8 種復方中藥液的生物活性及體外抗氧化能力研究

張紅艷，韓姍姍，冉淦僑，胡云紅，殷 紅，張 強*

（ 1. 陜西省生物農業研究所，陜西 西安 710043 ； 2. 陜西省酶工程技術研究中心，陜西 西安 710043 ）

畜禽養殖過程中，機體應激反應使畜禽的生產性能下降，進而影響經濟效益。良好的機體抗氧化水平對于動物抵御外界環境的劇烈變化具有積極影響[1]。目前，中草藥、生物發酵飼料、益生菌、酶制劑、酸化劑和植物提取物等綠色、健康、安全的飼料添加劑產品獲得高度關注。我國中草藥來源廣泛、價格低廉、毒副作用小，且富含皂苷、蛋白質、氨基酸、礦物質和維生素等多種營養物質以及多糖、黃酮類、生物堿、有機酸和揮發油等多種生物活性因子，能夠促進動物生長發育、提高生產性能[2-3]。黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌和抗病毒等作用，可提高動物的生產性能，抑制脂肪酶表達，改良畜產品品質，提升機體免疫能力，提高繁殖能力[4]。中藥植物次生代謝產物中多酚類化合物因具有良好的抗氧化和基因調控特性也成為最有前途的抗生素替代品之一[5]。我國《飼料原料目錄》中規定了可長期添加在飼料中使用的117種天然植物中藥，包括調節免疫的黃芪、金銀花、絞股藍、秦皮，抗菌抗病毒的杜仲、蒲公英、魚腥草、大蒜，抗機體應激的黃芪、甘草、白術、五味子以及健胃促生長的山楂、神曲、麥芽、肉桂等。許多傳統中獸藥經典方劑被實踐證明有效，藥物配伍合理，為中藥飼料添加劑的研究奠定了良好基礎[6]。中藥提取物是采用先進工藝技術對中藥材或中藥復方進行提取分離加工得到一種藥效相對明確的中藥產品。本文采用中藥提取物組配8種經典中獸藥組方，檢測復方中藥液的活性物質含量，對比不同組方中藥液的體外抗氧化能力，為開發畜禽強免疫無抗飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

27 種10∶1 比例提取物（黃連、薄荷、桔梗、黃芩、蒲公英、金銀花、黃檗、梔子、連翹、荊芥、半夏、甘草、當歸、杜仲、茯苓、懷牛膝、白頭翁、秦皮、野菊花、黃芪、黨參、魚腥草、板藍根、大蒜、五倍子、大青葉、杏仁），購自西安天葉植物原料技術有限公司。

DPPH醇溶液（15 mg/500 mL）、ABTS粉末（分析純）購自飛凈生物科技有限公司；蘆丁標準品（分析純，江西佰草源生物科技有限公司）、表兒茶素沒食子酸酯標準品（西安匯林生物科技有限公司）、鄰苯三酚（分析純，天津市華盛化學試劑有限公司）；其他常規試劑均為分析純。752紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）、JA12002電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）、KQ5200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、BCD-219K新飛電冰箱（河南新飛電器集團股份有限公司）。

1.2 復方中藥液的制備

中藥復方依據中獸藥古方、化裁已有成方，由若干種中藥提取物組配而成。8種中藥復方主要成分見表1。

表1 8種中藥復方的提取物成分Tab.1 Extracts of eight traditional Chinese medicine compounds

1.3 生物活性物質含量測定

1.3.1 總多酚含量

參考文獻[7]的方法稍做修改。用去離子水配制濃度為0.385 g/L 的表兒茶素沒食子酸酯的標準品溶液。取0.05、0.075、0.1、0.125、0.15 mL 的標準品溶液至10 mL 容量瓶中，分別加入1 mL福林酚溶液、2.0 mL 15% Na2CO3溶液以蒸餾水定容至10 mL，40 ℃避光反應40 min于760 nm處測定吸光度。以體系中標準品質量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸，得出標準曲線方程，總多酚以表兒茶素沒食子酸酯計。分別吸取0.02 mL的復方中藥液，加入1 mL福林酚溶液、2.0 mL 15% Na2CO3溶液以蒸餾水定容至10 mL，40 ℃避光反應40 min 于760 nm 處測定吸光度，重復3 次，取平均值。用標準曲線查得總多酚質量后，再計算樣品的總多酚含量。

1.3.2 總黃酮含量

參考文獻[8]的方法稍做修改。稱取6.0 mg 蘆丁標準對照品，用30%乙醇溶解制成0.392 g/L 測定液，分別吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 的標準測定液到10 mL容量瓶中，用30%乙醇稀釋定容。各吸取1 mL不同濃度的標準品稀釋液于測定試管，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液、1 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻后靜置8 min，加入2 mL 10 g/100 mL 氫氧化鈉溶液，加蒸餾水定容。在510 nm 處測定吸光度。以蘆丁質量濃度和吸光度繪制標準曲線，計算回歸方程。分別吸取1 mL的復方中藥液，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液、1 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻后靜置8 min，加入2 mL 的10 g/100 mL 氫氧化鈉溶液，加蒸餾水定容。在510 nm 處測定吸光度，重復3 次，取平均值。用標準曲線計算不同復方中藥液的總黃酮含量。

1.4 體外抗氧化能力測定

1.4.1 DPPH自由基清除能力

將各樣品稀釋成不同質量濃度（0.1、0.5、1.0、2.0 和3.3 mg/mL），取3 mL于刻度試管中，加入15 mg/500 mL的DPPH-乙醇溶液3 mL，混勻，在室溫下避光放置30 min，測定517 nm下的吸光度，以1 g/L的維生素C（VC）溶液作陽性對照。用3 mL 水+3 mL 無水乙醇混合調零。每個樣品測定3次，取平均值。DPPH自由基清除率公式如下：

式中：A0為水+DPPH-乙醇溶液的吸光度；Ai為樣品+DPPH-乙醇溶液的吸光度；Aj為樣品+無水乙醇混合后的吸光度。

DPPH自由基半數清除濃度（IC50）計算：以lgC（樣品濃度，mg/mL）為橫坐標，lgD（DPPH 自由基清除率，%）為縱坐標得到雙對數線性方程，計算DPPH 自由基清除率為50%時的樣品質量濃度，單位為mg/mL。

1.4.2 ABTS自由基清除能力

將50 mL 7.4 mol/L 的ABTS 和50 mL 2.6 mol/L 的過硫酸鉀溶液混合，于暗處放置12～16 h，制成ABTS儲備液。用60%乙醇稀釋，使儲備液吸光度在734 nm 下為（0.70±0.02），獲得ABTS工作液。將各樣品稀釋成不同質量濃度（0.05～1.25 mg/mL），取1 mL 于刻度試管中，加入6 mL 的ABTS工作液，混合均勻，室溫避光放置6 min，測定734 nm下的吸光度，以1 mg/mL 的VC 溶液作陽性對照。60%無水乙醇調零。每個樣品測定3 次，取平均值。計算ABTS自由基清除率。

式中：A0為水+ABTS 工作液的吸光度；Ai為樣品+ABTS 工作液的吸光度；Aj為樣品+60%無水乙醇的吸光度。

ABTS 自由基IC50計算：以lgC（樣品濃度，mg/mL）為橫坐標，lgD（ABTS 自由基清除率，%）為縱坐標得到雙對數線性方程，計算ABTS自由基清除率為50%時的樣品質量濃度，單位為mg/mL。

1.4.3 超氧陰離子自由基清除能力

各樣品稀釋成不同質量濃度，分別取1 mL 不同濃度樣品溶液于試管中，分別加入4.5 mL、50 mmol/L、pH 值為8.2 的Tris-HCl 緩沖溶液和2 mL 3 mmol/L 的鄰苯三酚溶液搖勻，在37 ℃水浴15 min，加入1.0 mL濃鹽酸。325 nm處測量吸光度Ai，以1 mg/mL 的VC 溶液作陽性對照。用蒸餾水調零，每個樣品測定3次，取平均值。計算超氧陰離子自由基清除率。

式中：A0為蒸餾水代替樣品作為空白對照測定空白吸光度；Ai為樣品的吸光度；Aj為2 mL蒸餾水代替鄰苯三酚的吸光度。

超氧陰離子自由基IC50計算：以lgC（樣品濃度，mg/mL）為橫坐標，lgD（超氧陰離子自由基清除率，%）為縱坐標得到雙對數線性方程，計算超氧陰離子自由基清除率為50%時的樣品質量濃度，單位為mg/mL。

1.5 數據統計與分析

采用Excel軟件對數據進行處理和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 8種復方中藥液生物活性物質的含量（見圖1）

圖1 8種復方中藥液生物活性物質含量Fig.1 Content of bioactive substances in eight kinds of compound Chinese herbal solutions

由圖1 可知，8 種復方中藥液總多酚含量從大到小依次為：PHBQC＞SBZ＞WWXDY＞YQH＞YJL＞QWT＞HLJDS＞BTWS，其中PHBQC 中總多酚含量最高，達8.27 g/L；其次是SBZ，總多酚含量為6.82 mg/mL。總黃酮含量從大到小依次為：YQH＞WWXDY＞PHBQC＞YJL＞QWT＞HLJDS＞SBZ＞BTWS，其中YQH 中的總黃酮含量達62.40 mg/mL，WWXDY的總黃酮含量也達到59.72 mg/mL，PHBQC、YJL和QWT的總黃酮含量分別為46.6、37.73、27.28 mg/mL。

2.2 8種復方中藥液體外自由基清除能力

2.2.1 8 種復方中藥液的體外DPPH 自由基清除能力（見圖2）

由圖2可知，8種復方中藥液的體外DPPH自由基清除能力依次為：YJL＞SBZ＞YQH＞PHBQC＞WWXDY＞QWT＞HLJDS＞BTWS，IC50依次為0.007、0.008、0.010、0.012、0.015、0.194、0.601、0.962 mg/mL，除HLJDS 和BTWS 外，其余6種藥液IC50均小于0.2 mg/mL。

2.2.2 8 種復方中藥液的體外ABTS 自由基清除能力（見圖3）

圖3 8種復方中藥液的體外ABTS自由基清除能力Fig.3 ABTS free radical scavenging ability of eight kinds of compound Chinese medicinal liquid in vitro

由圖3可知，8種復方中藥液的體外ABTS自由基清除能力依次為：WWXDY＞PHBQC＞YQH＞YJL=SBZ＞QWT＞HLJDS＞BTWS，IC50依次為0.171、0.190、0.308、0.348、0.348、0.469、1.114、2.07 mg/mL，HLJDS 和BTWS 的ABTS自由基清除力相對較弱。

2.2.3 8種復方中藥液的體外超氧陰離子自由基清除能力（見圖4）

圖4 8種復方中藥液的體外超氧陰離子自由基清除能力Fig.4 Superoxide anion free radical scavenging ability of eight kinds of compound Chinese medicinal liquid in vitro

由圖4 可知，8 種復方中藥液的體外超氧陰離子自由基清除能力為：PHBQC＞WWXDY＞YJL＞YQH＞HLJDS＞QWT＞SBZ＞BTWS，IC50為2.17、2.22、2.51、2.52、4.43、4.70、7.48、19.55 mg/mL，8 種中藥液的體外超氧陰離子自由基清除能力遠不及對DPPH、ABTS自由基的清除能力。

整體來看，8 種復方中藥液的DPPH 自由基清除力優于ABTS 自由基清除力，ABTS 自由基清除力優于體外超氧陰離子自由基清除能力。8種復方中藥液中，PHBQC總多酚含量最高，為8.27 mg/mL，YQH 中的總黃酮含量最高，為62.40 mg/mL；體外DPPH 自由基清除能力最好的是YJL，其IC50為0.007 mg/mL；體外ABTS 自由基清除能力最好的是WWXDY，IC50為0.171 mg/mL；體外超氧陰離子自由基清除能力較好的是PHBQC，IC50為2.17 mg/mL。

2.3 8 種復方中藥液生物活性物質含量與其抗氧化活性的相關性（見表2）

表2 8種復方中藥液生物活性物質含量與抗氧化活性的相關系數Tab.2 Correlation coefficient between the content of bioactive substances and antioxidant activity in eight kinds of compound Chinese medicinal liquid

由表2 可知，復方中藥液中的總多酚含量與DPPH 自由基清除力、ABTS自由基清除力呈強相關性，與超氧陰離子自由基清除力呈中等相關性；總黃酮含量與DPPH 自由基清除力、ABTS自由基清除力、超氧陰離子自由基清除力均呈強相關性。

3 討論

8種復方中藥液中總多酚和總黃酮含量均占優勢的是PHBQC、WWXDY、YQH、YJL。這幾組復方中藥組方由蒲公英、金銀花、板藍根、黃芩、甘草、野菊花、連翹、荊芥、薄荷、桔梗、黨參、黃芪、茯苓、杜仲、當歸和懷牛膝中的若干種提取物組配而成，其中蒲公英、板藍根、黨參均含多酚化合物和黃酮類物質，金銀花、甘草、黃芩、野菊花、黃芪、杜仲的黃酮類物質含量較高，連翹富含多酚化合物，可見富含總黃酮物質的中藥材種類多于富含多酚化合物的中藥材種類，故測得的總黃酮含量遠高于總多酚。

中藥能夠提高動物機體的抗氧化能力，促進畜禽日常健康生長，達到提高生產性能的功效，有益于健康養殖的可持續發展。張建明等[9]研究發現，在長江鱘幼魚基礎飼料中添加黃芪、黃檗、甘草等對其抗應激和對抗氧化能力具有顯著的促進作用。陳相如等[10]研究表明，拌料益生菌發酵補中益氣散300 mg/g可促進小鼠腸道絨毛健康生長，提高機體抗氧化活性。周子暉等[11]研究發現，蛋雞飼料中定期添加益母草、當歸、杜仲、女貞子、蒲公英等組成的中藥組方對蛋雞生產性能、抗氧化能力及蛋品質均具有提升效果。游斌杰等[12]研究發現，中藥提取物可能通過增強雛雞的抗氧化能力促進炎性相關因子的分泌、調節基因表達，實現抗炎效果，抵抗傳染性法氏囊病病毒。崔宇擎等[13]研究了中藥復合小肽對肉雞抗氧化功能、消化酶活力、肉品質和表觀代謝率的影響，結果表明，中藥復合小肽可提高肉雞體內營養物質消化沉積和抗氧化能力，其中以500 g/t 作為肉雞飼料添加劑的添加量最佳。王艷豐等[14]研究發現，日糧中添加中藥復方可顯著提高生長肥育豬的免疫功能和抗氧化活性，添加比例以1.0%和1.5%為宜。陳艷新等[15]研究結果顯示，添加以黃芪、五味子、益母草等7味中藥材配伍制成中藥復合制劑可有效提高蛋雞生產性能，改善雞蛋品質，提高雞蛋營養價值。

復方中藥液中總多酚含量與DPPH 自由基清除力、ABTS 自由基清除力呈強相關性，與超氧陰離子自由基清除力呈中等相關性；總黃酮含量與DPPH 自由基清除力、ABTS 自由基清除力、超氧陰離子自由基清除力均呈強相關性。周帆等[16]在提取石榴皮中總多酚的試驗中發現，總多酚含量越高，體外清除DPPH自由基清除率越高，抗氧化活性越強。閆旭宇等[17]研究發現，銀杏葉中總黃酮對羥基自由基的清除效果與總黃酮濃度呈正相關。李曉東等[18]研究發現，甘青青蘭抗氧化活性成分可能為酚酸類和黃酮類化合物，其總黃酮和總多酚含量與其抗氧化活性具有一定相關性。本研究結果與上述文獻研究報道結論一致。植物多酚因可使未成對電子離域而具有較強活性，可通過清除自由基、螯合金屬離子、抑制氧化酶活性而起到抗氧化作用[19]。黃酮類化合物因酚羥基上的氫原子可與過氧自由基結合生成黃酮自由基，與其他自由基反應，從而終止自由基鏈式反應[20]。由于多酚類化合物和黃酮類化合物具有較多的生物學活性功能，對畜牧養殖生產具有積極的促進作用，在飼料添加劑領域擁有廣闊的應用前景。

4 結論

本研究結果顯示，8 種復方中藥液中總多酚和總黃酮含量均占優勢的是PHBQC、WWXDY、YQH、YJL，可作為增強畜禽機體免疫力的飼料添加劑使用。組方中總多酚與總黃酮的含量可作為今后篩選畜禽中草藥無抗飼料添加劑的一項性能指標。