于獸藥殘留檢測。高潔等[9]建立了PRiME HLB 同時檢測豬肉中52種同化激素。檢測飼料中糖皮質激素[11]的報道并不多見，應用PRiME HLB檢測飼料中糖皮質激素未見報道。

本研究以配合、濃縮和添加劑預混合飼料為目標，選擇動物源性食品中有檢測要求的8種糖皮質激素（潑尼松、潑尼松龍、氫化可的松、甲基潑尼松、倍他米松、倍氯米松、地塞米松、醋酸氟氫可的松）為研究對象，利用PRiME HLB凈化、UPLC-MS/MS測定，基質工作曲線和同位素內標法定量，為飼料中糖皮質激素類藥物的風險篩查和監測工作提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

標準品：潑尼松、潑尼松龍、氫化可的松、甲基潑尼松、倍他米松、倍氯米松、地塞米松、醋酸氟氫可的松、氟氫可的松-D5、潑尼松-D4、氫化可的松-D3純度均大于98.5%，購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司；乙酸乙酯、甲醇、乙腈均為色譜純，購自默克公司；甲酸，色譜純購自CNW 公司；Oasis PRiME HLB（3 mL/60 mg）、Oasis PRiME HLB（6 mL/200 mg）購自Waters 公司；氯化鈉購自廣州化學試劑公司；0.22 μm有機濾膜購自津騰公司；陶瓷均質子購自Agilent公司；配合飼料、濃縮飼料、添加劑預混合飼料來自中山市農檢所樣品室。

1.1.2 主要儀器設備

1290+6495A 液相色譜-串聯質譜儀（配電噴霧離子源，安捷倫公司）；MSA125P-CE 十萬分之一天平、Quintix1102-1CN 百分之一電子天平（賽多利斯公司）；3-30ks高速離心機（SIGMA公司）；FV64氮吹儀（德泰公司）；KQ-500TDE 型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Vortex2 振蕩器（IKA 公司）；200 μL、1 000 μL、10 mL移液器（eppendorf公司）。

1.2 標準溶液和內標配制

1.2.1 8種糖皮質激素混合標準使用溶液

取潑尼松、潑尼松龍、氫化可的松、甲基潑尼松、倍他米松、倍氯米松、地塞米松、醋酸氟氫可的松標準物質，用十萬分之一天平準確稱量，純度換算后用乙腈溶解配制成1 000 mg/L標準溶液，-18 ℃冰箱保存。

使用時用乙腈液逐級稀釋用乙腈配制成100 μg/L 混合標準使用液，現配現用。

1.2.2 同位素內標使用液配制

取氟氫可的松-D5、潑尼松-D4、氫化可的松-D3標準物質，用十萬分之一天平準確稱量，純度換算后用乙腈溶解配制成1 000 mg/L 標準溶液，-18 ℃冰箱保存。使用時用乙腈逐級稀釋配制成1.00 mg/L 同位素內標混合使用液，現配現用。

1.3 分離條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）。流動相：A 相為0.005 %甲酸水溶液，B 相為乙腈，流速0.4 mL/min，柱溫45 ℃，進樣量為5 μL，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Conditions of gradient elution

1.3.2 質譜條件

檢測方式為多反應監測MRM；電離方式為電噴霧離子源負模式；干燥氣溫度：200 ℃，干燥氣流量：14 L/min，干燥氣壓力：35 psi，鞘氣溫度：350 ℃，鞘氣流量：11 L/min，電壓：380 ℃。8 種糖皮質激素和3 種同位素內標的質譜條件見表2。

表2 8種糖皮質激素藥物和3種同位素內標的質譜參數Tab.2 Mass spectrometric parameters of eight glucocorticoids and three isotope internal standards

1.4 基質匹配工作曲線

準確稱取樣品1.00 g（精確至0.01 g），置于50 mL聚丙烯離心管中，取100 μg/L的8種糖皮質激素混合標準使用液（1.2.1）加標，分別加入20、50、100、200、400、500、600、1 000 μL，分別得到濃度2、5、10、20、40、50、60、100 μg/L工作曲線，再加入1.00 mg/L 同位素內標使用液（1.2.2）50 μL，其余前處理按照1.5中步驟進行。

以糖皮質激素濃度和同位素內標濃度比值為橫坐標（X），以各特征離子色譜峰峰面積與內標的峰面積比為縱坐標（Y），繪制基質工作曲線。

1.5 樣品處理

準確稱取樣品1.00 g（精確至0.01 g），加入1.00 mg/L內標（1.2.2）50 μL，加入8 mL 0.5%甲酸-60%乙腈水溶液，1 個陶瓷均質子，加入4 gNaCl，渦旋2 min，超聲提取20 min，10 000 r/min冷凍離心5 min，吸取上層全部有機相過3 mL/60 mg 的Oasis PRiME HLB 固相萃取柱，流速1 滴/s，擠干，氮氣吹至近干，40%甲醇水溶液復溶液定容1.00 mL，過0.22 μm微孔濾膜過濾后分析測定。

1.6 回收率

在配合飼料、濃縮飼料和添加劑預混合飼料中分別添加5、10、50 μg/kg的8種糖皮激素類藥物進行準確度試驗，每個濃度做6個平行樣，計算平均回收率。

2 結果與分析

2.1 前處理條件優化

2.1.1 提取溶劑的選擇

本試驗以羅非魚配合飼料、濃縮飼料和添加劑（微量元素）預混合飼料為基質，糖皮質激素常用的提取劑有乙腈[12]、甲醇[13]、乙酸乙酯[7]。祝曙華[14]檢測了飼料中5 種糖皮質激素，發現使用甲醇提取時，大量雜質溶出，而乙腈提取雜質很少。并且考慮到后續操作需加入鹽分層操作的簡便性，因此不能選擇甲醇溶劑。

本試驗考察了乙酸乙酯、乙腈、60%乙腈溶液、80%乙腈溶液、含0.5%甲酸-60%乙腈水溶液和含1.5%甲酸-60%乙腈水溶液這6種溶劑對試樣加標的平均回收率影響，結果見圖1。結果表明，0.5%甲酸-60%乙腈水溶液回收率較好。

圖1 提取溶劑對8種糖皮質激素平均回收率的影響Fig.1 Effect of different extraction reagents on recovery rate of eight glucocorticoids

2.1.2 提取體積的選擇

本試驗選擇了0.5%甲酸-60%乙腈水溶液作為提取溶劑，并對溶劑體積作了探討。選取4、8、12 mL 對8 種糖皮質激素提取回收率的影響，結果見圖2。

圖2 提取體積對8種糖皮質激素平均回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction volumes on recovery rate of eight glucocorticoids

由圖2可知，使用8 mL提取溶劑的回收率高于4 mL，而8 mL 和12 mL 回收率差異不明顯，考慮到環境友好原則，選擇8 mL作為提取體積。

2.1.3 液相條件的優化

本試驗考察了Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）、Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），由于地塞米松和倍他米松是同分異構體，用Agilent Poroshell 120 EC-C18分離效果更佳，故本試驗選擇Agilent Poroshell 120 EC-C18。

進一步優化流動相種類、梯度洗脫程序、流速、柱溫和進樣體積，8種糖皮質激素峰形均對稱尖銳，詳細液相和質譜條件見1.3.1 和1.3.2，飼料中添加8 種糖皮質激素的MRM總離子色譜圖見圖3。

圖3 空白飼料中添加8種糖皮質激素的MRM色譜Fig.3 MRM chromatograms of a blank feed spiked with eight glucocorticoids

2.2 方法的線性關系、相關系數、檢出限和定量限

按照1.5 前處理條件及1.3.1、1.3.2 色譜分離條件進行測定，以糖皮質激素濃度和同位素內標質量濃度比值為橫坐標（X），以各特征離子色譜峰峰面積與內標的峰面積比為縱坐標（Y），繪制工作曲線，并計算獲得待測物質的線性回歸方程及相關系數，并以3倍信噪比和10倍信噪比計算方法的檢出限和定量限，結果見表3～表5。

表3 8種糖皮激素類藥物在配合飼料的線性方程、檢出限和定量限Tab.3 Linear equation, detection limit and quantification limit of eight glucocorticoids in compound feed

表4 8種糖皮激素類藥物在濃縮飼料的線性方程、檢出限和定量限Tab.4 Linear equation, detection limit and quantification limit of eight glucocorticoids in formula feed

表5 8種糖皮激素類藥物在添加劑預混合飼料的線性方程、檢出限和定量限Tab.5 Linear equation, detection limit and quantification limit of eight glucocorticoids in additive premix feed

由表3～表5可知，在濃度為2～100 μg/L范圍內，8種糖皮質激素呈良好的線性關系，相關系數均大于0.998，飼料的檢出限為0.2～1.6 μg/kg，定量限為0.6～4.8 μg/kg，略高于農業部1063 號公告—5—2008[15]標準中檢出限2 μg/kg 和定量限5 μg/kg，遠優于農業部1068號公告—2—2008[16]標準中檢出限0.5、1.0 mg/kg，故滿足飼料中糖皮質激素風險篩查的技術要求。

2.3 回收率檢測結果

向配合飼料、濃縮飼料、添加劑預混合飼料中分別添加8 種糖皮質激素的混合標準溶液，添加濃度分別為5、10、50 μg/kg，按照1.5方法進行處理，3個添加水平下重復測定6次，平均回收率結果見表6。由表6可知，8種糖皮質激素的回收率為80.6%～96.2%。根據GB/T 27404—2008標準要求，當添加量＜0.1 mg/kg，標準規定回收率為60%～120%，本方法測定回收率遠遠優于規定要求，表明本研究建立的方法準確度滿足檢測工作需求。

表6 配合、濃縮、添加劑預混合飼料中8種糖皮質激素類藥物加標回收率結果（n=6）Tab.6 Spiked recovery of eight glucocorticoids informula feed, concentrated feed and additive premix feed（ n=6）

2.4 實際樣品檢測

為驗證本方法可靠性，應用本研究建立的方法對10種配合飼料、5 種濃縮飼料和2 種添加劑預混合飼料進行檢測，同時作質控樣品。樣品經前處理和上機測試后，對其中8種糖皮質激素進行定性篩查，可疑樣品結合特征離子比，樣品均未檢出糖皮質激素。加入的質控樣品加標回收率達到定量分析要求，表明方法和結果可信。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

本試驗考察了乙酸乙酯、乙腈、60%乙腈溶液、80%乙腈溶液、含0.5% 甲酸-60% 乙腈水溶液和含1.5% 甲酸-60%乙腈水溶液這6種溶劑對試樣加標的平均回收率影響。結果表明，乙酸乙酯和乙腈為提取溶劑，3種飼料的加標回收率較低，可能乙酸乙酯共提物較多，對目標提取物干擾嚴重；乙腈沉淀蛋白易結塊，導致提取目標物不充分；乙腈水溶液提取效率高于乙酸乙酯、乙腈，其中體積分數為60%乙腈溶液提取效率高于體積分數80%乙腈溶液，可能是水有助于提取水溶性物質；體積分數60%乙腈溶液中加入0.5%甲酸提取效率高于1.5%甲酸，可能是酸度過高影響了離子化效率，流動相中加入0.5%甲酸利于目標化合物的離子化，響應有所提高，重復性好，故選擇0.5%甲酸-60%乙腈水溶液，這與郭添榮[17]報道結論基本一致。

3.2 不同固相萃取柱對回收率的影響

飼料樣品蛋白脂肪含量較高，使用乙腈溶液提取后會含有脂溶性物質，因而為減少對儀器污染，選擇凈化效果較好的固相萃取柱。有文獻采用固相萃取柱[11]、分散固相萃取[18]、整體在線凈化[19]等方法，操作較煩瑣，耗時長，有機溶劑用量較大。有文獻采用通過PRiME HLB 凈化魚肉[20]、育發液[21]、化妝品[22]中糖皮質激素，但未見PRiME HLB 應用于飼料中糖皮質激素檢測前處理的報道。本研究采用PRiME HLB通過式固相萃取柱，無須活化和平衡，能夠有效吸附脂溶性雜質，凈化效率高，操作簡單，前處理時間短，重現性好。本試驗選取兩種型號的PRiME HLB（3 mL/60 mg和6 mL/200 mg），對回收率進行比較；結果顯示，3 mL/60 mg 平均提取回收率更好，故選擇3 mL/60 mg PRiME HLB固相萃取柱。

3.3 基質匹配工作曲線和同位素內標法同時定量

同位素內標法優點較多，如定量時可以有效避免樣品前處理提取過程對目標組分丟失造成定量不準確的影響，但無法避免基質效應的影響。基質效應是指在樣品檢測過程中，除目標組分以外的物質對目標組分的影響，有基質增強或減弱效應。王博等[23]研究測定了配合飼料中11種蛋白同化激素含量，發現基質對部分目標物具有抑制作用。消除基質效應常見方法有基質匹配工作曲線、內標法、改進凈化方法等。由于飼料基質復雜，飼料種類繁多，不同飼料基質差別較大，通過選擇基質工作曲線和同位素內標法同時定量，既可以消除或減弱基質效應的影響，還能夠避免樣品前處理中目標物的損失。因此，優化后的方法回收率可達80%以上，準確度高。

3.4 不足之處

飼料種類繁多，除了幾種常見飼料外，還有一些特殊類型的飼料，如寵物飼料、飼料添加劑和混合型飼料添加劑、植物源性和微生物發酵類等研究對象，本研究未涉及，未來需要進一步探究。此外，本研究只使用了3種同位素內標，部分化合物回收率略低，不到90%，原因可能為使用3 種內標結構與結構存在差異，未來研究中將尋找合適的同位素內標進行試驗。

4 結論

本試驗以配合飼料、濃縮飼料和添加劑預混合飼料作為研究對象，建立了8種糖皮質激素快速篩查糖皮質激素的分析方法，樣品經0.5%甲酸-60%乙腈水溶液提取后離心，上清液經Oasis PRiME HLB 固相萃取柱凈化后使用氮吹儀吹干，用40%甲醇溶液溶解上液相色譜串聯質譜儀測定，基質工作曲線和同位素內標法同時定量。8 種糖皮質激素添加回收率為80.6%～96.2%，檢出限為0.2～1.6 μg/kg，定量限為0.6～4.8 μg/kg。結果表明，該方法前處理操作簡單、快速，凈化效果好，基質效應不明顯，靈敏度高，準確性好，建立的分析方法適用于飼料中多種糖皮質激素檢測，可為風險監測和監督抽查提供技術支持。