布魯氏菌病疫苗的應用現狀及防控技術

文│張偉 （河南省南陽市農業綜合行政執法支隊宛城執法大隊）

黃小東（河南省南陽市宛城區動物衛生監督所）

布魯氏菌病是一種能引起多種動物和人感染的細菌性疾病，能導致牛、羊、豬等動物出現流產和高熱等癥狀。感染人后不僅需要進行長期治療，還會造成嚴重的后遺癥。所以要對該病進行有效防控，減少由該病造成的經濟損失和公共衛生學方面的威脅。

一、布魯氏菌病的簡介

該病流入我國后不斷引發疾病，在上世紀八九十年代曾經得到很好的控制，而后又出現回升情況。近年來，布魯氏菌病對動物和人類的危害十分嚴重，需要及時采取相應措施進行有效防控。

1.病原。布魯氏菌是一種兼性細胞內寄生菌，經革蘭氏染色呈陰性。能在網狀內皮系統內造成持續感染的情況。病原對環境具有較強的抵抗力，通常在水源、土壤及分泌物中可以存活120天左右，在太陽光下可以存活超過4小時。但其對消毒劑比較敏感，常用的消毒劑都可以在短時間內將其殺死。布魯氏菌對溫度也比較敏感，當溫度達到60℃時，病原僅可存活30分鐘，當溫度達到70℃時，病原會在10分鐘內死亡。

2.流行病學。該病傳染源主要是牛、羊和豬，其次是犬和其他野生動物。病原通過呼吸道、消化道及生殖道傳播，發病和帶毒動物通過分泌物和排泄物將病原排出體外，對周圍環境造成污染，這樣當健康動物采食、吸入或經生殖道直接接觸病原后會受到感染而引發疾病。

3.臨床癥狀和病理變化。該病主要對動物的多個組織器官形成危害，主要有肝、脾、生殖系統和淋巴結等。可以導致這些組織器官發生炎癥和壞死，而后形成肉芽腫。雌性動物會出現流產、早產或死胎等情況，而雄性動物主要導致睪丸出現炎癥。人在感染該病后會出現低熱、肌肉關節疼痛、乏力等情況，影響正常的生育機能，喪失勞動力。

二、布魯氏菌病的疫苗研究及應用情況

目前對布魯氏菌病的疫苗研究已經成為該病防控的熱點，弱毒疫苗是預防布魯氏菌病的傳統疫苗，當前研究較多的是基因工程疫苗，但這些疫苗的應用效果并不理想。

1.傳統的疫苗。

（1）牛布魯氏菌弱毒疫苗。在布魯氏菌疫苗的研制過程中，最成功的疫苗為S19株，也是目前應用最廣泛的疫苗。而后美國于1956年對此疫苗所用的毒株進行減毒處理，也就是將其中的ery基因敲除，將用此毒株制成的疫苗命名為US19。我國最初應用的是從蘇聯引進的毒株，為A19株，應用該毒株疫苗已有60多年。對我國布魯氏菌病的防控起到了至關重要的作用。該疫苗并非ery基因敲除后的毒株制作的，但其能有效保護牛和綿羊免受布魯氏菌的攻擊，具有較長的免疫期，通常可達72個月甚至更長。該疫苗對山羊的免疫效果較差，對豬完全沒有免疫效果。而且本疫苗不能應用于妊娠期和哺乳期的牛、羊。

（2）羊布魯氏菌弱毒疫苗。羊布魯氏菌病疫苗所用的毒株是6056毒株經過多次傳代后獲取到的一種突變毒株。該毒株于1957年被證實能對山羊起到很好的保護作用，而后就開始進行廣泛應用，這也是經過OIE認可的疫苗，是當前在小反芻獸應用中最有效的疫苗。該疫苗需要應用皮下注射和通過黏膜進行免疫，具有非常好的免疫效果，但本疫苗不適用于妊娠期動物，由于其毒力強，可能會導致動物流產。

（3）豬布魯氏菌弱毒疫苗。種豬應用的疫苗為S2株，該毒株毒力弱，免疫后能產生出強大的保護力。而且本毒株制作的疫苗還能對牛、羊進行免疫，也可以達到較好的免疫效果。還可以應用于妊娠母畜，通常不會引起母畜出現流產癥狀，具有良好的安全性。

2.基因工程疫苗。基因工程疫苗是當前的研究熱點，雖然能解決一些問題，但也存在一些問題。導致研制的疫苗不能大批量應用于生產實踐中。

（1）DNA疫苗。由于布魯氏菌通常在細胞內寄生，可以使細胞產生特異性的免疫應答。這是由于菌體中的某些成分具有類似于T細胞的抗原功效，成為DNA疫苗的重點研究方面。通過在表達載體上構建出攜帶有布魯氏菌omp31的基因，以此來制作疫苗，用此疫苗在小鼠上進行試驗，結果小鼠能對病原攻擊起到良好的保護效果。而且這種疫苗具有良好的安全性和便利的制備工藝，但也有一些弱勢，最大的弱勢是在誘導機體產生免疫應答方面存在問題，常常不能引起機體出現針對性的免疫應答反應。特別是應用此DNA疫苗時，這種效果更明顯。

（2）基因缺失疫苗。應用基因工程技術可以將布魯氏菌的一些基因敲除或沉默后用于制作疫苗，這樣的疫苗為基因缺失苗，將bp26和omp31基因敲除后制成的基因缺失苗不僅不會對動物相關檢測造成干擾，還能起到疫苗效果，引起誘導效應，而且通過檢測可以區別是自然感染還是人工感染。具有非常高的優勢，這也使得本類疫苗成為新疫苗研究的熱點。

（3）亞單位疫苗。由于布魯氏菌的外膜上有一些蛋白質具有良好的抗性，可以用于亞單位疫苗的研發，可以通過基因工程技術獲得這些蛋白質的編碼基因，而后將這些基因和質粒重組，將其轉至宿主中進行表達，這樣獲得了大量的保護性肽段。再將這些肽段和佐劑結合，制成亞單位疫苗。亞單位疫苗具有成分單一、安全等優點，但也有單獨使用效果不好、生產成本高、工藝復雜等缺點，因此在臨床上不容易得到推廣和應用。

（4）“無毒”疫苗。有的布魯氏菌病不會引起任何宿主發病，用這種菌種制成疫苗進行免疫可以使試驗小鼠獲得免疫力。由此可見，這種布魯氏菌可以用來制成疫苗用于免疫，而且沒有感染風險，安全可靠。

（5）載體疫苗。當選擇好抗原時，其有效地呈遞給免疫系統就顯得比較重要，這就需要選擇良好的載體進行遞送，常見的可以供遞送的載體有大腸桿菌、乳酸乳球菌、牛痘病毒、沙門氏菌等。抗原經過這些病原遞送后，能很好地被機體免疫系統所識別，從而誘導淋巴細胞產生干擾素。但有的蛋白通過病毒遞送后并不能產生有效的免疫保護，但牛痘病毒自身可以通過對宿主的干擾素活性調節。

（6）外膜囊泡。有的革蘭氏陰性菌能釋放外膜囊泡，當其處于正常生長或在一些特殊環境中就會產生外膜囊泡，多見于在土壤、培養基及正在感染宿主的過程中。而囊泡具有磷脂、脂多糖及外膜蛋白等多種成分，有證據表明，囊泡、機體調節免疫力及毒力因子釋放等具有非常大的相關性。

三、布魯氏菌病診斷方法研究

1.血清學方法。

（1）試管凝集試驗。本方法在臨床上應用較為廣泛，尤其是在牛、羊和豬的布魯氏菌診斷中。本試驗只針對光滑型布魯氏菌脂多糖，所以本方法不能用于粗糙型犬布魯氏菌。具體方法是將發病動物的血清經過2倍稀釋，而后加入滅活的布魯氏菌抗原，兩者在微量板或反應管中反應一夜，觀察結果，如果出現凝集反應，則復合物會沉降，上清液清亮。如果沒有發生凝集反應，則液體為混懸液。

（2）虎紅平板凝集試驗。本試驗是診斷布魯氏菌病最快捷的方法。通過將虎紅平板凝集抗原滴于清潔的玻璃平板上，滴加量為0.03毫升，而后再往上滴加0.03毫升的被檢血清，將二者混合后約4分鐘觀察結果。當出現凝集情況時可以判定結果為陽性。需要通過試管凝集的方法再次驗證結果。

（3）補體結合試驗。該方法操作相對比較復雜，通常是在微量板中進行操作，在試驗時要對血清、抗原和補體進行孵育，不同溫度需要孵育的時間不一致，通常在37℃左右時需要半小時即可，當溫度為2～8℃時需要孵育時長為14～18小時。血清質量較差時應降低孵育溫度，本方法的特異性較高，敏感性相對較低。在國際上通用，尤其多用于國際貿易。

（4）酶聯免疫吸附試驗。酶聯免疫吸附試驗的方法應用較為廣泛，具有非常高的敏感性。目前應用較為廣的是間接或競爭ELISA，用光滑型脂多糖或O鏈抗原等作為包被抗原。但其在檢測時難以區分抗體是由疫苗接種產生的還是自然感染產生的。但總體來說，ELISA方法具有高敏感性、高特異性和高通量，適用于臨床大量樣本的檢測。而且目前已經有成熟的試劑盒可以應用。

（5）熒光偏振試驗。本方法的機理是根據分子大小不同產生的旋轉速度不同而進行的。經過應用熒光染料對布魯氏菌抗原分子進行標記，這樣當血清中含有該病抗體時，抗原和抗體就會凝集，形成抗原抗體復合物，這種復合物在液相中轉動速度減慢，導致熒光偏振程度升高，由此被儀器檢測到。熒光偏振程度和待檢樣品中抗體的濃度具有相關性。本方法是OIE指定的國際貿易方法，其具有非常高的特異性和敏感性。

2.細胞免疫學方法。

（1）布魯氏菌素皮試驗。本試驗是應用細胞免疫學方法進行，試驗需要將標準抗原純化后應用。本方式適用于檢測沒有接種疫苗的動物血清，具有非常高的特異性，被認為是該病最特異的方法之一。目前多用本方法進行群體效價水平檢測。

（2）γ-干擾素釋放試驗。本方法是應用適當抗原物質去刺激機體，使血液中產生了淋巴細胞，這樣就會產生γ-干擾素，而后應用ELISA來進行檢測的一種方法。本方法可應用于對布魯氏菌病和假陽性的區分，但在試驗中也需要應用到特異性抗原。

四、結語

動物布魯氏菌病雖然目前還未得到凈化，但已成為當前的研究熱點，尤其是對疫苗、診斷技術的研究在不斷深入，相信在不久的將來會得到全面應用，對該病的凈化起到至關重要的作用。但養殖場還是要以科學的飼養管理為基礎，這樣才能做好疫病防控工作。