4 種測定苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸的高效液相色譜法的比較研究★

毛國任，張 明，李躍海，董莉娟，吳明珠，李 應

（1.化工污染防治重慶市高等職業技術院校應用技術推廣中心，重慶 401120；2.北大醫藥股份有限公司安全環保部，重慶 400000）

高效液相色譜儀（HPLC），是利用色譜原理分析高沸點難揮發、受熱不穩定、大分子量有機物的儀器[1]。具有分析速度快、重復性好、分辨率高、靈敏度高、精密度高等優點。利用高效液相色譜法可測定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的含量[2]，以及水中的萘酚[3]、藥物中的乙酰谷酰胺[4]等，具有使用范圍廣、重現性好等特點。

苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸是生活中常見的有機物。它們廣泛存在于自然界中，可用于食品、藥品、化妝品、工業原料[5-6]等。在甲苯的（電）催化氧化中，上述三種物質常存在于同一反應體系中，且化學性質相近，難以定量分析，需要建立一種有效的分離分析方法。此外，芳香醛類化合物的坎尼扎羅反應[7]也會生成芳香醇、芳香酸，三種物質在同一體系中也很難分離分析。

本文從準確定性、精確定量的角度出發，采用高效液相色譜法對苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸進行分析。目前，檢測上述三種物質的方法有4 種，其主要區別為流動相的不同[8-9]。通過比較研究發現：流動相為乙腈與甲醇時，分離度較低，無法達到理想結果；流動相為甲醇與水時，只能分出苯甲醛與苯甲酸；流動相為乙腈與水時，只能分離苯甲醇與苯甲醛或苯甲酸與苯甲醛；流動相為乙腈與甲酸（0.02%）溶液時，效果最佳，可以有效地分離分析苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸。最好色譜條件為：流動相，V乙腈∶V0.02%甲酸=40∶60；檢測波長，250 nm；柱溫，35 ℃；流速，1 mL/min；進樣量，10 μL。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

苯甲醇（AR）、苯甲醛（AR）、苯甲酸（AR），成都市科隆化學品有限公司；甲酸（AR），上海麥克林化工股份有限公司；乙腈（AR），上海星可生化有限公司；一級水，自制。

1.2 實驗儀器

日本島津公司SIL-16 型高效液相色譜儀；檢測器：SPD-16;色譜柱：GL Sciences，C18（ODS），5 μm，4.6 mm×250 mm；機械超聲波清洗機；真空泵；抽濾瓶。

1.3 樣品配制

分別取1 mmol 苯甲醇、苯甲醛與苯甲酸置于3 個100 mL 容量瓶中，用流動相定容，制得10 mmol/L 的苯甲醇、苯甲醛與苯甲酸母液。從3 個10 mmol/L 的母液中分別取1 mL 置于10 mL 容量瓶中用流動相定容，制得1 mmol/L 3 種物質的樣品。分別從3 個10 mmol/L 的母液中分別取1 mL 混合于10 mL 容量瓶中用流動相定容制得混合樣。特別注意：配制乙腈與0.02%甲酸流動相時，需要將混合溶液超聲10 min。

1.4 流動相配制

1.4.1 甲醇與水（表1）

表1 甲醇與水的比例

1.4.2 乙腈與水（表2）

表2 乙腈與水的比例

1.4.3 乙腈與甲醇（表3）

表3 乙腈與甲醇的比例

1.4.4 乙腈與0.02%甲酸（表4）

表4 乙腈與甲酸（0.02%）的比例

1.5 實驗方法

色譜條件：檢測波長為250 nm，柱溫為35 ℃，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL。

2 結果與討論

2.1 4 種不同流動相的分離度

2.1.1 甲醇與水作流動相

從表5 中得出，隨著甲醇的比例增大，R1與R2逐漸變大，但R1始終小于1.5。表明此法只適合用于測試含有苯甲酸與苯甲醛的混合物，不適合同時含有苯甲醇、苯甲醛和苯甲酸的混合物。

表5 甲醇與水為流動相時混合樣的分離度

2.1.2 乙腈與水作流動相

從表6 中得出，隨著水的比例減小，R1先變大后變小，R2逐漸變小。當水的比例到40%時R1最大。大部分R 值能大于1.5，但由于水是極性溶液，導致前沿峰出現，不能達到理想分離效果。該法能把苯甲酸或苯甲醇與苯甲醛兩兩分離。表明可用于測試不同時含有芳香酸與芳香醇的混合物中。

表6 乙腈與水為流動相時混合樣的分離度

2.1.3 乙腈與甲醇作流動相

從表7 中得出，甲醇的比例減小，R1和R2無明顯變化，且R 值均小于1.5，可能是因為甲醇的極性小于水的極性，用甲醇作水相時，三種物質更難以分離，不能達到良好的測試效果。

表7 乙腈與甲醇為流動相時混合樣的分離度

2.1.4 乙腈與0.02%甲酸作流動相

從表8 中得出，0.02%甲酸的比例降低，分離效果變差。當V乙腈∶V0.02%甲酸=4∶6 的時候，分離效果最佳。可能是因為，加入弱酸能調節流動相的pH 值來抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，使峰形有所改善，取得了最佳效果，是4 種方法中最好的。該法可用于測試混合物中同時含有芳香醇、芳香醛、芳香酸。最佳實驗結果色譜峰見圖1、表9。

圖1 混合樣的高效液相色譜圖

表8 乙腈與甲酸（0.02%）為流動相時混合樣的分離度

表9 苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸這三種物質的出峰時間

2.2 標準曲線

從圖2-1、圖2-2 得出，苯甲醇與苯甲酸在濃度為1，2.5，5，7.5，10 mmol/L 時，所測的標準曲線具有良好的相關性（R2苯甲醇=0.999 5，R2苯甲酸=0.999 6）。但是苯甲醛的濃度為1，2.5，5，7.5，10 mmol/L 時，所測的標準曲線的相關性差（R2苯甲醛=0.907 3），分析圖2-3，得出可能是由于苯甲醛在流動相的溶解度較低。于是在圖2-3 濃度的基礎上將苯甲醛濃度調為0.1、0.25、0.5、0.75、1 mmol/L，由此得出圖2-4，發現此濃度下所測的標準曲線的相關性良好（R2苯甲醛=0.999 3）。

圖2 標準曲線

3 結論

本文對4 種測定苯甲醛、苯甲酸、苯甲醇的高效液相色譜法進行對比研究，發現當色譜條件為流動相V乙腈∶V0.02%甲酸=4∶6，檢測波長為250nm，柱溫為35℃，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL，的測試效果最佳。苯甲醇濃度為1、2.5、5、7.5、10 mmol/L，苯甲醛濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1 mmol/L，苯甲酸濃度為1、2.5、5、7.5、10 mmol/L 時線性效果最好。