生肌玉紅膏治療糖尿病足潰瘍活性成分、核心作用靶點基因的篩選及靶向結合關系預測驗證

周宇，郭小英，吳標良

1 右江民族醫學院附屬醫院內分泌科，廣西百色 533000；2 右江民族醫學院研究生學院

糖尿病足潰瘍（Diabetic Foot Ulcer，DFU）是糖尿病足的主要表現形式，是由神經病變、血管病變、感染和外傷等多種因素導致的足部皮膚和/或深層組織損傷［1］。DFU 的年發病率約為8.1%，患者截肢率可高達85%［2］，且70%的患者在截肢術后5 年內死亡［3］。因此，早期正確預防和治療DFU 可提高糖尿病患者的生存質量。中醫外治法是臨床上治療DFU 的常用方法，其中以潰瘍創面局部用藥最為常用［4］。生肌玉紅膏是一種創面局部外用藥物，由當歸、甘草、紫草、白芷、血竭、蟲白蠟、麻油和輕粉（化學名稱氯化亞汞）配制而成，目前已廣泛用于壓瘡、肛周疾病術后、燒傷等瘡瘍疾病的治療中［5］。研究［6-7］發現，生肌玉紅膏能有效提高DFU 患者的足部創面愈合率，緩解創面疼痛。但生肌玉紅膏治療DFU的具體作用機制尚不明確。2023年1—5月，我們基于數據庫數據篩選生肌玉紅膏治療DFU 的活性成分及其核心作用靶點基因，并驗證生肌玉紅膏治療DFU 的活性成分及其核心作用靶點基因的靶向結合關系，探討生肌玉紅膏方劑治療DFU 的可能作用機制，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 生肌玉紅膏的活性成分及其作用靶點基因篩選 在TCMSP 數據庫（https：//old. tcmsp-e. com/tcmsp.php）中檢索生肌玉紅膏的主要活性成分，在查詢界面內依次分別輸入各成分的漢語拼音“DANG GUI、GAN CAO、ZI CAO、BAI ZHI、XUE JIE、CHONG BAI LA、MA YOU、QING FEN”，篩選出類藥性（DL）≥0.18 的生肌玉紅膏的活性成分，根據結果查詢活性成分的對應作用靶點基因，并使用UniProt 數據庫（https：//www. uniprot. org）將靶點基因英文全稱轉換成通用簡稱；從BATMAN-TCM 數據庫（http：//bionet. ncpsb. org. cn/batman-tcm）以相同的輸入方式中篩選出生肌玉紅膏的主要活性成分（Score cutoff≥20 和P≤0.05），并找出其對應作用靶點基因。對于TCMSP 和BATMAN-TCM 兩個數據庫均未收錄的藥物成分“輕粉”，通過PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫找到成分對應的SMILES 號后輸入 SuperPred 數據庫（https：//prediction.charite.de/subpages/target_prediction.php）預測其作用靶點基因。匯總TCMSP 數據庫、BATMAN-TCM數據庫、SuperPred 數據庫中篩選出生肌玉紅膏活性成分及其作用靶點基因，取并集。將活性成分通過TCMSP 數據庫、PubChem 數據庫轉換成PubChem CID號，去除無確定化學式和結構式的成分，刪除重復值后獲得生肌玉紅膏的活性成分及其作用靶點基因。

1.2 DFU 發病的靶點基因篩選 以“diabetic foot ulcer”為關鍵詞，通過GeneCards（https：//www.uniprot. org）、OMIM（https：//omim. org）、PharmGkb（https：//www. pharmgkb. org）、TTD（https：//www.pharmgkb.org）數據庫進行檢索，匯總數據庫中所有DFU 發病的靶點基因，取并集后獲得DFU 發病的靶點基因。

1.3 生肌玉紅膏治療DFU 的作用靶點基因篩選及其生物學功能分析 將“1.1”得到的生肌玉紅膏的活性成分作用靶點基因、“1.2” 得到的DFU 發病靶點基因取交集，得到生肌玉紅膏治療DFU 的作用靶點基因。繪制韋恩圖，使用Cytoscape3.8.0 軟件插件CytoNCA 對各個靶點基因進行Betweenness、Closeness、Eigenvector、Local Average Connectivitybased method、Network 評分，保留五項評分中均大于中位評分的作用靶點基因，為生肌玉紅膏治療DFU的作用靶點基因。運用基因本體論（GO）和京都基因與基因百科全書（KEGG）通路富集分生肌玉紅膏治療DFU作用靶點基因的生物學功能。

1.4 生肌玉紅膏治療DFU 核心作用靶點基因篩選及其與生肌玉紅膏活性成分靶向結合關系預測及驗證 生肌玉紅膏治療DFU 核心作用靶點基因篩選、與核心作用靶點基因有靶向結合關系的生肌玉紅膏活性成分預測 通過GOSemSim 包篩選出在生物過程、分子功能和細胞組分方面具有相似功能的核心DFU 發病靶點基因，并繪制靶點基因功能相似箱型圖。選取靶點基因功能相似箱型圖評分前5的作用靶點基因為核心作用靶點基因，預測與其有靶向結合關系的生肌玉紅膏活性成分。將靶點基因功能相似箱型圖評分前2 的核心靶點基因及與其具有靶向結合關系的生肌玉紅膏活性成分進行分子對接驗證。從PubChem 網站下載活性成分結構，將2 個核心靶點基因名稱輸入UniProt數據庫，選擇物種為智人，得到靶點基因對應的UniProt 編號。在RCSB PDB 數據庫（https：//www. rcsb. org）搜索靶點基因UniProt 編號對應的靶點基因蛋白結構，分別下載評分最高的蛋白結構，應用Autodock vina 軟件對活性成分和靶點基因蛋白進行分子對接并計算對接得分，分子對接得分絕對值＞5 kcal/moL 視為結合穩定，使用PyMOL 軟件進行作圖，顯示與活性成分結合的靶點基因的氨基酸殘基，并計算兩者連接氫鍵的長度。

2 結果

2.1 生肌玉紅膏活性成分及其作用靶點基因 槲皮素、熊果酸、甘草查爾酮A、1-甲基-2-十二烷基-4-喹諾酮等371 個成分為生肌玉紅膏的活性成分，與生肌玉紅膏活性成分有靶向結合關系的作用靶點基因有1 762 個，主要包括表皮生長因子受體（EGFR）、信號轉導與轉錄激活因子3（STAT3）、轉化生長因子β1（TGF-β1）、SRC 原癌基因（SRC）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）等。

2.2 DFU 發病的靶點基因 GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD4 個數據庫中，分別獲取2 647、167、8、19 個DFU 治療靶點基因，取并集后去除重復的靶點基因，最終得到2 690個DFU發病的靶點基因。

2.3 生肌玉紅膏治療DFU 的作用靶點基因及其生物學功能 將1 762 個生肌玉紅膏活性成分作用靶點基因和2 690 個DFU 發病靶點基因取交集，共得到生肌玉紅膏治療DFU 的作用靶點基因639個。經CytoNCA 插件對639 個靶點基因進行二次評分后，最終EGFR、STAT3、AKT1 等39 個為生肌玉紅膏治療DFU 的作用靶點基因。GO 功能分析的結果顯示，生肌玉紅膏治療DFU 的作用靶點基因主要涉及上皮細胞增殖、肌細胞增殖、miRNA 轉錄等生物學過程。KEGG 通路富集分析顯示，生肌玉紅膏治療DFU 的作用靶點基因主要富集于PI3K/AKT 信號通路、AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路等。

2.4 生肌玉紅膏治療DFU 核心作用靶點基因及其與生肌玉紅膏活性成分靶向結合關系 GOSemSim包分析結果顯示，EGFR、STAT3、TGF-β1、SRC、AKT1等5個作用基因為生肌玉紅膏治療DFU的核心作用靶點基因。生肌玉紅膏治療DFU的5個關鍵靶點基因對應的活性成分共29 個，包含甘草活性成分17個、當歸活性成分6個、白芷活性成分4個、紫草活性成分1個、血竭活性成分1個、輕粉活性成分1個，其中當歸和白芷共有的活性成分1 個，甘草和紫草共有的活性成分1個。

靶點基因功能相似箱型圖評分前兩個核心靶點基因為EGFR 和STAT3，生肌玉紅膏中的活性成分槲皮素、1-甲基-2-十二烷基-4-喹諾酮、氯化亞汞和EGFR 有靶向結合關系，熊果酸、甘草查爾酮A 與STAT3有靶向結合關系。分子對接結果顯示除氯化亞汞和EGFR 的結合不穩定外，其余活性成分和靶點基因結合較好。其中槲皮素與EGFR 對接得分為-7.9 kcal/moL，槲皮素與EGFR 的氨基酸殘基ASP-831、GLN-767、THR-830、GLU-738 連接的氫鍵長度分別為2.5、2.2、2.1、2.1 ?，與氨基酸殘基MET-769存在兩條連接氫鍵，長度分別為2.5、2.4 ?；1-甲基-2-十二烷基-4-喹諾酮與EGFR 對接得分為-5.9 kcal/moL，1-甲基-2-十二烷基-4-喹諾酮與EGFR 的ASP-831 氨基酸殘基連接的氫鍵長度為2.5 ?；熊果酸與STAT3 對接得分為-8.0 kcal/moL，熊果酸與STAT3 的氨基酸殘基ILE-258 連接的氫鍵長度為2.1 ?；甘草查爾酮A 與STAT3 對接得分為-6.3kcal/mol，甘草查爾酮A 與STAT3 的氨基酸殘基GLU-247、GLU-326、SER-514 的連接的氫鍵長度分別為分別為2.5、2.2、2.2 ?。

3 討論

生肌玉紅膏是一種經典外用中藥制劑，用于治療癰疽、皮膚潰爛等疾病，能減少患者的皮膚愈合時間、減輕患者痛苦。我們通過網絡藥理學的方法獲取生肌玉紅膏各配方中的主要活性成分，通過活性成分與DFU 相關的靶點基因靶向結合關系發現生肌玉紅膏治療DFU 的關鍵成分為槲皮素、1-甲基-2-十二烷基-4-喹諾酮、熊果酸、甘草查爾酮A 等。槲皮素有抑制炎癥、氧化應激和細胞凋亡的作用［8］，局部應用槲皮素于創面可以減少炎癥細胞的數量，同時調節血管內皮生長因子（VEGF）和TGF-β1的表達水平，從而促進成纖維細胞的增殖和微血管生成，加速創面的愈合［9］。熊果酸具有抗炎、抗菌的藥理學活性［10］，在糖尿病小鼠創面治療中，加入熊果酸的納米纖維傷口敷料更有效地抑制炎癥和氧化應激，同時促進創面的血管生成、膠原沉積和再上皮化，從而使糖尿病小鼠皮膚創面更快愈合［11］。甘草查爾酮A是一種黃酮類化合物，具有廣泛的藥理學活性，包括抗炎、抗氧化、抗菌，調節血糖等［12］。關于1-甲基-2-十二烷基-4-喹諾酮的藥理學報道較少，而其與EGFR 分子對接能形成穩定的化合物，說明其在治療DFU中有一定的潛能。

生肌玉紅膏治療DFU 的關鍵靶點基因為EGFR、STAT3、TGF-β1、SRC、AKT1。EGFR 是一種跨膜酪氨酸激酶受體，屬于酪氨酸激酶受體家族的成員，主要在上皮細胞中表達，在細胞生長、分化和存活等生物過程中起到關鍵作用［13］。EGFR 信號傳導激活能驅動人角質形成細胞干細胞的移動和修復功能，從而促進皮膚再生［14］。STAT3是一種在細胞內發揮重要作用的蛋白質，主要涉及細胞生長、分化、免疫反應和凋亡等過程，是多種炎癥信號和血管生成的關鍵調控因子，可以被具有內在酪氨酸激酶活性的受體EGFR 和非受體酪氨酸激酶JAK 來激活［15］。STAT3 的激活會增加血管內皮生長因子（VEGF）和基質金屬蛋白酶（MMP）的表達，促進內皮細胞增殖［16］；TGF-β1能增加糖尿病大鼠燒傷創面的VEGF表達水平，并誘導毛細血管再生和重塑以促進傷口愈合［17］；SRC是乳腺癌發生相關的基因，能促進傷口愈合過程中角質形成細胞的遷移；AKT1 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）的家族成員之一，主要在內皮細胞中表達［18］。這5 個靶點基因與糖尿病足潰瘍的愈合有直接或間接的聯系，可能是生肌玉紅膏發揮治療作用的關鍵靶點基因。

生肌玉紅膏治療DFU 靶點基因涉及的主要信號通路為PI3K/AKT 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、HIF-1 信號通路。PI3K/AKT 信號通路不僅參與糖代謝調控，還參與創面愈合，許多藥物促進傷口愈合的核心機制之一是激活PI3K/AKT 通路，通過增加VEGF 表達來促進血管形成、肉芽形成和上皮化［19］；AGE 和RAGE 在糖尿病足潰瘍的形成和進展中起著重要作用。AGE 是由高血糖和氧化應激引起的糖基化終產物，可通過與RAGE 結合而產生炎癥和氧化應激反應。在糖尿病患者中，長期高血糖導致AGE 的過度積累，進而激活RAGE。RAGE 的激活會導致炎癥反應、血管內皮細胞功能障礙和影響成纖維細胞的增殖功能，從而抑制傷口的愈合和加重組織損傷［20］。HIF-1 信號通路參與了糖尿病足潰瘍的愈合，其中缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）/VEGF軸功能受損是糖尿病血管生成障礙的主要機制。在糖尿病中，HIF-1α 的功能活性降低，導致傷口無法上調VEGF 以響應缺血組織信號，從而導致血管生成受損和傷口愈合受損［21］。

綜上所述，生肌玉紅膏活性成分通過影響PI3K/AKT 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、HIF-1信號通路等，靶向調控EGFR、STAT3、AKT1 等作用靶點基因，參與促進上皮細胞增殖、抑制晚期糖基化終末產物生成等過程，發揮DFU 治療作用。后續應進一步探索生肌玉紅膏治療DFU 的活性成分與疾病靶點基因的具體作用機制，為生肌玉紅膏的臨床應用提供理論依據。