痹祺膠囊治療類風濕性關節炎的藥效研究及網絡機制預測

李 新 ，卜睿臻，王玉麗 ，李虎玲 ，韓彥琪 ，王 磊，張星艷 ，趙文靜 ，許 浚 ，張鐵軍 *，劉昌孝 *

1.天津藥物研究院 天津市中藥質量標志物重點實驗室，天津 300462

2.天津藥物研究院 中藥現代制劑與質量控制技術國家地方聯合工程實驗室，天津 300462

3.天津藥物研究院 藥物成藥性評價與系統轉化全國重點實驗室，天津 300462

4.天津達仁堂京萬紅藥業有限公司，天津 300112

5.津藥達仁堂集團股份有限公司，天津 300193

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是以關節滑膜慢性炎癥為主的自身免疫性疾病[1]，以關節腫脹、關節壓痛和持續性滑膜炎為特征。研究發現，免疫細胞的激活、炎癥因子的大量釋放、氧化應激等與RA 的發病息息相關，并且在這些活性物質的作用下進一步加快患者病情的進展[2]。RA 沒有永久的治療方法，目前RA 的治療用藥主要依賴于非甾體抗炎藥、糖皮質激素、生物制劑等，但內科治療方法起效緩慢、久服對肝、腎及血液系統損害較大[3]。終末期RA 下只能采用外科的部分或全部關節置換等關節整形手術[4]，然而手術前的評估較為嚴苛，術后可能存在潛在的遠期并發癥，如感染、磨損、骨溶解等[5]。RA 在中醫中稱為“痹證”，中醫藥治療RA 在改善臨床癥狀、藥物不良反應小等方面具有獨特的優勢。痹祺膠囊是由馬錢子、黨參、白術、丹參、茯苓、牛膝、地龍、川芎、三七和甘草10 味藥材組成的中藥復方制劑，具有益氣養血、祛風除濕、活血止痛的作用，臨床上用于氣血不足、風濕瘀阻、肌肉關節酸痛、關節腫大、僵硬變形或肌肉萎縮、氣短乏力；風濕、RA，腰肌勞損，軟組織損傷屬上述證候者[6-7]。痹祺膠囊在臨床上表現出較好的抗關節炎作用，研究發現，痹祺膠囊可通過抑制骨保護蛋白（osteoprotegerin，OPG）/核因子-κB 受體激活子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）/核因子-κB 受體活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉導子和轉錄激活子（signal transducer and activators of transcription，STATs）信號通路降低大鼠滑膜增生，減輕關節軟骨及骨破壞[8-9]。本研究采用膠原誘導的關節炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型及網絡藥理學方法[10]研究痹祺膠囊在整體動物模型下對RA 大鼠的藥效作用及可能機制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠120 只，體質量110～130 g，由北京斯貝福生物技術有限公司提供，許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養在天津天誠新藥評價有限公司實驗動物屏障系統［合格證SYXK（津）2021-0008］，溫度、濕度、換氣次數由中央系統自動控制，溫度維持在20～26 ℃，相對濕度維持在40%～70%，通風次數為10～15 次/h 全新風，光照為12 h 明、12 h 暗。自由攝食飲水。實驗動物的使用經天津藥物研究院新藥評價有限公司實驗動物倫理委員會批準（批準號No.2021031803）。

1.2 藥品與試劑

痹祺膠囊（0.3 g/粒，批號311574）由天津達仁堂京萬紅藥業有限公司提供；醋酸潑尼松片（5 mg/片，批號21020162）購自新鄉市常樂制藥有限責任公司；雷公藤總苷片（10 mg/片，批號180502）購自上海復旦復華藥業有限公司；雞II 型膠原蛋白購自美國 Chondrex 公司；大鼠白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA 試劑盒（批號P261453）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）ELISA 試劑盒（批號P254162）購自美國R&D Systems 公司；大鼠IL-17 ELISA 試劑盒（批號2104251）購自上海西唐生物科技有限公司；大鼠IL-10 ELISA 試劑盒（批號22J225）購自ExCell Bio 公司；類風濕因子（rheumatoid factor，RF）檢測試劑盒（批號20210407）購自南京建成生物工程研究所；大鼠γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）ELISA試劑盒（批號B303835）購自Biolegend 公司。

1.3 儀器

YLS-7B 型足腫儀（山東省醫學科學院設備站）；SpectraMax M5 型酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；ASP200S 型自動真空組織脫水機；EG1150H 型自動生物組織包埋機、RM2255 型切片機（德國Leica公司）；Ci-L 型顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

2.1.1 配制II 型膠原混懸乳劑 取0.1 mol/L 冰醋酸溶液10 mL 與雞II 型膠原20 mg，于棕色試劑瓶內，冰浴下充分混合均勻，直至白色絮狀雞II 型膠原完全溶于冰醋酸內，并于實驗前加入弗氏完全佐劑并充分乳化，使雞II 型膠原質量濃度為1 mg/mL。

2.1.2 CIA 大鼠模型制備 120 只SD 大鼠適應期喂養1 周，隨機取10 只作為對照組，其余所有大鼠均進行II 型膠原蛋白造模。于左側足跎肉墊處皮內注射雞II 型膠原蛋白（0.1 mL/只），注射后注射點按壓防液體外流。對照組大鼠以同樣方式注射等體積生理鹽水注射液。在第1 次注射免疫的第7 天，在背部注射相同乳劑0.1 mL 進行加強免疫，密切觀察大鼠狀態至造模15 d 篩選雙側關節出現炎癥腫脹的動物進行分組。

2.1.3 給藥 選取造模成功大鼠重新標記后用隨機數字法分為模型組、潑尼松（10 mg/kg）組、雷公藤總苷（10 mg/kg）組和痹祺膠囊各劑量（0.05、0.10、0.20、0.40 g/kg）組。各給藥組ig 相應藥物，對照組和模型組ig 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，1 次/d，連續15 d，期間給予SPF 級動物常規飼料及飲水。

2.2 指標觀察及檢測

2.2.1 體質量測定 給藥第1、3、5、8、10、12、15 天，用天平對大鼠體質量進行稱量，計算每組大鼠的平均體質量。

2.2.2 足趾腫脹度測定 給藥第1、3、5、8、10、12、15 天，用足腫脹測定儀測量大鼠右后爪腫脹度。

2.2.3 關節炎評分 左后爪注射II 型膠原15 d 后，右后爪會形成繼發性關節炎，監測給藥第1、3、5、8、10、12、15 天的關節炎指數評分[11]。0 分代表正常足爪；1 分代表足趾紅腫；2 分代表足趾和足掌紅腫；3 分代表腫脹至踝關節以下；4 分代表整個足爪完全腫脹，不能彎曲。將每只大鼠的4 只足爪得分相加作為關節炎得分，每只大鼠最高得分為16 分。

2.2.4 血清RF 及炎癥因子檢測 末次給藥前禁食不禁水12 h 以上，于末次給藥結束1 h 后，大鼠以戊巴比妥鈉進行麻醉后，從腹主動脈采血于采血管中，4 ℃、3000 r/min 離心10 min，分離得到血清樣品，按照試劑盒說明書分別檢測RF、IL-17、IL-10、TNF-α、IL-1β 和IFN-γ 水平。

2.2.5 脾臟、胸腺指數測定 于末次給藥結束1 h腹主動脈采血后，分別收集各組脾臟與胸腺，稱定質量并計算臟器指數。

2.2.6 踝關節組織病理學檢測 取大鼠右爪踝關節部分，采用10%多聚甲醛溶液固定后，將組織經甲酸甲醛脫鈣液處理后，采用不同濃度的乙醇溶液梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片，依次經蘇木素和伊紅染色，封片后鏡下觀察并比較各組踝關節滑膜增生，炎性細胞浸潤，關節腔浸出、關節軟骨破壞、纖維化等情況。

2.3 網絡藥理學分析

2.3.1 目標化合物的選取 結合本課題組前期化學物質組及血中移行成分選取痹祺膠囊中39 個化合物為研究對象，詳細信息見表1。

表1 痹祺膠囊目標化合物Table 1 Candidate active compounds in Biqi Capsule

2.3.2 靶標蛋白選取 通過 TCMSP 數據庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、CTD 數據庫（https://ctdbase.org）和PharmMapper 數據庫（http://lilabecust.cn/pharmmapper/）檢索得到目標化合物相關靶標蛋白，通過 OMIM 數據庫（https://omim.org/）、TTD 數據庫（http://db.idrblab.net/ttd/）、DisGeNet 數據庫（http://www.disgenet.org/home/）和GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）檢索得到RA 相關靶點，并借助Uniprot 數據庫（http://www.uniprot.org/）校正其靶標蛋白為官方名。

2.3.3 構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡并篩選關鍵蛋白靶點 將化合物靶點與疾病靶點取交互，將整合的交集靶點信息導入STRING10 數據庫（http://string-db.org/）中，物種限定為“Homo sapiens”，閾值限定為0.900，獲得蛋白間相互作用關系，將結果導入Cytoscape 3.6.0軟件中，通過Cytoscape 軟件繪制PPI 網絡，以度值大于2 倍中位數篩選PPI 網絡中關鍵靶點蛋白。

2.3.4 通路分析及生物信息學分析 運用Omicsbean 軟件對靶點蛋白進行生物信息學分析，探究靶點蛋白在細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）以及生物過程（biological process，BP）方面的作用機制。然后，通過STRING10 數據庫得到與靶點相關的通路過程，利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫（http://www.genome.jp/kegg/）分析并查閱相關文獻，對得到的通路進行深入分析。

2.3.5 “藥材-化合物-靶點-通路-疾病”網絡構建根據上述痹祺膠囊39 個化學成分的靶點及通路預測結果，在Excel 表格中建立藥材-化合物、化合物-靶點、靶點-通路、靶點-疾病的相互對應關系，導入Cytoscape 3.6.0 軟件中構建網絡，并運用其插件Network Analyzer 計算網絡的特征。網絡中節點表示化合物、靶點以及作用通路、藥理作用、功效。邊表示藥材-化合物、化合物-靶點、靶點-通路以及靶點-疾病相互作用。經處理后，得到39 個成分的相關靶點、通路預測圖，以該圖來表示痹祺膠囊“藥材-化合物-靶點-通路-疾病”間的相互關系。

2.4 統計學分析

3 結果

3.1 痹祺膠囊對CIA 大鼠體質量、足趾腫脹度和關節炎評分的影響

如圖1 所示，15 d 的II 型膠原造模后，大鼠體質量減輕，足趾相繼出現紅腫，關節腫大，關節畸形，導致行走艱難，嚴重的甚至會喪失活動能力，說明成功建立了CIA 大鼠模型。連續給藥過程中監測大鼠的體質量、足趾腫脹度及關節炎評分，結果顯示隨著給藥時間的延長，痹祺膠囊（0.20、0.40 g/kg）組可改善關節炎大鼠的體質量。在給藥5 d 時，痹祺膠囊（0.40 g/kg）組顯著降低大鼠的足趾腫脹度（P＜0.05），給藥8～15 d 后痹祺膠囊各給藥組均顯著降低足趾腫脹度（P＜0.01）。在給藥5 d 時，痹祺膠囊（0.40 g/kg）組明顯降低關節炎評分（P＜0.05），隨著給藥時間的延長，至給藥12 d 時痹祺膠囊（0.10、0.20、0.40 g/kg）組均可顯著降低CIA 大鼠關節炎評分（P＜0.05、0.01）。綜上說明，痹祺膠囊可改善關節炎大鼠狀態，具有明顯的抗炎作用，表現在改善足趾腫脹度、降低關節炎評分方面。

圖1 痹祺膠囊對CIA 大鼠體質量、足趾腫脹度和關節炎評分的影響 (±s , n = 10)Fig.1 Effect of Biqi Capsule on body weight, foot swelling and arthritis score in CIA rats (±s , n = 10)

3.2 痹祺膠囊對CIA 大鼠血清RF 及炎性因子水平的影響

細胞因子在RA 炎癥與關節損傷中扮演著重要的角色。如表2 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中RF、IL-17、IFN-γ、TNF-α 和IL-1β 水平均顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）；與模型組比較，痹祺膠囊各劑量組大鼠血清中RF、IFN-γ、TNF-α 和IL-1β 水平均明顯降低（P＜0.05、0.01、0.001），痹祺膠囊（0.10、0.20、0.40 g/kg）組血清中IL-17 水平顯著降低（P＜0.05、0.001），且呈劑量相關性。IL-10 具有較強的抗炎作用，提高IL-10 含量有利于抑制體內炎性因子的釋放和清除。結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-10 水平呈下降趨勢；與模型組比較，痹祺膠囊可上調大鼠血清中IL-10 水平。

表2 痹祺膠囊對CIA 大鼠血清RF 及炎性因子水平的影響 (±s , n = 6)Table 2 Effect of Biqi Capsule on levels of RF and inflammatory factors in serum of CIA rats (±s , n = 6)

表2 痹祺膠囊對CIA 大鼠血清RF 及炎性因子水平的影響 (±s , n = 6)Table 2 Effect of Biqi Capsule on levels of RF and inflammatory factors in serum of CIA rats (±s , n = 6)

與對照組比較：&P＜0.05 &&P＜0.01 &&&P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001&P < 0.05 &&P < 0.01 &&&P < 0.001 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs model group

組別 劑量/(g·kg?1) RF/(IU·mL?1) IL-17/(pg·mL?1) IFN-γ/(pg·mL?1)TNF-α/(pg·mL?1)IL-1β/(pg·mL?1)IL-10/(pg·mL?1)對照 — 140.87±3.64 61.13±8.41 8.50±0.67 5.81±0.31 18.70±2.47 27.03±10.04模型 — 180.23±4.83&&& 94.67±8.95& 47.95±15.21&& 11.56±2.08&&& 39.60±6.21&&& 15.01±3.92潑尼松 0.01 146.07±3.15*** 64.81±5.15* 13.40±2.14** 6.06±0.36*** 21.25±2.41** 26.74±3.86雷公藤總苷 0.01 164.93±2.48* 52.96±7.47** 9.67±0.43** 6.62±0.47** 16.27±2.35*** 18.42±5.13痹祺膠囊 0.05 162.30±2.80** 69.90±12.03 13.80±2.55** 6.59±0.66** 21.02±3.32** 15.13±2.53 0.10 153.87±4.92** 58.80±11.55*** 17.38±7.16* 6.26±0.37** 17.38±1.82*** 21.64±8.13 0.20 148.43±5.42** 46.99±5.24* 12.16±1.20** 5.37±0.18*** 22.25±3.25** 22.41±10.01 0.40 136.33±5.84*** 52.05±8.23*** 8.99±0.95** 5.99±0.39*** 20.87±1.20** 23.39±8.88

3.3 痹祺膠囊對CIA 大鼠脾臟及胸腺指數的影響

如圖2 所示，與對照組比較，模型組大鼠胸腺及脾臟指數均明顯增大（P＜0.01、0.001），提示在關節炎病理狀態下胸腺和脾臟出現腫大；經15 d 連續給藥后，痹祺膠囊各給藥組均表現出降低脾臟指數的作用，在降低胸腺指數上顯示出劑量相關性，其中0.20、0.40 g/kg 劑量組具有顯著性差異（P＜0.05、0.01），表明痹祺膠囊對于CIA 導致的脾臟和胸腺損傷有著一定的改善作用。

圖2 痹祺膠囊對CIA 大鼠臟器指數的影響 (±s , n = 8)Fig.2 Effect of Biqi Capsule on organ index in CIA rats (±s , n = 8)

3.4 痹祺膠囊對CIA 大鼠踝關節組織病理變化的影響

如圖3 所示，對照組大鼠踝關節組織結構基本正常，關節面光滑，關節腔內無滲出，滑膜細胞及結締組織未見增生；模型組大鼠關節軟骨被破壞，軟骨細胞或大量增生或壞死，局部可見壞死組織碎片，可見大量滑膜結締組織增生，侵蝕關節軟骨及骨，并伴大量炎性細胞浸潤；痹祺膠囊給藥組對CIA大鼠的治療作用呈劑量相關性，表現在減輕關節軟骨破壞、關節腔內壞死組織減少、軟骨細胞增生或壞死減少、滑膜結締組織增生減少、炎性細胞浸潤情況顯著降低。

圖3 各組大鼠踝關節組織病理觀察結果 (HE, ×100)Fig.3 Pathological observation of ankle joint of rats in each group (HE, × 100)

3.5 網絡藥理學分析

通過 TCMSP 數據庫、CTD 數據庫和PharmMapper 數據庫等預測和檢索得到39 個化合物的627 個相關靶點。從OMIM 數據庫、TTD 數據庫、DisGeNet 數據庫和GeneCards 數據庫得到RA疾病靶點3368 個，將化合物靶點與疾病靶點取交集，得到交集371 個共同靶點（圖4-A、B）。

圖4 痹祺膠囊治療RA 的靶點分析Fig.4 Targets analysis of Biqi Capsule in treatment of RA

將371 個共同靶點投放至STRING 10 數據庫中獲得PPI，然后利用Cytoscape 軟件構建PPI 網絡圖并對網絡進行分析，結果（圖4-C）顯示，IL-6、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、白蛋白（serum albumin，ALB、蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、TNF、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、STAT3、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、MAPK8、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，CASP3）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP9）、趨化因子配體8（chemokine ligand 8，CXCL8）、JUN、MAPK1 等靶點蛋白擁有較多相互作用關系，位于PPI 蛋白網絡中心，這些蛋白涉及氧化應激、炎癥反應、免疫調節、血管生成、活血、鎮痛、滑膜增生等方面，提示痹祺膠囊抗炎、鎮痛、免疫調節等作用與這些蛋白有關。進一步了解PPI 網絡的生物作用，使用Cytoscape 的MCODE 插件對網絡進行Cluster 模塊分析，共獲得2 個Cluster 模塊（圖4-C）。對2 個模塊分別進行基因本體（gene ontology，GO）功能和KEGG 通路富集分析，發現Cluster 1主要與免疫調控、炎癥反應、凝血級聯、血小板激活等生物過程有關；Cluster 2 主要與血管生成、中樞及外周疼痛、血小板激活等生物過程相關。

利用OmicsBean 分析軟件對相關靶點蛋白進行功能注釋分析，選取P值最小的前10 個進行作圖呈現（圖4-D）。結果發現，這些蛋白在CC 方面主要參與細胞囊泡、細胞器內腔形成、細胞內膜系統等過程；在MF 方面主要參與蛋白結合綁定、受體結合、酶結合、細胞功能調控等過程；在BP 方面主要涉及有機物或含氧化合物的應激反應、對化學刺激的細胞應答、對內源性刺激的反應等過程。

在STRING 10 數據庫中得到229 條相關通路，取false discovery rate＜0.01 的通路并篩出無關的通路后共146 條，隨后對這146 條通路進行KEGG 通路分析及相關文獻查閱，得到80 條相關信號通路，并對前20 的通路進行可視化處理（圖4-E），分析富集的通路發現，主要涉及與炎癥反應相關的通路，如IL-17 信號通路、TNF-α 信號通路、NOD 樣受體信號通路等；與免疫應答相關的通路，如T 細胞受體信號通路、輔助性T 細胞1（helper T cell，Th1）和Th2 細胞分化等；與凋亡相關的通路，如FoxO信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-Akt 信號通路等；與活血相關的通路，如血小板活化、黏著斑、VEGF 信號通路、補體和凝血級聯等；與疼痛相關的信號通路，如瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道的炎癥介質調節、Wnt 信號通路、環磷酸腺苷信號通路、多巴胺能神經突觸等。

根據對應關系在Cytoscape 3.6.0 軟件中，構建痹祺膠囊“藥材-化合物-靶點-通路-疾病”的網絡關系圖，黃色代表藥材，綠色代表化合物，紫色代表靶點，藍色代表通路，紅色代表疾病（圖5）。采用軟件的插件進一步分析發現，網絡平均度值為11.4，其中大于度值中位數的化合物有13 個，分別為三七皂苷R1、丹參酮IIA、異甘草素、咖啡酸、迷迭香酸、阿魏酸、人參皂苷Rg1、丹參酮I、丹酚酸B、士的寧、隱丹參酮等；靶點有58 個，主要有MAPK1、MAPK3、AKT1、磷脂酰肌醇3 激酶調節亞基（ phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit alpha，PIK3R1）、MAPK8、MAPK10、TNF、JUN、IL1B、核因子-κB抑制劑α（nuclear factor-κB inhibitor α，NFKBIA）、糖原合成酶激酶3β（glycose sythase kinase 3β，GSK3B）、前列腺素 G/H 合成酶 2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）、EGFR、一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）等；通路有54 個，主要有TNF 信號通路、IL-17 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Toll 樣受體信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、NOD 樣受體信號通路、Th17 細胞分化、MAPK 信號通路、FoxO 信號通路等。網絡中既存在1 個分子與多個靶點蛋白的相互作用，也存在不同分子作用于同1個靶點蛋白的現象，顯示出痹祺膠囊治療RA 具有多靶點的作用特點，而多靶點的物質基礎在于痹祺膠囊中含有的特征成分，可能通過抗炎、免疫調節、抗血管生成等多種途徑發揮治療RA 作用。

4 討論

RA 作為一種慢性自身免疫性疾病，全世界約有1%～2%的人口受困于RA，選擇理想的動物模型對于評價藥效至關重要，CIA 動物模型始于1977年，此動物模型在臨床表現和病理機制上與人RA在臨床表現、病理、免疫上十分相似，是研究RA 機制和治療較為理想的動物模型，本研究采用II 型膠原誘導關節炎模型，在體征上表現出多關節腫脹等現象，病理上表現出明顯的大量炎性細胞浸潤、滑膜增生和軟骨破壞等，而痹祺膠囊可明顯改善RA大鼠足趾腫脹并降低關節炎評分。從HE 染色結果可見痹祺膠囊可顯著改善CIA 大鼠的關節損傷，表現為關節軟骨破壞減輕，關節腔內壞死組織減少，軟骨細胞增生或壞死減少，滑膜結締組織增生減少，炎性細胞浸潤情況也顯著降低。

RA 病理生理學較為復雜，其發病機制被認為始于血液中的免疫復合物，即關節前階段，在這個階段會產生針對自身組織成分的自身抗體，同時與自體抗原進入關節，此為過渡階段。抗體抗原結合至前哨細胞上的Fc 受體γ，先天免疫反應被激活，T 細胞被分化和增殖為Th 細胞和調節性T 細胞（regulatory T cell，Treg），Th 細胞通過漿細胞激活B 細胞產生RF 等抗體，從而通過不同途徑破壞骨、軟骨和滑膜[4]。本研究表明RA 大鼠血清中RF 水平顯著增加，而痹祺膠囊呈劑量相關性降低血清中RF水平，表明痹祺膠囊可以延緩因RF 的大量產生導致對骨、軟骨和滑膜的損傷。

RA 特征主要是炎癥細胞向滑膜關節浸潤增多，最終導致軟骨和骨骼損傷，而滑膜巨噬細胞與RA 嚴重程度密切相關。活化的巨噬細胞產生促炎細胞因子和趨化因子，如IFN-γ、TNF-α 等推動RA的進展[12]。巨噬細胞、樹突狀細胞等的激活依賴遷移至關節中活化的T 細胞，其中Th1 和Th17 細胞亞群是炎癥滑膜組織中發現的主要細胞類型。Th1細胞在滑膜關節中促進促炎細胞因子如TNF-α、IL-6 等釋放，繼而誘導Th17 細胞活化，分泌IL-17 促進骨吸收，導致關節病變[13-14]。研究發現，痹祺膠囊在臨床實踐和動物實驗（佐劑型關節炎及CIA等）中可調節T 淋巴細胞亞群Th/Ts 之間的平衡，下調IL-1 和TNF-α 水平，顯示抗炎、鎮痛、免疫調節等藥效作用[15]。本研究表明，痹祺膠囊可顯著降低CIA大鼠血清中IL-17、TNF-α、IL-1β 和IFN-γ 水平。Treg 通過分泌IL-10、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、IL-35 等細胞因子參與免疫負性調節。研究發現，IL-10 可通過多種途徑參與免疫負性調節，如抑制T 細胞向Th 細胞轉化并抑制Th 細胞分泌細胞因子，另外IL-10 可抑制B 細胞活化，抑制骨化三醇介導的免疫球蛋白 E（immunoglobulin E，IgE）表達[16]。研究發現，RA患者Treg 細胞百分比及其生成IL-10 的含量較正常人低[17-18]。本研究表明，痹祺膠囊可升高IL-10 的水平，綜合以上結果提示痹祺膠囊顯示出較好的抗炎和免疫調節作用。

RA 中因特異性自身抗原的持續存在，持續的免疫細胞激活導致關節中一種自我永存的慢性炎癥狀態和滑膜腫脹，被識別為疼痛和關節腫脹[19]。研究發現，滑膜成纖維細胞（ fibroblast-like synoviocytes，FLS）產生TNF-α，通過p38/JNK MAPK 通路造成活性氧（reactive oxygen species，ROS）蓄積，而ROS 經NF-κB 反饋形成ROS/TNFα 正反饋，促進關節破壞，傷害感受器致敏[20]。同時在TNF-α、IL-17 等細胞因子的存在下，NF-κB 信號通路、JAK-STAT 信號通路的激活可導致T 細胞活化，進一步介導炎癥反應，還可誘導RA-FLS 異常增殖，激發破骨細胞分泌RANKL，誘導破骨細胞的增殖與活化，導致關節的畸形與骨侵蝕[21]，而此過程可被Wnt 信號通路阻斷[22]。此外，IL-17A 還可促進滑膜細胞產生MMP1，導致軟骨破壞，還可促進內皮細胞分泌MMPs，促進FLS 產生VEGF、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）[23]，從而促進滑膜組織內血管增生，滑膜不規則增厚，并伸向關節腔和軟骨邊緣部擴展導致血管翳形成[24]。此外，RA 患者中，在各種細胞活化和凋亡過程中釋放的細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）水平升高，可能與體內凝血激活有關[25]。血小板激活因子（platelet activating factor，PAF）是目前最強的脂質介質，又是強效的炎癥介質，PAF 在RA 中與滑膜炎、組織破壞及血管新生密切相關，并且能夠誘導血小板聚集，與RA 患者存在血液學異常關系密切[26]。而抑制纖凝、促進纖溶，糾正RA 凝血異常，能阻止滑膜炎癥的進展，進而阻止骨質破壞[27]。

本研究的靶點預測及作用通路分析結果提示，痹祺膠囊中黨參炔苷、黨參苷I、黨參苷II、土莫酸、茯苓素、蒼術酮、白術內酯I、白術內酯II 等成分可作用于IL-10、IL-4、IL-2、酪氨酸受體激酶Lck（tyrosine-protein kinase Lck，LCK）、熱休克蛋白A5（heat shock protein A5，HSPA5）、MAPK1、MAPK9、MAPK14、Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、髓性分化原發反應蛋白88（myeloid differentiation primary response protein MyD88，MYD88）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、CASP3、骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）等靶點，通過Toll 樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、Wnt 信號通路、MAPK 信號通路等發揮免疫調節、成骨/破骨細胞平衡等的作用；咖啡酸、迷迭香酸、丹參酮I、丹參酮IIA、三七皂苷R1、異甘草素、奎寧酸、蒼術酮、丹參新酮、三七皂苷CK 等作用于神經源性位點Notch 同源蛋白1（neurogenic locus notch homolog protein 1，NOTCH1）、纖連蛋白（fibronectin，FN1）、凝血酶（thrombin，F2）、連接黏附分子A（Junctional adhesion molecule A，F11R）、VEGFA、NOS3、ALB、細胞間黏附分子1（Intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）等靶點，參與調節JAK-STAT、Ca2+、VEGF通路、Ras 通路、FoxO 通路、缺氧誘導因子-1 信號通路等信號通路過程，抑制白細胞與內皮細胞黏附、降解纖維蛋白、抑制血小板聚集，維持血液滲透壓，抑制血栓形成和血管翳形成；士的寧、馬錢子堿、番木鱉苷酸、咖啡酸、奎寧酸、甘草苷、異甘草素、甘草次酸、迷迭香酸、阿魏酸、洋川芎內酯A、黨參苷II、丹參酮IIA、人參皂苷Rg1等作用于PTGS2、谷胱甘肽S 轉移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）、TNF、IL1B、CXCL8、NOS2、血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM1）、μ-阿片受體δ1（Delta-type opioid receptor，OPRD1）、OPRM1 等蛋白靶點，通過NF-κB 信號通路、花生四烯酸代謝、C 型凝集素受體信號通路、5-羥色胺突觸、神經活性配體-受體相互作用、環磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）-蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）信號通路等通路，抑制白細胞-內皮細胞黏附及TNF-α、IL-1β 等炎癥因子釋放和前列腺素的生成以及拮抗前列腺素受體、外周痛覺神經元的刺激或抑制中樞神經興奮和5-羥色胺釋放等發揮外周和中樞鎮痛作用。

痹祺膠囊由馬錢子、黨參、白術、丹參、茯苓、牛膝、地龍、川芎、三七和甘草10 味藥材組成，現代藥理學研究顯示，黨參多糖可通過影響TLR4 信號通路激活CD4+T 細胞，觸發Th2 轉化為Th1[28]，從而維持Th1/Th2 細胞、Tregs/Th17、IL-10/TNF-α及IL-10/IL-1β 的免疫穩態[29]。黨參醇提物可促進造血干（祖）細胞CD34+、CD3+、CD19+及CD71+分子的表達，抑制CD45+、CD14+分子的表達，使其處于分化早期階段，維持造血干（祖）細胞的干性，其物質基礎主要為黨參炔苷和黨參苷I[30]。丹參中丹參酮IIA、丹參素和丹酚酸A 可通過抑制血小板蛋白質二硫鍵異構酶ERp57 和整合素αIIbβ3 的相互作用，降低凝血因子7 的活性，增加血小板中環磷酸腺苷的含量，降低血液黏度，還可激活纖溶酶原-纖溶酶系統，促使纖維蛋白溶解，但同時保持血細胞正常狀態等途徑發揮活血化瘀作用[31-33]。三七中皂苷類成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1等通過增加內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的磷酸化，激活PI3K/Akt/eNOS途徑增加內源性一氧化氮的釋放，發揮血管舒張作用[34-35]。地龍中蚓激酶、纖溶酶類成分可直接降解纖維蛋白原與纖維蛋白，活化纖溶酶原、促進組織型纖溶酶原激活物（tissue-type plasminogenactivator，t-PA）等纖溶激活因子的釋放，抑制凝血途徑，促進凝血因子的水解，防止血小板發生聚集[36]。馬錢子堿能抑制外周炎癥組織前列腺素E2、5-羥色胺、6-酮-前列腺素Fla 與血栓烷素等炎癥介質的釋放，并可降低感覺神經末梢對痛覺敏感性，并通過抑制鈣激活鉀離子通道抑制背根神經節神經元的興奮性，增加腦內神經遞質-腦啡肽含量發揮抗炎、鎮痛作用[37-39]。

綜上，本研究通過CIA 動物模型及網絡藥理學手段綜合分析了痹祺膠囊的藥效作用和可能的作用機制，表明痹祺膠囊可能通過多種與免疫調控、血管生成、骨形成/侵蝕平衡、凝血、鎮痛等相關通路調控相關活性物質達到治療RA 的效果，并為進一步確定痹祺膠囊中的活性成分、具體作用機制奠定基礎，然而本研究并未對網絡藥理學預測出的靶點及通路進行進一步的驗證，具體單體組分的作用機理和靶效應也需進一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突